Hyperinsulinemic - المشبك سوي سكر الدم في الفئران وإدراكا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم الحساسية للإنسولين في الجرذ الواعي غير المقيد. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قسطرة الشريان السباتي الأيسر، ثم يتم قسطرة الوريد الوداجي الأيمن لضمان الحصول على أفضل النتائج.

يتم غسل القساطر يومياً للحفاظ على نفاذيتها خلال فترة التعافي بعد الجراحة والتي تستمر لمدة خمسة أيام. وفي النهاية، يمكن الحصول على النتائج من تقنية مشبك الجلوكوز مع فرط إنسولين الدم التي توضح معدلات تسريب الجلوكوز في الجسم بالكامل. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية الحصول على قياسات مباشرة لمعدلات التخلص من الجلوكوز في الجسم بالكامل عند مستويات إنسولين فسيولوجية عالية.

يجب تحضير القثطرات الشريانية والوريدية مسبقاً قبل الإجراء الجراحي. يجب أن تكون نهايات القثطرة غير حادة، وتُملأ بمحلول ملحي هيباريني، وتُعقم بالإيثانول مع تثبيت رباط تقييدي بإحكام على مسافة 2.7 أو 3.2 سنتيمتر من أحد الطرفين للقثطرات الشريانية والوريدية على التوالي. تُستخدم في هذا الإجراء ذكور جرذان Sprague Dawley بالغة يبلغ وزنها حوالي 300 جرام.

سجّل الوزن الابتدائي للحيوان واستخدم هذا الوزن لمراقبة زيادة الوزن بعد الجراحة. يتم العمل في منطقة جراحية معقمة. خدر الجرذ باستخدام 3% isof fluorine عن طريق وضعه في صندوق تخدير.

انقل الحيوان بعيدًا عن منطقة الجراحة وجهّز موقع الشق عن طريق إزالة الشعر من حول الرقبة والكتفين. وبمجرد إزالة الشعر، ضع الحيوان في مخروط أنفي للحفاظ على التخدير باستخدام isof fluorine بنسبة 2% تقريبًا. ثبّت الحيوان على طاولة الجراحة.

تأكد من تخدير الجرذ بشكل كامل عن طريق فحص وجود منعكسات القدم و/أو العين. قم بتنظيف موقع الشق باستخدام 70%ethanol، يليه فرك بمحلول Betadine، ثم تكرار التنظيف بـ 70%ethanol. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في إجراء شق رأسي صغير في خط المنتصف على مسافة 10 millimeter أعلى عظمة القص.

استخدم ملاقط تشريح دقيقة منحنية لإجراء تشريح كليل للأنسجة وإزاحتها للكشف عن العضلة الخشائية القصية اليسرى. أبعد هذه العضلة للكشف عن جزء من الشريان السباتي الأيسر بطول 1 سنتيمتر تقريبًا. ضع ملاقط التشريح الدقيقة أسفل الشريان السباتي لتثبيته في مكانه أثناء إزالة النسيج الضام برفق.

من المهم عزل العصب المبهم بعيداً عن الشريان دون إلحاق الضرر بأي منهما، سواء الشريان أو العصب. استخدم خيط جراحة حريري معقم قياس 4-0 لربط الطرف الرأسي. ثم قم بتثبيت الوعاء الدموي باستخدام ملقط تشريح دقيق مسنن.

قم بثقب الرباط. انتهِ باستخدام محول لuere لجمع عينات متعددة من نوع ven eject بقياس 21 gauge. قم بإزالة السدادة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من القسطرة واستخدم موجه قسطرة معقماً لتوجيهها إلى الشريان.

استخدم الملقط للتأكد من تثبيت القسطرة. بشكل جزئي. حرر ملقط التشريح الدقيق، مع تثبيت الشريان والاستمرار في إدخال القسطرة وصولاً إلى الخرزة. في هذه المرحلة، يجب أن يكون طرف القسطرة في قوس الأبهر.

قم بتثبيت غرزتين تحت الخرزة وغرزة واحدة فوقها، ثم اغسل الخط بمحلول ملحي مهرق بتركيز 10 units per milliliter. وللتأكيد على أن القسطرة ستقوم بأخذ العينة، أعد سد الطرف الخارجي للقسطرة باستخدام سدادة من الفولاذ المقاوم للصدأ. بعد ذلك، قم بإجراء تشريح كليل للأنسجة للكشف عن الوريد الوداجي الخارجي الأيمن، وافصل الوريد بعناية ثم اربط الوريد الرأسي.

أنهِ العملية باستخدام خيط جراحي حريري. قم بثقب الوريد باستخدام إبرة وريد عيار 21. قم بطرد محول سحب العينات متعدد العينات.

قم بإزالة السدادة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من القسطرة، واستخدم مُدخل قسطرة معقم لإدخالها وصولاً إلى الخرزة. ثبّت غرزتين تحت الخرزة وغرزة واحدة فوقها. ثم قم بغسل الخط بمحلول ملحي مثلج يحتوي على الهيبارين بتركيز 10 units per milliliter.

للتأكد من أن القسطرة ستقوم بأخذ العينات، أعد سد الطرف الخارجي للقسطرة باستخدام سدادة من الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام إبرة غير مدببة قياس 14 gauge، ومررها تحت الجلد مع إجراء شق في الظهر بين لوحي الكتف. بعد ذلك، مرر القساطر عبر الإبرة بحيث تخرج من ظهر الجرذ، مع مراعاة أن يكون حوالي 4 cm من كل قسطرة مرئياً.

اقطع قطعة بطول 0.5 centimeters من أنبوب Tigon S 50 HL الطبي وضعها حول كلا القثطرتين المخرجتين. ثبتهما بشريط لاصق أزرق للأوردة وأحمر للشرايين. أعد اختبار القثطرات للتأكد من نفاذيتها، ثم قم بشطفها وملئها بمحلول ملحي هيبارين بتركيز 150 units per milliliter لمنع التجلط.

أغلق جميع الشقوق باستخدام خيوط جراحية من الحرير قياس 3-0. ضع الجرذ في وضعية الانبطاح داخل قفص نظيف ومدفأ مسبقاً مع توفير الغذاء بشكل يسهل الوصول إليه. وبمجرد استعادة الجرذ لقدرته الكاملة على الحركة واليقظة، أعِده إلى القفص الأصلي.

اترك الجرذ لفترة تعافٍ تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام مع المراقبة اليومية للتأكد من عدم وجود عدوى أو ألم، ومتابعة التغيرات في الوزن. ومن المهم الحفاظ على نفاذية القسطرة طوال فترة الدراسة. وفي كل يوم يلي الجراحة، املأ محاقن ذات طرف انزلاقي سعة 1 mL بمحلول ملحي مهبين بتركيز 150 unit/mL، ثم أغلقها بإبرة غير مدببة عيار 22 gauge.

تُدخل الإبرة غير المدببة في ٢٠ سنتيمتر من أنابيب PE 50 مع وصلة أنابيب من الفولاذ المقاوم للصدأ بقياس 23 gauge في الطرف الآخر. تأكد من إزالة جميع الفقاعات الهوائية من الخط. يتم غلق الخط الشرياني الخارجي من الجرذ باستخدام ملاقط Hemostats، أسفل السدادة مباشرةً.

قم بإزالة سدادة القسطرة الفولاذية باستخدام زوج آخر من الملاقط المرقئة. أدخل وصلة الأنابيب المتصلة بالمحقنة في الخط الشرياني، ثم حرر الملاقط المرقئة التي تغلق القسطرة الشريانية الخارجية. بعد ذلك، اسحب الدم الشرياني من القسطرة إلى داخل المحقنة.

إذا لم يتم السحب عبر القسطرة بسهولة، فقد يكون من الضروري دفع كمية صغيرة جداً من المحلول برفق شديد من خلال القسطرة لتحرير الطرف. عند هذه النقطة، تُعتبر القسطرة سالكة. وعندما يصل الدم إلى حقنة السحب، يتم إغلاق أنبوب P 50 القريب من حقنة الـ 1 mL ثم يتم التخلص من الحقنة.

استبدل السرنجة بأخرى جديدة مملوءة بمحلول ملحي مبرد يحتوي على الهيبارين. قم بفك مشبك الأنبوب، وأثناء إمساك السرنجة الجديدة في وضع عمودي، انقر عليها لإزاحة فقاعات الهواء إلى الأعلى وبعيداً عن الخط. احقن المحلول الملحي المضاف إليه الهيبارين حتى يصبح خط القسطرة صافياً وخالياً من الدم.

أغلق الخط الشرياني باستخدام الملقط أسفل وصلة الأنابيب مباشرةً. قم بإزالة موصل المحقنة من خط القسطرة الشريانية واستبدله بسدادة أنابيب من الفولاذ المقاوم للصدأ. ثم حرر الملاقط التي تسد القسطرة الشريانية الخارجية.

كرر هذا الإجراء بالنسبة للخط الوريدي. نظرًا لانخفاض الضغط الوريدي، قد لا يكون أخذ العينات ممكنًا. وبشكل عام، إذا كان من الممكن تسريب المحلول الملحى المعبأ بالهيبارين بأقل قدر من المقاومة، فمن المرجح أن القسطرة في وضعية صحيحة داخل الوريد.

قبل البدء في الإجراء، يجب وزن الحيوانات وتحضير المحاليل وتجميع جهاز التثبيت. بعد وزن الحيوان والتأكد من نفاذية القسطرة، يوضع في حاوية صغيرة تحتوي على مادة فرش تعيق الحركة ولكن لا تقيدها. يتم صيام الجرذان المستخدمة في هذه الدراسة لمدة خمس ساعات على الأقل، مع استيفاء متطلبات زيادة الوزن بعد الجراحة. يحدد وزن الجرذ كمية الإنسولين المطلوبة هنا.

يتم إعطاء 4 milli units per kilogram per minute بمعدل 2 µL per minute. قم بتحضير محلول dextrose بتركيز 50% وتأكد من توفر كمية كافية من كلا المحلولين لتكفي لمدة ساعتين تقريباً، مع استخدام محاقن سعة 3 mL. الآن أنت مستعد لتجميع جهاز المشبك.

قم بتجهيز الخطوط ومضخات التسريب كما هو موضح هنا. ضع محاقن الجلوكوز والأنسولين على مضخة المحاقن. أغلق الخطوط بالملاقط واترك الجرذ ليرتاح لمدة 30 دقيقة قبل بدء التجربة.

لبدء الإجراء، يتم أخذ عينة أساسية من الإنسولين وهيماتوكريت الدم؛ حيث يضمن قياس الهيماتوكريت الحفاظ على حجم الدم طوال التجربة. وبشكل عام، يجب ألا تنخفض مستويات الهيماتوكريت بأكثر من 10% من القيمة الأولية. يتم الحصول على عينة أساسية من الجلوكوز وتحديد مستوى الجلوكوز المراد تثبيته.

نقوم هنا بالتثبيت عند مستوى سكر الدم أو 5 millimolar. بعد كل عينة دم، يتم غسل الخط الشرياني بحجم صغير من محلول ملحي مضاف إليه الهيبارين بتركيز 10 units per milliliter لمنع التجلط. بعد تحديد مستوى الجلوكوز المراد تثبيته، ابدأ بتسريب محلول الإنسولين.

سجّل مستوى جلوكوز الدم على فترات زمنية تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق، واضبط معدل تسريب الجلوكوز حسب الحاجة حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة. تتبع هذه العملية عموماً أسلوب التجربة والخطأ، وقد تستغرق مدة تتراوح من 30 دقيقة إلى أكثر من ساعتين. يعتمد مستوى الجلوكوز المطلوب للحفاظ على سكر الدم على البروتوكول التجريبي.

لكي تُعتبر الأنواع والظروف في حالة تثبيت (clamped)، يجب أن تقع ثلاث قراءات متتالية ضمن نطاق محدد. وتشير ثلاث قراءات تفصل بينها حوالي 1 millimolar إلى أن مستويات الجلوكوز قد وصلت إلى حالة من الاستقرار في السجل. ويمكن الحصول على عينات دم إضافية كحد أدنى خلال هذه الفترة البالغة 30 دقيقة، وهو معدل تسريب الجلوكوز المطلوب للحفاظ على سكر الدم.

يجب جمع عينة ثانية من هيماتوكريت إنسولين البلازما بمجرد اكتمال إجراء التثبيت (clamp procedure). ويمكن استخدام الحيوانات لإجراء المزيد من الاختبارات أو قتلها رحيمًا لجمع الأنسجة من أجل تحليلات إضافية. واعتمادًا على الحيوان، يمكن أن تظل خطوط القسطرة مفتوحة لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام عند تنفيذها بشكل صحيح.

يمكن لإجراء المشبك (clamp procedure) قياس حساسية الإنسولين في الحالة المستقرة. ومن الضروري تسجيل مستويات الإنسولين والجلوكوز، بالإضافة إلى معدلات تسريب الجلوكوز وقيم الهيماتوكريت. ويتم الوصول إلى الحالة المستقرة عندما تظل مستويات الجلوكوز ضمن نطاق واحد millimolar من بعضها البعض على مدار فترة زمنية مدتها 30 دقيقة.

يكشف معدل تسريب الجلوكوز عن مستوى الجلوكوز الخارجي المطلوب للحفاظ على مستوى سكر الدم، حيثما أمكن، يجب رسم هذا المعدل بيانياً بمرور الوقت بدلاً من الاعتماد على نقطة زمنية متوسطة واحدة. كما يجب تسجيل مستويات الأنسولين في حالتي الصيام والتثبيت (clamped). وتؤكد هذه القياسات أنه تم إيصال الأنسولين بنجاح، وستكشف عن أي اختلافات في استجابة الأنسولين بين مجموعات العلاج. إن قياس مستويات الهيماتوكريت في بداية التجربة، ومرة أخرى بعد الإجراء، يضمن عدم انخفاض المستويات بأكثر من 5% من القيمة الأساسية على مدار التجربة بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى، مثل إعطاء المتتبعات النظيرية، لتقييم استهلاك الغلوكوز في الجسم بأكمله أو في أنسجة محددة.