Hyperinsulinemic - المشبك سوي سكر الدم في الفئران وإدراكا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم الحساسية للأنسولين في الجرذ الواعي غير المقيد. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قسطرة الشريان السباتي الأيسر، ثم تليها قسطرة الوريد الوداجي الأيمن لضمان الحصول على أفضل النتائج.

يتم غسل القسطرات يومياً للحفاظ على نفاذيتها خلال فترة التعافي بعد الجراحة التي تستمر لخمسة أيام. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج من تقنية مشبك الجلوكوز مع فرط إنسولين الدم (hyperinsulinemic glycemic clamp) والتي توضح معدلات حقن الجلوكوز في الجسم بالكامل. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية الحصول على قياسات مباشرة لمعدلات التخلص من الجلوكوز في الجسم بالكامل عند مستويات إنسولين فسيولوجية عالية.

يجب تحضير القساطر الشريانية والوريدية مسبقاً قبل الإجراء الجراحي. يجب أن تكون نهايات القسطرة غير حادة، وتُملأ بمحلول ملحي مضاف إليه الهيبارين، وتُعقم بالإيثانول مع تثبيت خرزة تثبيت بإحكام على بعد 2.7 أو 3.2 سنتيمتر من أحد الطرفين للقساطر الشريانية والوريدية على التوالي. تُستخدم في هذا الإجراء ذكور جرذان من سلالة spray dolly البالغة والتي تزن حوالي 300 جرام.

سجل الوزن الابتدائي للحيوان واستخدم هذا الوزن لمراقبة زيادة الوزن بعد الجراحة. يتم العمل في منطقة جراحية معقمة. قم بتخدير الجرذ باستخدام 3% isof fluorine عن طريق وضعه في صندوق التخدير.

انقل الحيوان بعيداً عن منطقة الجراحة وجهّز موقع الشق الجراحي عن طريق إزالة الشعر من حول الرقبة والكتفين. وبمجرد إزالة الشعر، ضع الحيوان في مخروط أنفي للحفاظ على التخدير باستخدام 2%isof fluorine تقريباً. ثبّت الحيوان على طاولة الجراحة.

تأكد من تخدير الجرذ بشكل كامل عن طريق التحقق من وجود ردود فعل في القدم و/أو العين. نظّف موقع الشق باستخدام 70%ethanol، يليه فرك بمحلول Betadine، ثم يليه مرة أخرى 70%ethanol. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في إجراء شق عمودي صغير في الخط الناصف على بُعد 10 millimeter أعلى عظمة القص.

استخدم ملاقط تشريح دقيقة منحنية لإجراء تشريح غير حاد للأنسجة وإزاحتها للكشف عن العضلة الخشائية القصية اليسرى. قم بإزاحة هذه العضلة للكشف عن حوالي 1 cm من الشريان السباتي الأيسر. ضع ملاقط التشريح الدقيقة أسفل الشريان السباتي لتثبيته في مكانه أثناء إزالة النسيج الضام برفق.

من المهم عزل العصب المبهم بعيداً عن الشريان دون إلحاق الضرر بالشريان أو العصب. استخدم خيط جراحي حريري معقم قياس 4-0 لربط الطرف الرأسي. قم بتثبيت الوعاء الدموي باستخدام ملقط تشريح دقيق مسنن.

قم بثقب المنطقة المربوطة. استخدم محول لولبي لسحب عينات متعددة من قياس 21 gauge. قم بإزالة السدادة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من القسطرة، واستخدم أدوات إدخال قسطرة معقمة لتوجيهها إلى داخل الشريان.

استخدم الملقط للتأكد من تثبيت القسطرة. قم بتحرير ملقط التشريح الدقيق جزئيًا، مع تثبيت الشريان، وواصل إدخال القسطرة حتى تصل إلى الخرزة. في هذه المرحلة، يجب أن يكون طرف القسطرة في قوس الأبهر.

قم بتثبيت غرزتين أسفل الخرزة وغرزة واحدة فوقها، ثم اشطف الخط بمحلول ملحي مضاف إليه الهيبارين بتركيز 10 units per milliliter. وللتأكد من أن القسطرة ستأخذ عينة، أعد سد الطرف الخارجي للقسطرة باستخدام سدادة من الفولاذ المقاوم للصدأ. بعد ذلك، قم بإجراء تشريح كليل للأنسجة لكشف الوريد الوداجي الخارجي الأيمن، وافصل الوريد بعناية ثم اربط الوريد الرأسي.

أنهِ العملية بغرزة من خيوط الحرير. قم بثقب الوريد باستخدام إبرة وريدية قياس 21 gauge. قم بقذف محول سحب العينات المتعددة.

قم بإزالة السدادة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من القسطرة، واستخدم مدخلاً معقماً للقسطرة لإدخالها وصولاً إلى الخرزة. قم بتثبيت غرزتين أسفل الخرزة وغرزة واحدة فوقها. ثم اغسل الخط بمحلول ملحي مثلج يحتوي على الهيبارين بتركيز 10 units per milliliter.

للتأكيد على أن القسطرة ستعمل على أخذ العينات، أعد سد الطرف الخارجي للقسطرة باستخدام سدادة من الفولاذ المقاوم للصدأ وبواسطة إبرة غير مدببة بمقاس 14 gauge، ثم مررها تحت الجلد وأجرِ شقاً في الظهر بين لوحي الكتف. بعد ذلك، مرر القساطر عبر الإبرة بحيث تخرج من ظهر الجرذ. يجب أن يكون حوالي 4 cm من كل قسطرة ظاهراً.

اقطع قطعة بطول 0.5 centimeters من أنبوب Tigon S 50 HL الطبي وضعها حول كلا القثطرتين الخارجيتين. ثبتهما بشريط لاصق أزرق للأوردة وأحمر للشرايين. أعد اختبار القثطرات لضمان نفاذيتها، ثم قم بغسلها وملئها بمحلول ملحي هيباريني بتركيز 150 units per milliliter لمنع التجلط.

أغلق جميع الشقوق باستخدام خيوط جراحية من الحرير مقاس 3-0. ضع الجرذ في وضعية الانبطاح داخل قفص نظيف ومدفأ مسبقاً مع توفير الغذاء بشكل يسهل الوصول إليه. وبمجرد استعادة الجرذ لقدرته الكاملة على الحركة واليقظة، أعده إلى قفصه الأصلي.

يُترك الجرذ لفترة تعافٍ تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام، مع المراقبة اليومية للتأكد من عدم وجود عدوى أو ألم، ومتابعة التغيرات في الوزن. ومن الضروري الحفاظ على نفاذية القسطرة طوال فترة الدراسة. وفي كل يوم يلي الجراحة، تُملأ محاقن ذات طرف انزلاقي سعة 1 ml بمحلول ملحي مضاف إليه الهيبارين بتركيز 150 units per ml، ثم تُغلق بإبرة غير مدببة عيار 22 gauge.

تُدخل الإبرة غير المدببة في 20 centimeters من أنابيب PE 50 مع وصلة أنابيب من الفولاذ المقاوم للصدأ بقياس 23 gauge عند الطرف الآخر. تأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء من الخط. يتم غلق الخط الشرياني الممتد من الجرذ باستخدام ملاقط وقف النزيف (hemostats)، أسفل السدادة مباشرةً.

أزل سدادة القسطرة الفولاذية باستخدام زوج آخر من الملاقط الدموية. أدخل وصلة الأنابيب المتصلة بالحقنة في الخط الشرياني، ثم حرر الملاقط الدموية التي تغلق القسطرة الشريانية الخارجية. بعد ذلك، اسحب الدم الشرياني من القسطرة إلى الحقنة.

إذا لم يتم السحب عبر القسطرة بسهولة، فقد يكون من الضروري دفع كمية صغيرة جداً من المحلول بلطف شديد عبر القسطرة لتحرير الطرف. وبذلك تُعتبر القسطرة قد تم تسليكها. وعندما يصل الدم إلى مشبك المحقنة، يتم إغلاق أنبوب P 50 القريب من محقنة الـ 1 mL والتخلص من المحقنة.

استبدلها بمحقنة جديدة مملوءة بمحلول ملحي مثلج يحتوي على الهيبارين. قم بفك مشبك الأنبوب، وأثناء إمساك المحقنة الجديدة في وضع عمودي، قم بالنقر على المحقنة لطرد فقاعات الهواء إلى الأعلى وبعيداً عن الخط. احقن المحلول الملحي المضاف إليه الهيبارين حتى يصبح خط القسطرة صافياً وخالياً من الدم.

أغلق الخط الشرياني باستخدام مشبك أسفل وصلة الأنابيب مباشرة. قم بإزالة موصل المحقنة من خط القسطرة الشريانية واستبدله بسدادة أنابيب من الفولاذ المقاوم للصدأ. ثم حرر الملاقط الدموية التي تغلق القسطرة الشريانية الخارجية.

كرر هذا الإجراء للخط الوريدي. قد لا يكون أخذ العينات ممكناً بسبب انخفاض الضغط الوريدي. وبشكل عام، إذا كان من الممكن تسريب المحلول الملحي المعبأ بالهيبارين بمقاومة طفيفة، فمن المرجح أن القسطرة موضوعة بشكل جيد في الوريد.

قبل البدء في الإجراء، يجب وزن الحيوانات وتجهيز المحاليل وتجميع جهاز المشبك. بعد وزن الحيوان والتأكد من نفاذية القسطرة، يوضع في حاوية صغيرة تحتوي على مادة فرش تlimit حركة الحيوان دون تقييدها. يتم إخضاع الجرذان المستخدمة في هذه الدراسة للصيام لمدة خمس ساعات على الأقل، ويجب أن تكون قد استوفت متطلبات زيادة الوزن بعد الجراحة. يحدد وزن الجرذ كمية الإنسولين المطلوبة هنا.

يتم إعطاء أربع وحدات دولية لكل كيلوغرام في الدقيقة بمعدل 2 µL في الدقيقة. قم بتحضير محلول dextrose بتركيز 50% وتأكد من وجود كمية كافية من كلا المحلولين لتكفي لمدة ساعتين تقريبًا؛ حيث تُستخدم محاقن سعة 3 mL. الآن أنت مستعد لتجميع جهاز التثبيت.

قم بتجهيز الخطوط ومضخات التسريب كما هو موضح هنا. ضع محاقن الجلوكوز والأنسولين على مضخة المحاقن. أغلق الخطوط باستخدام المشابك واترك الجرذ ليرتاح لمدة 30 دقيقة قبل بدء التجربة.

لبدء الإجراء، يتم أخذ عينة مرجعية من الإنسولين والهيماتوكريت؛ حيث تضمن عملية أخذ عينات الهيماتوكريت الحفاظ على حجم الدم طوال التجربة. وبشكل عام، يجب ألا تنخفض مستويات الهيماتوكريت بأكثر من 10% من القيمة الأولية. ثم يتم الحصول على عينة جلوكوز مرجعية وتحديد مستوى الجلوكوز المراد تثبيته.

سنقوم هنا بالتثبيت عند مستوى سكر الدم أو 5 millimolar. وبعد كل عينة دم، يتم غسل الخط الشرياني بحجم صغير من محلول ملحي يحتوي على 10 units per milliliter من الهيبارين لمنع التجلط. وبعد تحديد مستوى الجلوكوز المراد تثبيته، ابدأ بتسريب محلول الإنسولين.

سجل مستوى جلوكوز الدم على فترات تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق، واضبط معدل تسريب الجلوكوز حسب الحاجة حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة. تُعد هذه العملية عموماً عملية تجربة وخطأ، وقد تستغرق ما بين 30 دقيقة وأكثر من ساعتين. ويعتمد مستوى الجلوكوز المطلوب للحفاظ على سكر الدم على البروتوكول التجريبي.

لأخذ الأنواع والظروف في الاعتبار كحالة تثبيت (clamped)، يجب أن تقع ثلاث قراءات متتالية ضمن نطاق محدد. وتشير ثلاث قراءات تتقارب فيما بينها بمقدار 1 millimolar تقريبًا إلى أن مستويات الجلوكوز قد وصلت إلى حالة مستقرة. أما معدل تسريب الجلوكوز المطلوب للحفاظ على مستوى سكر الدم لفترة 30 minute، فيمكن خلال هذا الوقت الحصول على عينات دم إضافية كحد أدنى.

يجب جمع عينة ثانية من بلازما الإنسولين وهيماتوكريت الدم بمجرد اكتمال إجراء التثبيت (clamp procedure). ويمكن استخدام الحيوانات لإجراء المزيد من الاختبارات أو قتلها رحمةً لجمع الأنسجة من أجل تحليلات إضافية. وبناءً على حالة الحيوان، يمكن أن تظل خطوط القسطرة سالكة لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام عند تنفيذها بشكل صحيح.

يمكن لإجراء الملقط (clamp procedure) قياس حساسية الإنسولين في الحالة المستقرة. ومن الضروري تسجيل مستويات الإنسولين والجلوكوز، بالإضافة إلى معدلات حقن الجلوكوز وقيم الهيماتوكريت. ويتم الوصول إلى الحالة المستقرة عندما تظل مستويات الجلوكوز ضمن نطاق 1 millimolar من بعضها البعض على مدار فترة زمنية مدتها 30 دقيقة.

يكشف معدل حقن الجلوكوز عن مستوى الجلوكوز الخارجي المطلوب للحفاظ على سكر الدم، حيث يجب تمثيل هذا المعدل بيانياً بمرور الوقت بدلاً من الاعتماد على نقطة زمنية متوسطة واحدة. كما يجب تسجيل مستويات الإنسولين في حالتي الصيام والتثبيت (clamped). وتؤكد هذه القياسات أنه تم إيصال الإنسولين بنجاح، كما ستكشف عن أي اختلافات في الاستجابة للإنسولين بين مجموعات العلاج. أما قياس مستويات الهيماتوكريت عند خط الأساس، ومرة أخرى بعد الإجراء، فيضمن عدم انخفاض المستويات بأكثر من 5% من قيمة خط الأساس على مدار التجربة عقب هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى، مثل إعطاء المتتبعات النظائرية، لتقييم استهلاك الجلوكوز في الجسم بالكامل وفي أنسجة محددة.