ميكروفلويديك الأجهزة لإعادة تأسيس المكروية ورم في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تصنيع وتشغيل جهاز مائعات دقيقة (microfluidic device) يعيد محاكاة البيئات الدقيقة للأورام في المختبر (in vitro)، ويمكن استخدامه لاختبار الأدوية الكيميائية. هذا هو جهاز المائعات الدقيقة. يمكن أن يكون هذا الجهاز مفيداً في المجالات التالية: الاختبار السهل للأدوية الكيميائية في المختبر.

توفر هذه التقنية نتائج متسقة ودقيقة لاختبار أنسجة الأورام ثلاثية الأبعاد، كما يوفر هذا الجهاز تمثيلاً دقيقاً جداً للأورام في الجسم الحي. توجد الأورام في بيئات مجهرية ثلاثية الأبعاد، وتعد القدرة على الاختبار ضمن هذه البيئات أمراً بالغ الأهمية. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في تجميع الجهاز، والتي تتضمن تصنيع شريحة مائعات مجهرية باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة، وثقب فتحات عند المداخل والمخارج، ولصقها بشريحة زجاجية، وتوصيل الأنابيب الخاصة بمدخل ومخرج التدفق.

بعد ذلك، يتم إنتاج كرويات ورمية متعددة الخلايا وموحدة لاستخدامها في الجهاز باستخدام طريقة القطرة المعلقة. ثم يتم إدخال الكرويات في الجهاز، يلي ذلك إضافة عوامل تحفيز الموت الخلوي المبرمج، وعوامل الكشف، والأدوية الكيميائية. وأخيراً، يتم إجراء التصوير المجهري بفاصل زمني، يليه التقدير الرياضي لمعاملات انتشار الدواء لتقدير قدرة العامل الكيميائي على الاختراق.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر نمو الأنسجة في الجهاز، وتكوّن بيئات مجهرية غير متجانسة داخل النسيج، وانتشار الدواء إلى داخل النسيج، وذلك باستخدام المجهر الفلوري بنظام التصوير الزمني. ويعد الاختراق المحدود للأدوية السرطانية داخل الأورام الصلبة سبباً هاماً في فشلها، كما أن معظم نماذج اختبار أدوية السرطان الحالية لا تحاكي الطبيعة ثلاثية الأبعاد للأورام الصلبة.

لقد قمنا بتطوير جهاز مائع مجهري يتكون من أنسجة ورامية ثلاثية الأبعاد يتم ترويتها بشكل مستمر. ويمثل هذا النموذج بدقة أكبر عملية إيصال الأدوية إلى الأورام الصلبة وتصفيتها الجهازية. وتُعد الكرويات الورامية متعددة الخلايا نموذجاً راسخاً للأنسجة الورامية ثلاثية الأبعاد.

في هذا الإجراء، تُستخدم طريقة القطرة المعلقة (hanging drop method) لإنشاء العضوانيات (steroids) لاستخدامها في الجهاز الموائع الدقيقة. تسمح هذه الطريقة بتكوين عضوانيات متسقة في فترة زمنية قصيرة. ومن شأن اختبار الأدوية الكيميائية العلاجية في المختبر (in vitro) ضمن أنسجة ثلاثية الأبعاد أن يساعد في فحص الأدوية بطريقة أكثر كفاءة مقارنة بطبقات الخلايا أحادية الطبقة.

امزج الـ PDMS وعامل المعالجة من المطاط السيليكوني بنسبة وزنية تبلغ تسعة إلى واحد. ثم صب هذا المزيج فوق القالب الرئيسي لتشكيل طبقة بسُمك 4 mm. قم بإزالة الفقاعات الهوائية عن طريق المعالجة عند درجة حرارة 60 °C لمدة خمس ساعات.

قم بتقشير الـ PDMS المصلد من القالب للحصول على ختم لخصائص التدفق على الإلاستومر. ثم باستخدام خرامة خزعة بمقاس 1.5 مليمتر مثبتة على مثقاب، قم بثقب فتحات المداخل والمخارج. ثم اسحب أي بقايا ناتجة.

عرّض الجانب الذي يحتوي على الميزات في الختم وشريحة زجاجية نظيفة لبلازما الأكسجين لمدة ثماني دقائق. وفي جهاز نقش ببلازما الأكسجين، اجعل الأسطح المعالجة تتلامس على الفور لتكوين رابطة بينهما. حافظ على التجميع عند درجة حرارة 60 °C على مسخن شرائح لمدة خمس ساعات على الأقل.

لتعزيز الرابطة، قم بتوصيل أنابيب PTFE بقطر داخلي 0.032 inches بفتحات المداخل والمخارج في الجهاز الموائع الدقيقة. باستخدام واجهة من موصلات Luer lock ذكرية متصلة بموصلات Luer lock أنثوية مسننة، تُستخدم هذه الموصلات المحددة للسماح بالمرور من خلالها بسهولة دون حدوث كسر. وأخيرًا، قم بتجهيز مجموعة التدفق باستخدام صمامات غلق وموصل Y، ثم ثبّت الجهاز على المجهر. بعد تثبيت الجهاز، قم بتوصيل الأنابيب بالمداخل والمخارج المناسبة لإكمال إعداد التدفق.

كما هو موضح في هذا الشكل، يتيح هذا التكوين السهولة والمرونة في تعبئة الكروي (spheroid) داخل الجهاز أو إنشاء تدفق للوسط عبر الجهاز من أجل التعبئة. افتح صمام مدخل التعبئة VPN وصمام مخرج التعبئة VP out. يمكن حينئذٍ أن يمر الكروي الورمي عبر المدخل ويتدفق إلى غرفة الزرع، حيث سيقوم العمود الموجود في هذه الغرفة بتثبيت الورم في مكانه للسماح بتدفق الوسط.

أغلق صمامات التعبئة وافتح صمام مدخل التدفق VF in وصمام مخرج التدفق VF out لبدء تكوين PHE منتظم. باستخدام طريقة القطرة المعلقة، قم بهضم الخلايا الجليدية باستخدام التربسين تحت غطاء المزرعة. خذ خلايا التربسين الناتجة من جهاز الطرد المركزي.

قم بتخفيف المحلول المخزون إلى التركيز المطلوب بالرجوع إلى الجدول رقم 1. بعد ذلك، انزع غطاء طبق يحتوي على 48 بئرًا وضعه مقلوبًا. وفيما يلي، وباستخدام غطاء تدفق هواء معقم، املأ كل بئر من آبار الطبق بـ 1 mL من الماء المعقم.

للحفاظ على الرطوبة، ضع قطرة بحجم 20 µL من محلول الخلايا المخفف في كل منطقة دائرية على الغطاء. باستخدام ماصة دقيقة، اقلب الغطاء بعناية وضعه فوق الطبق، مع التأكد من أن القطرات لا تلامس حواف الآبار. قم بتحضين الطبق عند درجة حرارة 37 °C.

راجع الجدول واحد لمعرفة مدة الحضن بناءً على نوع الخلية المستخدمة، حيث سيتشكل ستيرويد في كل قطرة معلقة. ابدأ بتعقيم الجهاز عن طريق شطفه بـ 70% ethanol من خلال مدخل التدفق. اتبع ذلك بشطف كل من PBS، ثم وسط زراعة الخلايا المنظم بـ H-E-P-E-S.

اترك سرنجة الوسط، وقم بتوصيلها بالأنابيب. بعد ذلك، اسحب اثنين إلى ثلاثة من الستيرويدات (Steroids) في صنبور السرنجة. ولإزالة الفقاعات الهوائية، قم بتوصيل السرنجة بمدخل التعبئة الخاص بالجهاز.

افتح صمام الإدخال VPN وأغلق VFN، وافتح صمام الإخراج VP out وأغلق VF out. أمسك سرنجة التعبئة بوضع رأسي مع توجيه الإبرة إلى الأسفل. راقب استقرار الستيرويد في قاع السرنجة داخل وصلة القفل اللولبي (lure lock) الخاصة بالإبرة.

اضغط على مكبس سرنجة التعبئة وراقب دخول PHE إلى الأنبوب وتدفقه داخل الجهاز لأن صمام مخرج التعبئة هو المفتوح فقط. سيدخل ستيرويد إلى حجرة الجهاز وسيتم الاحتفاظ به بواسطة القوائم الموجودة في الخلف. وبمجرد دخوله الحجرة، يتشكل الكروي S وفقاً لشكل الحجرة ويكتسب هندسة مستطيلة.

أغلق صمام المدخل VPN وصمام المخرج VP out، ثم ثبّت محقنة التدفق SF على مضخة المحاقن. يتم تشغيل هذه المضخة بواسطة جهاز كمبيوتر باستخدام برنامج syringe pump pro. افتح صمام المدخل VFN وصمام المخرج VF out. ابدأ تدفق الوسط في الجهاز بمعدل Three µL/min.

يتم تحضين الكرويات لمدة 24 ساعة، يتبع ذلك إدخال عوامل الكشف عن الموت الخلوي المبرمج. وقبل إدخال عوامل الكشف عن الموت الخلوي المبرمج أو العوامل العلاجية، اترك الكرويات لتصل إلى حالة التوازن لمدة تصل إلى 24 ساعة لإنشاء تدرجات غذائية وبيئات دقيقة. ثم أغلق الصمام VFN.

أوقف مضخة السرنغة. قم بإزالة السرنغة من المضخة واستبدلها بالسرنغة التي تحتوي على الوسط مع 0.25 µL/mL من مؤشر Caspase three النشط CASP glow red. اغسل الجهاز بالمحلول عن طريق دفع 0.7 mL منه يدوياً عبر الجهاز.

بعد ذلك، قم بتركيب المحقنة على المضخة. أعد تشغيل التدفق وافتح الصمام VFN. وعلى مدار فترة تتراوح من خمس إلى ثماني ساعات، سينتشر كاشف glove red active cph phase three في النسيج وسوف يتفلور بشكل أكثر سطوعاً في المناطق التي تعاني من الموت الخلوي المبرمج. يتم الحفاظ على عامل الكشف عن الموت الخلوي المبرمج بهذا التركيز في جميع محاليل التدفق اللاحقة.

يتم إدخال دواء Doxorubicin بعد مرور خمس إلى ثماني ساعات من إدخال عوامل الكشف عن الموت الخلوي المبرمج (apoptosis). يتم التخلص من هذا العلاج من النظام عن طريق الغسل. ولإضافة العوامل الكيميائية العلاجية، اتبع إجراء الكشف عن الموت الخلوي المبرمج لإدخال 10 micromolar من doxorubicin hydrochloride.

بعد ذلك، استبدل حقنة العلاج بالحقنة التي تحتوي على 0.7 milliliters من الوسط. استمر في تدفق العامل العلاجي لفترة زمنية محددة. ثم أغلق الصمام VFN وأوقف تشغيل مضخة الحقن.

قم بإزالة سرنجة المعالجة من مضخة السرنجات واستبدلها بسرنجة تحتوي على 0.7 milliliters من الوسط الغذائي. اسمح بتدفق الوسط الغذائي الطازج لمدة تتراوح من 24 إلى 36 ساعة مع المراقبة المستمرة للنسيج تحت المجهر. تمت أتمتة عملية الاستحواذ الكاملة للمجهر بنظام التصوير الزمني (time lapse microscopy) باستخدام نص برمجي مخصص في برنامج IP lab، حيث يتم الحصول على صور الضوء النافذ وصور الفلورية لـ PAX Foid بتكبير 10 x كل 30 دقيقة. وللتقدير الرياضي لمعاملات انتشار الدواء، تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء ملفات تعريف متوسط الكثافة الخطية لفلورية الدواء باستخدام برنامج image J. اختر منطقة اهتمام مستطيلة، أو ROI، تشمل النسيج الموجود في الغرفة.

استخدم أمر رسم المقطع العرضي (plot profile) لإنشاء مقطع عرضي لمتوسطات الشدات كدالة في المسافة من قناة التدفق. كرر العملية لما يصل إلى ثلاث نقاط زمنية مختلفة. بعد ذلك، اطرح متوسط شدة الفلورة للخلفية من مقاطع الشدة التي تم الحصول عليها، وقم بتطبيع (normalize) كل مقطع باستخدام الشدة القصوى المقابلة للحصول على C كدالة في X وT. حيث تمثل C التركيز المطبّع للدكسوروبيسين (doxorubicin)، وتتراوح قيمة C بين صفر وواحد.

تتمثل الخطوة التالية في تقييم معامل الانتشار الفعال للدواء داخل أنسجة الورم. يمكن تمثيل الانتشار بالمعادلة التالية حيث تمثل ERFC دالة الخطأ المكملة. ويرمز X إلى المسافة داخل النسيج من القناة، بينما يرمز T إلى الوقت المنقضي بعد إدخال doxorubicin.

استخدم المخطط التكراري التالي عند كل نقطة زمنية مدروسة. خمّن قيمة لـ D. احسب الطرف الأيمن للمعادلة عند كل موقع X. احسب مجموع مربعات الأخطاء بين الطرفين، ثم عدل D لتقليل متوسط المتبقيات.

القيم المثلى لـ D التي تم الحصول عليها عند كل نقطة زمنية لتقدير متوسط معامل الانتشار الفعال للدكسوروبيسين في النسيج. وفرت الأجهزة الموائعية الدقيقة غرف زراعة يمكن الوصول إليها بصرياً بأبعاد 1 مليمتر في 0.3 مليمتر في 0.15 مليمتر لنمو أنسجة ورمية ثلاثية الأبعاد. سمحت طريقة القطرة المعلقة بتكوين سريع لـ PHE ورمي بحجم وشكل متسقين من عدة خطوط خلوية.

تمت زراعة PHE بنجاح على الجهاز لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. وقد ارتبط النمو في الحجرات بتعديل قابل للتكرار للبيئات الدقيقة. وضمن PHE، حدث الموت الخلوي المبرمج بنسبة أقل في الخلايا القريبة من قناة التدفق وبنسبة أعلى وأعمق داخل النسيج.

استُخدم الجهاز لتقدير معامل انتشار الدوكسوروبيسين في أنسجة الورم. وقد تطابقت القيمة التي تم الحصول عليها تجريبياً مع القيمة التي تم الإبلاغ عنها سابقاً في سرطان الثدي البشري. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توخي الحذر الشديد للحفاظ على التعقيم عند تدفق PHE إلى الجهاز، نظراً لأن هذه العملية يجب أن تُجرى خارج بيئة استزراع الخلايا.

قم برش المحاقن ونهايات الأنابيب في خزانة التدفق الصفائحي (hood) بكحول الإيثانول بسخاء لضمان التعقيم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم لدور النفاذ المحدود للأدوية إلى الأورام. لقد استعرضنا تقنية لمحاكاة توصيل الأدوية وتصفيتها الجهازية على أنسجة أورام ثلاثية الأبعاد وقياس مدى نفاذها.

من شأن استبعاد الأدوية ذات النفاذية الضعيفة أن يؤدي إلى تسهيل عملية تطوير أدوية السرطان بشكل كبير.