Name: معايرة تعبير حسي كيميائي السطحية من المستقبلات في خلايا غيروي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: تعلم تقنية التلوين الحي للخلايا لاكتشاف مستقبلات كيميائية حاسية على سطح خلايا HEK293T باستخدام المجهر المناعي الضوئي. هذه الطريقة تتيح دراسة المستقبلات المحيطية في الخلايا الحية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن نشكر أعضاء المختبر ماتسونامي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة.

1. الإجراء : الإجراء يتألف من ثلاثة أجزاء على مدى فترة زمنية الانتهاء مجموعه 3 أيام : نقل الخلايا ، وترنسفكأيشن كيمياء سيتولوجية مناعية ، خطوة واحدة نفذت في اليوم الواحد. يجب أن يتم نقل وترنسفكأيشن من الخلايا على مدى اليومين الأولين في ظروف معقمة في غرفة تدفق الصفحي. اليوم 1 : نقل الخلايا HEK293T للمقايسة التعبير السطح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل متوسطة (M10) : ميكس المتوسطة الأساسية الدنيا تستكمل مع 10 ٪ (من حيث الحجم) مصل بقري جنيني في حالة عقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا إلى confluency المطلوب في لوحة الثقافة 100mm ، اعتمادا على عدد من اللوحات المطلوبة لاقامة. من المهم تحديد نسبة الخلايا التي ستنقل إلى تجنب الخلايا متضخمة أو متفرق : على سبيل المثال ، من 100 ٪ متموجة طبق بقطر 100 ملم ، واحدة قد نقل حوالي 3 ٪ إلى 35 مم طبق للحصول على ما يقرب من 30 ٪ في confluency الأخير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل نقل الخلايا ، في غرفة معقمة التدفق الصفحي ، ومعطف X 22 مم الزجاج ينزلق تغطية 22 العقيمة مع يسين مد بولي (1mg / مل) ، ومكان واحد في كل طبق 35 ملم ثقافة الخلية ، حتى الجانب المغلفة لخلايا الطلاء (الشكل 1 ). يسمح الحل لتجف لمدة 5 -- 10 دقائق. خلال هذا الفاصل الزمني ، قد يتم تشغيل مصدر الأشعة فوق البنفسجية في غرفة الصفحي على زلات لتعقيم الغطاء ، إذا رغبت في ذلك. بولي D يسين يساعد خلايا غيروي التمسك ينزلق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنقل الخلايا ، ونضح من وسائل الاعلام الموجودة في الطبق 100mm ، وغسل بعناية بإضافة 8 مل العقيمة برنامج تلفزيوني ، ونضح برنامج تلفزيوني يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام 3 مل 0.05 ٪ التربسين - EDTA ، وعندما تنفصل الخلايا من الطبق ، ومنع المزيد من رد الفعل الأنزيمية التي إضافة 5 مل M10. متمزج الخلايا وحجم اللازمة لنقل أنبوب مخروطي العقيمة ؛ الطرد المركزي في 200G لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. نضح من طاف تحتوي التربسين - EDTA ، وترك بيليه خلايا سليمة. لنقل الخلايا إلى أطباق 35 ملم ، إضافة 1 مل M10 لكل طبق ويسحن على فصل الخلايا. إضافة 1 مل من معلق الخلايا إلى كل طبق. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. معطف 22 X 22 مم زجاج coverslips مع مد بولي يسين ومكان واحد حتى في الجانب مغلفة كل طبق 35 مم. </li></ol> يوم 2 : ترنسفكأيشن HEK293T من الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 18-24 بعد ساعات من نقل ، وخلايا جاهزة للترنسفكأيشن للمستقبلات أن يعاير. استخدام مستقبلات RTP1S والثدييات المستنسخة في التعبير ناقلات PCI ، الذي أعد من الثقافات البكتيرية باستخدام بروتوكول Qiagen كيت Miniprep التالية صفها قبل 4. استخدام المستقبلات التي N عضال الموسومة ب 20 حامض أميني حاتمة رودوبسين طويلة لتسهيل immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1000ng من بناء مستقبل ، 250 نانوغرام للبناء و 50 نانوغرام RTP1S من البروتين لكل ترنسفكأيشن مضان أخضر. أداء ترنسفكأيشن باستخدام Lipofectamine 2000 ، وفقا للمصنعين اليدوي. </li></ol> يوم 3 : كيمياء سيتولوجية مناعية لتصور مستقبلات الخلايا السطحية الملون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء ، وإعداد وغسيل تلطيخ الحلول وتبريدها إلى درجة مئوية 4 تلطيخ المتوسطة : متوسطة الأساسية الدنيا ، و 45 مل ؛ مصل بقري جنيني ، 5 مل ؛ HEPES (1M) ، 500 ميكرولتر (تركيز النهائي 10MM) ؛ أزيد الصوديوم (1.5M) ، و 500 ميكرولتر (تركيز النهائي 15mM). غسل الحل : HBSS ، 500 مل ؛ HEPES (1M) ، و 5 مل (تركيز النهائي 10MM) ؛ أزيد الصوديوم (1.5M) ، و 5 مل (تركيز النهائي 15mM). قد يتم تخزين كل من الحلول في 4 درجات مئوية لإعادة استخدامها. إعداد الحلول الضد بواسطة تمييع الأضداد المطلوبة في تلطيخ 100 أضعاف المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء كيمياء مناعية لتلطيخ السطح لمستقبلات الرائحة حوالي 24 ترنسفكأيشن آخر ساعة. لأداء الخلية الحية تلوين ، مجموعة تجريبية تصل يجب أن يتم تبريده الى 4 درجات مئوية : تعبئة كبيرة الواردة مع الثلج وبات على سطح الجليد لجعله حتى وقت ممكن ، وضع علبة على الجليد ورذاذ مع 70 ٪ الايثانول. قطع قطعة من parafilm (أصغر من طول الدرج) ، ويضعوا على علبة رش الايثانول ، للحصول على سطح أملس. نقل الغطاء الزجاجي قسائم تحتوي على خلايا transfected على parafilm ، واحد في وقت واحد ، حتى الجانب الخلية ، وذلك باستخدام الملقط. طبقة تغطي كل زلة مع 100 ميكرولتر الباردة حل تلطيخ الابتدائي ، البثق بعناية من ركلة ركنية من زلة (الشكل 2). بعد كل طبقات الغلاف مع زلات حل الأضداد ، وغطاء علبة لمنع تجفيف من الحل في الهواء. تنفيذ الحضانة الأولية عن 45-60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة الابتدائية ، ونقل بسرعة الى تغطية زلات الأطباق 35mm الثقافة الأصلية ، والتي تحتوي على وسائل الإعلام. نضح في وسائل الإعلام وإضافة 2 مل من محلول الغسيل المبردة برفق من على حافة الطبق لمنع فقدان الخلايا من انزلاق الغطاء. نضح الحل يغسل وكرر مرتين لبإنجاز ثلاث يغسل. في نهاية غسل ثالث ، لا نضح الحل تغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الثانوية soluti الأضدادفي وسائل الإعلام ونقل تلطيخ ينزلق الغطاء عن حل لغسل طبقة parafilm اضافته حديثا في علبة واحدة. مرة أخرى برفق قذف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لطبقة تغطي كل زلة ، من الزاوية مثل الحضانة الأولية. تنفيذ حضانة الثانوية لمدة 30 -- 45 دقيقة ، ونقل مرة أخرى إلى حل غسل الأطباق الأصلي في 35 ملم. مرة أخرى ، وغسل غطاء ينزلق ثلاث مرات كما هو موضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح يغسل من يغسل حل الماضي وإضافة 2 مل بارافورمالدهيد مبردة 1 ٪. إصلاح الخلايا في حل المبردة بارافورمالدهيد 1 ٪ ، على الثلج لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل زلات تغطية على الزجاج النظيف الشرائح باستخدام المجهر تصاعد Mowiol الكاشف ، مع الجانب الخلية أسفل بحذر واستبعاد جميع فقاعات الهواء (الشكل 3). يجف الهواء Mowiol مرة واحدة ، وغسل غطاء ينزلق بلطف عن طريق إضافة الماء المقطر على السطح والشفط على الفور. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. طبقة ساترة مع 100 لكل ميكرولتر الباردة حل تلطيخ الابتدائي. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. جبل coverslips مع الجانب الخناق على الخلية ميكروسكوب نظيفة الشرائح باستخدام كاشف Mowiol المتزايدة. </li></ol> 2. ممثل النتائج : يعيش تلوين الخلية تمكن المرء من رؤية البروتينات الموجودة على سطح الخلايا ، على ترنسفكأيشن مع مرافقين من المستقبلات (في هذه الحالة مستقبلات الرائحة Olfr62 ، مع مستقبلات البروتين RTP1S نقل) (الشكل 4). وتتميز الخلايا السطحية للتلوين بواسطة مستقبلات نمط من تلطيخ المنقط (الشكل 4B ، أقحم). نفذت بشكل غير لائق من تلطيخ قد يؤدي إلى ارتفاع الضوضاء ، مما يجعل من الصعب على المراقب أن يميز تلطيخ السطح الحقيقي من الضوضاء. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="الشكل 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. ترنسفكأيشن من المستقبلات مع مرافقين يسمح التصور من البروتينات على سطح الخلايا الحية باستخدام تلوين الخلية. ترنسفكأيشن من مستقبلات الرائحة وحدها Olfr62 (A) وترنسفكأيشن من Olfr62 مع كوصي RTP1S (B). مستويات التعبير GFP بمثابة تحكم ترنسفكأيشن (A 'وباء').

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يجب أن تتم كل خطوة بعناية لضمان بارزة ومميزة تلطيخ السطح. يجب أن تتم العملية بأكملها في تلطيخ الباردة (على الجليد) ، ويجب تبريد الدرج الذي وضعت غطاء ينزلق قبل استخدامها لضمان بقاء الخلايا على قيد الحياة. وعلاوة على ذلك يتم تثبيت في نهاية السطح عملية التلوين. هذا في تناقض حاد مع تلوين الداخلية حيث تسبق التثبيت لتلطيخ permeabilize غشاء الخلية إلى أجسام الابتدائية والثانوية. يجب التقليل من وقت التعرض للزلات لتغطية الجوية لمنع الخلايا من تجفيف ؛ طبقات بالتالي ينزلق الغطاء مع حلول الأض...

<table><tbody><tr><td>غطاء شريحة 22 X 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>مصل بقري جنيني</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>وسط أساسي أدنى</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>مع L glutamate، وملح Earle&amp;rsquo;s وبيكربونات</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>محلول هانكس الملح المتوازن (HBSS) 1X </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td>مع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم</td></tr><tr><td>محلول منظم HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>بدون كالسيوم ومغنيسيوم</td></tr><tr><td>هيدروبروميد Poly D Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>طبق زراعة أنسجة 35 X 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td>0.05%</td></tr></tbody></table>

معايرة تعبير حسي كيميائي السطحية من المستقبلات في خلايا غيروي

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

ومن المعترف به في العالم حيا على الروائح من شعور الشم. وتوسط في الفئران عن طريق الشم ذخيرة من حوالي 1200 غرام بروتين المستقبلات اقترن (GPCRs) 1 التي افترض لربط جزيئات الرائحة المتطايرة وتحويل الإشارة إلى إشارة خارج الخلية داخل الخلايا بواسطة اقتران مع G Gαolf البروتين. الملزم للodorants إلى المستقبلات ويعتقد اتباع القاعدة اندماجي ، وهذا هو واحد قد ربط مستقبلات الرائحة واحد عدة مستقبلات قد ربط odorants عدة بدرجات متفاوتة 2. وقد الكيمياء الحيوية ، ويشير الى والدراسات ملزم يجند قامت بها مريح بالنسبة لمعظم GPCRs باستخدام الخلايا مغاير. ويمنع استخدام الخلايا لكن غيري لدراسة مستقبلات الرائحة ، لفترة طويلة منذ ذلك الحين على ترنسفكأيشن فشلوا في تصديرها إلى السطح. وقد أثبتت سايتو وآخرون واحد تمرير مستقبلات الغشاء نقل البروتين (RTP) المحرمين الأسرة اظهار التعبير المعززة في الخلايا العصبية الحسية الشمية ويكون بمثابة مرافقين لمستقبلات الرائحة الحركة على السطح في الخلايا مغاير ، عندما شاركت transfected معا 3. لتنفيذ فحوصات البيوكيميائية لمستقبلات باستخدام الخلايا مغاير ، يجب على المرء أولا تحديد إذا كانت قوية التعبير مستقبلات يظهر على سطح الأرض في خط الخلية. يمكن أن يعاير هذا عن طريق المستقبلات مع RTP1S كوصي تليها الخلية الحية تلطيخ لتسمية fluorescently المجال خارج الخلية أو علامة A في المجال حصرا overexpressing خارج الخلية. نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول لتنفيذ يعيش تلطيخ الخلايا التي يمكن استخدامها لاكتشاف مستقبلات الرائحة على سطح الخلايا HEK293T مريح. بالإضافة ، يمكن أيضا استخدامه لفحص للتعبير عن سطح حسي كيميائي أخرى أو مستقبلات GPCRs.

نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول لتنفيذ يعيش تلطيخ الخلايا التي يمكن استخدامها لاكتشاف مستقبلات الرائحة على سطح الخلايا HEK293T مريح. بالإضافة ، يمكن أيضا استخدامه لفحص للتعبير عن سطح حسي كيميائي أخرى أو مستقبلات GPCRs.

يتم إدراك عالم الروائح النابض بالحياة من خلال حاسة الشم. وتتم عملية الشم في الفئران عن طريق مجموعة من المستقبلات المقترنة بالبروتين G يبلغ عددها حوالي 1200 مستقبل...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية الكشف عن التعبير السطحي لمستقبلات الاستشعار الكيميائية باستخدام صبغ الخلايا الحية في خلايا HEK 2 93 T، ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت الخلايا على شرائح تغطية مطلية بـ poly D lycine في أطباق زراعة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ترنسفكشن الـ DNA في خلايا HEK 2 93 T. أما الخطوة الثالثة من الإجراء فهي إجراء صبغ الخلايا الحية باستخدام أجسام مضادة أولية وأجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ fluoro four.تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تثبيت الخلايا المصبوغة وتركيب شرائح التغطية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح تموضع المستقبلات على سطح الخلايا من خلال مجهر الفلورة المناعية. تمكننا هذه الطريقة من الكشف عن المستقبلات الحسية الكيميائية المصدرة إلى سطح الخلايا في الخلايا غير المتجانسة مثل HK 2 93 T. سيوضح العرض المرئي لهذه الطريقة الخطوات الرئيسية التي يجب اتباعها بدقة للحفاظ على حيوية الخلايا من أجل الصبغ الذاتي للخلايا.قد يجد الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة أن خطوات مثل نقل غطاء الشريحة والتعامل معه وتثبيته صعبة. ومع ذلك، تصبح التقنية سهلة مع القليل من الممارسة. وباستخدام بروتوكول معدل يعتمد على عمود cgen، يتم تنقية DNA البلازما للمستقبل والمستقبل. إن نقل البروتين RT TP one s المستنسخ في ناقل تعبير million PCI يضمن أنه بالنسبة للتلوين المناعي، يتم وسم المستقبل المطلي طرفياً بـ epitope يتكون من سلسلة من 20 حمضاً أمينياً لتسهيل التصاق الخلايا.قم بطلاء شرائح غطاء الزجاج بتركيز 1 mg/mL من البولي لايسين (poly lysine)، ثم ضع شرائح الغطاء في أطباق زراعة خلايا بقطر 35 mm بحيث يكون الجانب المطلي متجهاً للأعلى لتجف في الهواء داخل غرفة التدفق الصفائحي المعقمة. قم بزراعة خلايا HTK 2 9 3 T بكثافة تصل إلى 30% تقريباً في 1 mL من وسط M 10، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة بين شريحة الغطاء وطبق زراعة الخلايا. تُحضن الخلايا عند 37 °C و5% carbon dioxide لمدة تتراوح من 18 إلى 24 ساعة. ولكل عملية ترنسفكشن (transfection)، قم بتحضير خليط DNA يتكون من 1000 ng من بنية المستقبل (receptor construct)، و250 ng من بنية RTP 1 s، و50 ng من بنية GFP.وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، يتم ترنسفكشن الخلايا باستخدام lipectomy 2000. يتم تحضير وسط التلوين عن طريق إضافة sodium azide وhippies إلى M 10. ويمكن تخزين هذا الوسط في درجة حرارة 4 °C لعدة أشهر.بعد ذلك، قم بتحضير محلول الغسيل المكون من 15 millimolar من أزيد الصوديوم و10 millimolar من HEPES. يمكن تخزين محلول الغسيل في محلول HBSS البارد عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لعدة أشهر. ولإجراء عملية الصبغ في الخط البارد، ضع الصينية مع المحلول على الثلج لمدة خمس دقائق.مع توجيه الجانب الذي يحتوي على الخلايا للأعلى، انقل شرائح الغطاء الزجاجية التي تحتوي على الخلايا المنقولة جينيًا إلى وعاء البارافورم من زاوية شريحة الغطاء. أضف بعناية 100 µL من الجسم المضاد الأولي البارد والمخفف في وسط التلوين. قم بالتحضين لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن، اغسل الخلايا في أطباق الزرع الأصلية ذات قطر 35 millimeter عن طريق إضافة وسحب محلول الغسيل البارد بالتناوب.كرر العملية مرتين. وبالمثل، قم بتحضين الأجسام المضادة الثانوية المقترنة SI three لمدة 30 دقيقة. قم بإجراء عمليات الغسل ثلاث مرات في أطباق بقطر 35 مليمتر.أخيراً، قم بتثبيت الخلايا باستخدام محلول Paraform aldehyde بتركيز 1% مبرد، مع الحرص على استبعاد جميع فقاعات الهواء. قم بتثبيت أغطية الشرائح بحيث يكون جانب الخلايا متجهاً للأسفل على شرائح المجهر باستخدام mole، واشطف سطح أغطية الشرائح بالماء المقطر لإزالة الرواسب الملحية.عادةً، وكما هو الحال مع OL FFR 62 و RTPs، يتميز صبغ مستقبلات سطح الخلية بظهور إشارة فلورية منقطة ناتجة عن الجسم المضاد المقترن. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لصبغ ما بين 32 و 40 شريحة غطاء في غضون ساعتين ونصف إلى ثلاث ساعات فقط. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء باستخدام شرائح غطاء متعددة، من المهم نقل وبدء تحضين الجسم المضاد شريحة تلو الأخرى لمنع جفاف الخلايا.

assaying-surface-expression-chemosensory-receptors-heterologous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

المصدر: de March, C. A. et. al., المراقبة في الوقت الفعلي في المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بواسطة رائحة في مرحلة البخار. J. Vis. Exp. (2019) يوضح هذا الفيديو طريقة مراقبة التنشيط في الوقت الفعلي لمستقبلات الرائحة في خلايا الثدييات المؤتلفة باستخدام قياس اللمعان. يؤدي ارتباط الرائحة إلى تنشيط بروتين G وإنتاج cAMP ، مما يؤدي إلى تنشيط بروتينات glosensor التي تنبعث منها تلألؤ عند ربط الركيزة ، مما يوفر مقياسا كميا لاستجابة المستقبلات.

المراقبة في الوقت الحقيقي لتنشيط مستقبلات الرائحة في الخلايا المؤتلفة

تنشيط دائم لG-البروتين يقترن مستقبلات نتائج المثبطة في توعية أدينيليل محلقة الإشارة. لتحديد المسارات الجزيئية الأساسية، ونهج nonbiased ضرورية، ولكن هذا يتطلب استراتيجية تطوير خلية مقرها قابلة المخيم توعية الفحص. هنا، نحن تصف مقايسة لتوعية جزيء صغير وسيرنا الفرز.

المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص

حاسة الشم أنماط تنشيط مستقبلات ترميز الهوية رائحة، ولكن عدم وجود بيانات نشرت تحديد بروابط الرائحة لمستقبلات الشمية الثدييات يعيق تطوير نموذج شامل للرائحة الترميز. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتسهيل التعرف الإنتاجية العالية من مستقبلات الشمية بروابط النوعي والكمي لتنشيط مستقبلات.

تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر

وصف وظيفة مستقبلات الرائحة يخدم جزءا لا غنى عنه في عملية ديورفانيزيشن. يصف لنا طريقة لقياس تنشيط مستقبلات الرائحة في الوقت الحقيقي باستخدام مقايسة مخيم.

خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي

يرد مقايسة fluorescence سهلة لتقييم كفاءة أزواج الأمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز/الحمض الريبي النووي النقال دمج البروتينات في خلايا الثدييات غير المقبول-الأحماض الأمينية (ncAAs). ويرد وصف تطبيق ncAAs لدراسة مستقبلات مقترنة بالبروتين G (جبكرس)، بما في ذلك رسم الخرائط crosslinking صور لربط المواقع ووسم هذه العملية بيورثوجونال على الخلايا الحية.

تحسين إدماج الجينية الكيميائية تحقيقات في جبكرس لرسم خرائط الصور-crosslinking والكيمياء بيورثوجونال في خلايا الثدييات الحية

فسيولوجيا، يتم تنشيط مستقبلات الرائحة من جزيئات الرائحة المستنشقة في مرحلة البخار. ومع ذلك، استخدام معظم النظم في المختبر التحفيز الرائحة الطور السائل. نقدم هنا، أسلوب الذي يسمح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة عند التحفيز الرائحة في مرحلة البخار.

في الوقت الحقيقي رصد المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة في مرحلة البخار

تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات الغلوتامات (GluR) الاتجار في الثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة. باستخدام نهج تغذية الأجسام المضادة لتسمية مستقبلات ذاتية أو مبالغ فيها في تركيبة مع النهج الدوائية، وهذا الأسلوب يسمح لتحديد الآليات الجزيئية التي تنظم التعبير سطح غلور عن طريق تحوير عمليات الاستيعاب الداخلي أو إعادة التدوير.

نهج تغذية الأجسام المضادة لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات في ثقافات فرس النهر الأولية المنفصلة

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.

قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous

تصف المقالة الطرق والكواشف اللازمة لأداء تفاعل سلسلة التهجين RNA مضان كامل التركيب في الموقع (HCR RNA WM-FISH) للكشف عن رؤى حول الدقة المكانية والخلوية لجينات المستقبلات الحسية الكيميائية في هوائي البعوض والجس الفكي.

التهجين سلسلة تفاعل الحمض النووي الريبي كامل جبل مضان في الموقع تهجين الجينات الحسية الكيميائية في الزوائد الشمية البعوض

يصف هذا البروتوكول التعبير وقياس وحدات مستقبلات الأستيل كولين العصبية باستخدام خط الخلايا الثديية Neuro-2a. تمكن العلامات الفلورية الحساسة للرقم الهيدروجيني والمجهر الكونفوكلي تقييما دقيقا لموقع المستقبلات في غشاء البلازما مقارنة بتلك المعبر عنها في الحجرات داخل الخلايا المحايدة لدرجة الحموضة، مما يسهل دراسة تنقل nAChR والتعديل الدوائي.

تحديد مواقع مستقبلات أستيل كولين النيكوتين العصبية في الغشاء البلازما والخلايا الخلوية باستخدام التصوير الكمي في الخلايا الثديية

تعلم تقنية التلوين الحي للخلايا لاكتشاف مستقبلات كيميائية حاسية على سطح خلايا HEK293T باستخدام المجهر المناعي الضوئي. هذه الطريقة تتيح دراسة المستقبلات المحيطية في الخلايا الحية بدقة عالية.

معايرة تعبير حسي كيميائي السطحية من المستقبلات في خلايا غيروي

استكشف المزيد من الفيديوهات