أسطح Micropatterned لدراسة التفاعلات حمض الهيالورونيك مع خلايا السرطان

يتضمن غزو السرطان وتطوره نمطاً ظاهرياً خلوياً متغيراً، يخضع لتنظيم معقد بواسطة عوامل النمو والسيتوكينات ومكونات المصفوفة خارج الخلوية ضمن البيئة الدقيقة للورم. يعد حمض الهيالورونيك (HA) أحد مكونات المصفوفة خارج الخلوية السدوية المعروفة بتسهيل تطور الورم من خلال تعزيز الغزو والنمو وتولد الأوعية الدموية عبر تفاعل HA مع مستقبله الموجود على سطح الخلية CD44، والذي يحفز أحداث تأشير تعزز نمو الخلايا الورمية وبقاءها وهجرتها، مما يزيد من الانتشار النقائلي؛ ولقد تم إجراء هذه الدراسة لبحث التصاق الخلايا السرطانية وهجرتها ونموها على حمض الهيالورونيك الخارجي.

تُستخدم تقنية الطباعة الضوئية القياسية لتصنيع ختم مطاطي ذو نمط دقيق، والذي يُستخدم لاحقاً لإنشاء مصفوفة منقوشة من جزيئات الأمينوسيلان على ركائز زجاجية. بعد ذلك، يتم إجراء تفاعل كيمياء الكربوديميد لربط HA تساهمياً بالأمينوسيلان ذو النمط الدقيق. وبذلك يتم إنشاء أنماط دقيقة من HA، حيث يمكن بعد ذلك زراعة الخلايا السرطانية على أنماط HA الدقيقة، ومن ثم تصور تفاعلات الخلايا السرطانية مع حمض الهيالورونيك خارجي المنشأ باستخدام المجهر الضوئي، أو تقنيات التصوير عالية الدقة مثل المجهر الإلكتروني الماسح أو المجهر الفلوري المناعي.

يمكن للمنهجية المتبعة لإنشاء أسطح حمض الهيالورونيك (HA) ذات الأنماط الدقيقة الموضحة في هذا الفيديو أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال أبحاث السرطان، مثل زيادة توضيح دور حمض الهيالورونيك الخارجي في تطور السرطان. لتصنيع ختم من البوليميثيل زان أو PDMS بأنماط دقيقة، والذي سيُستخدم لطباعة شرائح زجاجية بمادة ha، ابدأ بالتقاط رقاقة سيليكون جديدة باستخدام الملاقط.

بعد ذلك، فوق حوض المختبر. استخدم زجاجة غسيل لشطف الرقاقة بالإيثانول ثم جففها بتيار من الهواء. أطفئ أضواء الغرفة.

بعد ذلك، استخدم الملقط لنقل الرقاقة إلى جهاز الطلاء الدوراني، واستخدم ماصة نقل لتغطية 80% على الأقل من سطح الرقاقة بمادة SU 2025 المقاومة للضوء السالبة، ثم قم بالطلاء الدوراني لمدة 10 ثوانٍ بسرعة 600 RPM. ثم لمدة 30 ثانية بسرعة 3000 RPM، وانقل الرقاقة المطلية بالمادة المقاومة للضوء إلى لوح تسخين وقم بإجراء خبز لدن عند 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، انزعها من لوح التسخين واتركها لتبرد لمدة دقيقة واحدة.

ضع قناعاً مُصنعاً مسبقاً بالنمط المطلوب فوق الرقاقة المغطاة بمقاوم الضوء، ثم عرضها للأشعة فوق البنفسجية (uv) لمدة 20 ثانية. بعد ذلك، انقل الرقاقة إلى لوح تسخين وقم بإجراء الخبز الصلب عند 110 درجة مئوية لمدة ست دقائق.

قم بتشغيل الأضواء وأخرج الرقاقة من الصفيحة الساخنة. يجب أن تكون الأنماط واضحة في هذه المرحلة باستخدام ماصة نقل. اشطف الرقاقة بعناية باستخدام محلول تحميض المقاوم الضوئي SU eight بعد ثلاث عمليات شطف بمحلول التحميض، ثم اشطفها بالإيثانول.

في حال وجود أي بقايا بيضاء، كرر عملية الشطف باستخدام محلول مُظهر المقاوم الضوئي (photoresist developer solution) أو ببساطة اغمر الرقاقة في محلول المُظهر لمدة دقيقتين ثم اشطفها مرة أخرى باستخدام الإيثانول، واغسلها بالماء وجففها بتيار من الهواء في قارب مصل كبير. اخلط محلول بوليمر PDMS المرن وعامل المعالجة بنسبة وزنية 10 إلى 1؛ بالنسبة للرقاقة الموضحة هنا، فإن 22 جراماً تعد كافية. صب الخليط في أنبوب طرد مركزي وقم بتدويره بسرعة 900 RPM لمدة خمس دقائق.

لإزالة أي فقاعات هوائية، ضع الرقاقة المنقوشة في طبق بتري بحجم مناسب. صب كمية كافية من محلول PDMS فوقها لتغطية الرقاقة بالكامل بسمك يبلغ حوالي ربع بوصة. وفي حال وجود أي فقاعات على سطح الرقاقة، ضعها في مجفف تفريغي حتى تختفي.

يُترك ليجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لتكوين ختم مطاطي مكمل. في حال عدم جفاف PDMS تماماً بعد مرور 12 ساعة، يوضع القرص في فرن عند 60 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة. يُزال PDMS بعناية من فوق القرص.

بعد ذلك، استخدم شفرة لقص الختم إلى الحجم المطلوب. ضع الختم في وعاء زجاجي يحتوي على الإيثانول، ويفضل أن يكون داخل حامل بلاستيكي، ثم قم بعملية السونيكيشن لمدة 15 دقيقة. يمكن استخدام الرقائق عدة مرات لإنشاء أختام إيلاستومرية جديدة لتثبيت ha تساهمياً على الأسطح الزجاجية في رقع محددة.

ابدأ بتنظيف جميع الشرائح التي سيتم استخدامها في منظف بلازما وفقاً للتعليمات الواردة في النص المرفق. وبعد تنظيف الشرائح الزجاجية، استخدم ملقطاً لإخراجها من منظف البلازما. ضع الشرائح في طبق بتري بلاستيكي واتركها جانباً لاستخدامها لاحقاً.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول الأمينو سيلان الذي سيتم وضعه على الشريحة الزجاجية لربط HA في أنبوب طرد مركزي من البوليسترين سعة 15 ملليلتر. قم بتحضير محلول طازج بتركيز 3% حجم/حجم من ثلاثي أمينو بروبيل تريميثوكسي سيلان أو A-P-T-M-S في إيثانول بتركيز 95% حجم/حجم، بحيث يكون الحجم الإجمالي خمسة ملليلترات، واترك المحلول ليتفاعل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

خلال هذه الفترة، يتحول A-P-T-M-S عن طريق التحلل المائي إلى سيول. بعد ذلك، وبمسك الجوانب فقط، ضع ختم PDMS بحيث يكون النمط للأعلى على قرص جهاز الطلاء الدوراني. استخدم ماصة نقل لتغطية سطح النمط بـ A-P-T-M-S.

بعد ذلك، قم بطلاء سطح الختم بطريقة الطلاء الدوراني باستخدام A-P-T-M-S بسرعة 3,500 RPM لمدة 30 ثانية. بعد إزالة ختم PDMS من جهاز الطلاء الدوراني، اقلبه بحيث يكون جانب النمط مواجهاً للأسفل، ثم ضع أحد طرفي ختم PDMS في مركز الشريحة الزجاجية واضغط برفق لضمان تلامس الختم بالكامل مع الشريحة الزجاجية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بإزالة ختم PDMS برفق واترك الشريحة الزجاجية المنقوشة بـ A-P-T-M-S في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور 30 دقيقة، اغسل سطح النمط باستخدام الإيثانول وجففه بتيار من الهواء. قم بمعالجة ختم PDMS بجهاز السونيكات لمدة 15 دقيقة لإزالة أي فائض من A-P-T-M-S. ثم ضع الشرائح على لوح تسخين لمدة ساعة واحدة عند 115 درجة مئوية لتسخين الأسطح وإزالة المياه الزائدة.

اشطف بالاتانول وجفف بالهواء باستخدام الملاقط. انقل شريحة النمط إلى طبق بتري زجاجي. استخدم ماصة نقل لتغطية الشريحة الزجاجية بالكامل بمحلول polyethylene glycol أو محلول peg cline المحضر حديثاً، والذي سيعمل كمنطقة غير لاصقة تحيط بالأنماط.

بعد التحضين لمدة 45 دقيقة عند 75 درجة مئوية، قم بسكب محلول ملحي PEG الزائد. بعد ذلك، وأثناء الإمساك بالشريحة الزجاجية باستخدام الملقط، اشطف سطح الشرائح الزجاجية المنقوشة باستخدام التولوين ثم بالماء مرة أخرى، وجففها بتيار هوائي. ضع الشرائح في صندوق شرائح مرطب.

بعد ذلك، ضع الصندوق في كابينة السلامة البيولوجية وقم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة لإجراء التعقيم بالإشعاع. استكمل العمل داخل كابينة السلامة البيولوجية من هذه النقطة فصاعداً. وللحفاظ على العقامة خارج غطاء الكابينة، قم بتحضير واحد مليليتر من محلول HA المائي المعقم بتركيز 10 ملي مولار.

يُستخدم 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide أو EDC بتركيز 5 mM و N-hydroxysuccinimide بتركيز 50 µg/mL. يُعد HA EDC المعلم بالفلوريسين والمعقم عامل ربط متقاطع صفري الطول يتفاعل مع مجموعات الكربوكسيل في HA لتكوين وسائط تفاعلية مع الأمينات. ونظراً لأن هذه الوسيطة عرضة للتحلل المائي، يتم إضافة NHS لزيادة كفاءة تفاعل الكربوديميد.

بعد ذلك، ضع حصصاً مقدارها 200 µL من محلول HA المعقم على الزجاج المنقوش حتى تتغطى المنطقة المنقوشة. ثم أغلق صندوق الشرائح لحماية الشرائح من الضوء. يجب ترك الركائز المنقوشة تحت غطاء سحب الدخان دون تحريك لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة، بينما يتفاعل محلول HA مع A-P-T-M-S المنقوش مجهرياً لتكوين رابطة MI مستقرة بين وسيط HA والأمين الأولي لـ A-P-T-M-S.

في اليوم التالي، استخدم ماصة APA لسحب محلول HA. اغسل الشرائح باستخدام PBS، ثم غطِّ السطح بـ 1%BSA في PBS لمدة ساعة واحدة. أصبح السطح الآن جاهزاً لاستزراع الخلايا.

ضع أسطح الأنماط الدقيقة من الـ HA في طبق بتري معقم للزراعة على أسطح الأنماط الدقيقة من الـ HA. يتم استزراع معلقات خلوية مفردة من الخلايا السرطانية بكثافات تتراوح بين 0.4 و 1 × 10⁶ خلية سرطانية لكل 18.75 cm² من السطح الزجاجي في 1 mL من الوسط الخلوي لتغطية سطح الشريحة الزجاجية، ثم توضع الخلايا بعناية في حضانة رطبة عند 37 °C مع 5% CO2. مع الحرص على عدم انسكاب الوسط، يجب أن يحدث التصاق الخلايا خلال 24 ساعة، ويمكن ملاحظة ذلك باستخدام مجهر ضوئي مقلوب.

يمكن الحفاظ على أسطح المزرعة الخلوية لمدة تصل إلى خمسة أيام. في ظروف الحاضنة القياسية، يتم تغيير الوسط الغذائي كل يومين. ويمكن مراقبة مورفولوجيا الخلايا ونموها باستخدام مجهر ضوئي مقلوب.

يمكن بعد ذلك تطبيق مقايسات خلوية إضافية لتحليل الاستجابات لسطح HA في المثال الموضح هنا. تم تصوير سطح نمط HA باستخدام مجهر فلوري وصورة. يوضح تحليل كثافة الفلورة J إلغاء تثبيت نمط ha.

تتيح أسطح الأنماط الدقيقة من حمض الهيالورونيك (HA) دراسة تفاعلات الخلايا السرطانية مع حمض الهيالورونيك الخارجي. يظهر هنا التصاق الخلايا السرطانية على أسطح الأنماط الدقيقة من حمض الهيالورونيك. لقد التصقت كل من خلايا سرطان القولون وسرطان الثدي بشكل تفضيلي على بقع حمض الهيالورونيك خلال 24 ساعة من الزراعة. ويمكن استخدام التصوير عالي الدقة بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح لتحليل تفاعلات الخلايا المزروعة مع الأسطح التي تم تثبيت حمض الهيالورونيك عليها.

في هذه الصورة المجهرية المأخوذة بالمجهر الإلكتروني الماسح، يمكن رؤية تفاعل خلايا سرطان القولون مع HA، وتظهر تكبيرات أعلى على اليمين. وتظهر هنا مرة أخرى خلايا سرطان الثدي المستزرعة على أسطح HA، مع عرض تكبيرات أعلى على اليمين. يوضح هذا التحليل بوضوح وجود نتوءات لاصقة تعزز انتشار الخلايا السرطانية على أنماط HA الدقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير خدمات الأنماط الدقيقة من حمض الهيالورونيك (HA) وتطبيقها لدراسة استجابة الخلايا السرطانية.