ميكروفلويديك الأجهزة لإعادة تأسيس المكروية ورم في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات تصنيع وتشغيل جهاز ميكروفلويديك يعيد إنشاء البيئات الدقيقة للورم في المختبر ويمكن استخدامه لاختبار أدوية العلاج الكيميائي. هذا هو جهاز الموائع الدقيقة. يمكن أن يكون هذا الجهاز مفيدا في المجالات التالية ، وهو اختبار سهل لأدوية العلاج الكيميائي في المختبر.

يوفر نتائج متسقة ودقيقة لاختبار أنسجة الورم ثلاثية الأبعاد ، ويوفر هذا الجهاز تمثيلا دقيقا للغاية للورم في الجسم الحي. توجد أورام البيئات المصغرة في بيئات مكروية ثلاثية الأبعاد والقدرة على الاختبار في واحدة مهمة. تتمثل الخطوة الأولى في الإجراء في تجميع الجهاز ، والذي يتضمن تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة ، وتثقيب الثقوب في المداخل والمخارج ، والربط بشريحة زجاجية وتوصيل الأنابيب لمدخل ومخرج التدفق.

التالى, يتم إنشاء المنشطات الورم متعددة الخلايا موحدة للاستخدام في الجهاز باستخدام طريقة إسقاط معلقة. ثم يتم إدخال الكرويات في الجهاز ، متبوعا بموت الخلايا المبرمج ، وعوامل الكشف والأدوية الكيميائية. أخيرا ، يتم إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني ، متبوعا بالتقدير الرياضي لمعاملات انتشار الدواء لتحديد قدرة اختراق عامل العلاج الكيميائي.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر نمو الأنسجة في تكوين الجهاز للبيئات الدقيقة غير المتجانسة داخل الأنسجة وانتشار الدواء في الأنسجة من خلال استخدام الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني. يعد الاختراق المحدود لأدوية السرطان في الأورام الصلبة سببا مهما لفشلها. لا تحاكي معظم نماذج اختبار أدوية السرطان الحالية الطبيعة ثلاثية الأبعاد للأورام الصلبة.

لقد قمنا بتطوير جهاز موائع دقيقة يتكون من أنسجة ورمية ثلاثية الأبعاد ممتلئة باستمرار. يمثل هذا النموذج بشكل أكثر دقة توصيل الأدوية إلى الأورام الصلبة وإزالتها الجهازية. المنشطات الورم متعددة الخلايا هي نموذج راسخ من أنسجة الورم ثلاثية الأبعاد.

في هذا الإجراء ، يتم استخدام طريقة السقوط المعلق لإنشاء المنشطات لاستخدامها في جهاز الموائع الدقيقة. هذه الطريقة تسمح بتشكيل المنشطات متسقة في فترة قصيرة من الزمن. يمكن أن يساعد اختبار أدوية العلاج الكيميائي في المختبر في أنسجة ثلاثية الأبعاد في فحص الأدوية بطريقة أكثر كفاءة مقارنة بالطبقات الأحادية للخلايا.

امزج PDMS وعامل المعالجة من المطاط الصناعي السيليكوني بنسبة وزن تسعة إلى واحد. ثم اسكب هذا الخليط فوق السيد لتشكيل وهج بسمك أربعة ملليمترات. لإزالة فقاعات الهواء تعالج عند 60 درجة مئوية لمدة خمس ساعات.

قشر PDMS المعالج من القالب للحصول على ختم ميزات التدفق على المطاط الصناعي. ثم باستخدام لكمة خزعة بحجم واحد ونصف ملم مثبتة على مثقاب ، اضغط على ثقوب المثقوب للمداخل والمنافذ. اسحب أي حطام.

ضع الجانب المميز من الختم والشريحة الزجاجية النظيفة إلى بلازما الأكسجين لمدة ثماني دقائق. في حفر بلازما الأكسجين ، قم بتلامس الأسطح المعالجة على الفور لتشكيل رابطة بينهما. حافظ على التجميع عند 60 درجة مئوية على جهاز تسخين الشرائح لمدة خمس ساعات على الأقل.

لتقوية الرابطة ، قم بتوصيل أنبوب PTFE مقاس 0.032 بوصة بمداخل ومخارج جهاز الموائع الدقيقة. باستخدام واجهة من موصلات قفل إغراء الذكور المرفقة بموصلات قفل الإغراء الأنثوي الشائكة ، يتم استخدام هذه الموصلات المحددة للسماح بالمرور بسهولة من خلالها دون كسر. أخيرا ، قم بإعداد مجموعة التدفق باستخدام صمامات الإغلاق والموصل Y ، وقم بتركيب الجهاز على المجهر بعد تركيب الجهاز ، قم بتوصيل الأنبوب بمداخل ومنافذ مناسبة لإكمال إعداد التدفق.

كما هو موضح في هذا الشكل ، يسمح هذا التكوين بسهولة وتعدد استخدامات تعبئة الكرة الكروية في الجهاز أو إنشاء تدفق وسيط عبر الجهاز لتعبئته. افتح صمام مدخل التعبئة VPN وصمام مخرج التعبئة VP للخروج من الورم. يمكن أن يمر OID بعد ذلك عبر المدخل ويتدفق إلى غرفة الثقافة حيث سيثبت العمود الموجود في هذه الغرفة الورم في مكانه لوسط التدفق.

أغلق صمامات التعبئة وافتح صمام مدخل التدفق VF للداخل وصمام مخرج التدفق VF للخارج لبدء تشكيل PHE موحد. باستخدام طريقة القطرة المعلقة ، خلايا الجليد التربسين تحت غطاء المزرعة. خذ خلايا التربسين الناتجة من جهاز الطرد المركزي.

خفف محلول المرق إلى التركيز المطلوب بالرجوع إلى الجدول الأول. بعد ذلك ، قم بإزالة غطاء لوح 48 جيدا وضعه رأسا على عقب. في غطاء معقم ، املأ كل بئر من اللوحة بمليلتر واحد من الماء المعقم.

للحفاظ على الرطوبة ، ضع قطرة 20 ميكرولتر من محلول الخلية المخففة في كل منطقة دائرية على الغطاء. باستخدام ماصة صغيرة ، اقلب الغطاء بحذر وضعه فوق اللوحة ، مع التأكد من عدم لمس القطرات حواف الآبار. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية.

راجع الجدول الأول لمدة الحضانة بناء على الخلية المعينة المستخدمة ، سيتشكل الستيرويد في كل قطرة معلقة. ابدأ بتعقيم الجهاز عن طريق شطفه بنسبة 70٪ من الإيثانول من خلال مدخل التدفق. اتبع بتدفق كل من PBS ، ثم وسط زراعة الخلايا المخزن H-E-P-E-S.

اترك المحقنة المتوسطة ، وتعلق على الأنبوب. بعد ذلك ، ارسم اثنين إلى ثلاثة من المنشطات في حقنة حنفية المحقنة. لإزالة فقاعات الهواء ، قم بتوصيل المحقنة بمدخل تعبئة الجهاز.

افتح صمام المدخل VPN وأغلق صمام المخرج المفتوح VFN VP وأغلق VF. امسك حقنة التعبئة عموديا مع توجيه الإبرة لأسفل. شاهد كما يستقر الستيرويد في الجزء السفلي من حقنة في موصل قفل إغراء الإبرة.

ادفع المكبس الموجود على حقنة التعبئة وشاهد PHE يدخل الأنبوب ويتدفق إلى الجهاز لأن صمام مخرج التعبئة فقط مفتوح. سوف يدخل الستيرويد إلى غرفة الجهاز ويتم الاحتفاظ بها من قبل المشاركات في الخلف. بمجرد دخوله إلى الغرفة ، يتوافق الكروي S مع شكل الغرفة ويكتسب هندسة مستطيلة.

أغلق صمام المدخل VPN وصمام المخرج VP للخارج قم بتركيب حقنة التدفق SF على مضخة المحقنة. يتم تشغيل هذه المضخة بواسطة جهاز كمبيوتر باستخدام مضخة حقنة ، وصمام مدخل مفتوح احترافي VFN وصمام مخرج VF خارج. ابدأ تدفق الوسط إلى الجهاز بمعدل ثلاثة ميكرولتر في الدقيقة.

يتبع حضانة الفيري لمدة 24 ساعة إدخال عوامل الكشف عن موت الخلايا المبرمج. قبل إدخال موت الخلايا المبرمج أو الكشف أو العوامل العلاجية ، اسمح بتوازن الكرة لمدة تصل إلى 24 ساعة لإنشاء تدرجات المغذيات والبيئات الدقيقة. ثم أغلق صمام VFN.

أوقف مضخة المحقنة. قم بإزالة المحقنة من المضخة واستبدلها بالمحقنة المحتوية على وسط مع 0.25 ميكرولتر لكل مل من CASP توهج الأحمر النشط كاسباز ثلاثة علامات. اغسل الجهاز بالمحلول عن طريق شطف 0.7 مل منه يدويا عبر الجهاز.

ثم قم بتركيب المحقنة على المضخة. أعد تشغيل التدفق وافتح الصمام VFN. على مدى خمس إلى ثماني ساعات ، سوف تنتشر المرحلة الثالثة من القفاز الأحمر في الأنسجة ويتألق أكثر إشراقا في مناطق موت الخلايا المبرمج ، ويتم الحفاظ على عامل الكشف عن موت الخلايا المبرمج عند هذا التركيز في جميع حلول التدفق اللاحقة.

يتم إدخال دوكسوروبيسين بعد خمس إلى ثماني ساعات من إدخال عوامل الكشف عن موت الخلايا المبرمج. يتم إزالة هذا العلاج بعيدا عن النظام عن طريق التنظيف. لإضافة عوامل العلاج الكيميائي ، اتبع إجراء الكشف عن موت الخلايا المبرمج لإدخال 10 ميكرومولار دوكسوروبيسين هيدروكلوريد.

ثم استبدل حقنة العلاج بالمحقنة ب 0.7 مل من المتوسط. استمر في تدفق العامل العلاجي لفترة زمنية محددة. ثم أغلق الصمام VFN وقم بإيقاف تشغيل مضخة المحقنة.

قم بإزالة حقنة المعالجة من مضخة الحقنة واستبدلها بالمحقنة ب 0.7 مل من المتوسط. اسمح بتدفق الوسط الطازج لمدة 24 إلى 36 ساعة مع المراقبة المستمرة للأنسجة تحت المجهر. تمت أتمتة عملية الاستحواذ الكاملة للفحص المجهري بفاصل زمني باستخدام برنامج نصي مخصص في مختبر IP ، والحصول على صور الضوء والفلورة المنقولة ل PAX Foid عند تكبير 10 × كل 30 دقيقة للتقدير الرياضي لمعاملات انتشار الدواء ، تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء ملفات تعريف متوسطة الكثافة الخطية لمضان المستندات باستخدام الصورة J. حدد منطقة مستطيلة من الاهتمامات ، أو عائد الاستثمار الذي يشمل الأنسجة في الغرفة.

أستطيع الأمر ملف تعريف المخطط لإنشاء ملف تعريف لمتوسط الشدة كدالة للمسافة من قناة التدفق. كرر لمدة تصل إلى ثلاث نقاط زمنية مختلفة. بعد ذلك ، اطرح متوسط شدة مضان الخلفية من ملفات تعريف الشدة التي تم الحصول عليها وقم بتطبيع كل ملف تعريف باستخدام الحد الأقصى للكثافة المقابلة للحصول على C كدالة ل X و T.حيث C هو التركيز الطبيعي للدوكسوروبيسين ، تتراوح قيمة C بين صفر إلى واحد.

الخطوة التالية هي تقييم معامل الانتشار الفعال للمستندات داخل مستندات الأنسجة الورمية. يمكن تمثيل الانتشار بالمعادلة التالية حيث ERFC هي دالة الخطأ التكميلية. X هي المسافة إلى الأنسجة من القناة ، و T هو الوقت التالي لإدخال دوكسوروبيسين.

استخدم المخطط التكراري التالي في كل نقطة زمنية يتم أخذها في الاعتبار. تخمين قيمة ل D.احسب الجانب الأيمن من المعادلة في كل موقع. X.احسب مجموع الأخطاء التربيعية بين الجانبين ، وقم بتعديل D لتقليل المتوسط المتبقي.

تم الحصول على القيم المثلى ل D في كل نقطة زمنية لتقدير متوسط معامل الانتشار الفعال للدوكسوروبيسين في الأنسجة. وفرت أجهزة الموائع الدقيقة غرف ثقافة يمكن الوصول إليها بصريا بحجم ملليمتر واحد × 0.3 ملم × 0.15 ملم لنمو أنسجة الورم ثلاثية الأبعاد. سمحت طريقة السقوط المعلق بالتكوين السريع للورم PHE بحجم وشكل متسقين من عدة خطوط خلايا.

تمت زراعة PHE بنجاح على الجهاز لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. ارتبط النمو في الغرف بالتعديل القابل للتكرار للبيئات الدقيقة. داخل phe ، حدث موت الخلايا المبرمج بشكل أقل في الخلايا القريبة من قناة التدفق وأعلى وأعمق في الأنسجة.

تم استخدام الجهاز لتقدير معامل انتشار دوكسوروبيسين وأنسجة الورم. تتفق القيمة التي تم الاحتفاظ بها تجريبيا مع القيمة التي تم الإبلاغ عنها سابقا في سرطان الثدي البشري أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم توخي الحذر الشديد في الحفاظ على العقم عند تدفق PHE إلى الجهاز لأنه يجب إجراؤه خارج زراعة الخلايا.

محاقن رش غطاء محرك السيارة ونهايات الأنابيب بالإيثانول بسخاء لضمان العقم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لدور الاختراق المحدود للأدوية في الأورام. لقد أظهرنا تقنية لتقليد توصيل الأدوية وإزالتها الجهازية على أنسجة الورم ثلاثية الأبعاد وتحديد اختراقها.

سيؤدي التخلص من الأدوية سيئة الاختراق إلى تبسيط عملية تطوير أدوية السرطان بشكل كبير.