Microtiter تشكيل بيوفيلم الطبق الفحص
يناير 30, 2011
ويصف وسائل الفحص السريع لقياس وقت مبكر تشكيل بيوفيلم في البكتيريا والفطريات. يستخدم هذا الأسلوب لوحة microtiter كما التحتية لتشكيل بيوفيلم الميكروبية ، وبيوفيلم هو تصور استخدام الكريستال سلالة البنفسجي. في مقايسة يوفر إما فحص نوعي أو كمي لتشكيل بيوفيلم في وقت مبكر.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء ودراسة الأغشية الحيوية (biofilms) في طبق معايرة دقيق. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضافة مستنبت بكتيري إلى طبق يحتوي على 96 بئراً. بعد ذلك، يتم تحضين المستنبت في درجة الحرارة والمدة المناسبتين، وذلك بناءً على نوع الميكروب، لصبغ الغشاء الحيوي.
يتم إضافة صبغة الكريستال البنفسجي (Crystal violet) إلى كل بئر تحتوي على بكتيريا، ثم تُغسل البكتيريا. وأخيرًا، يتم تصوير الآبار وتقدير كمية البكتيريا. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر تراكم وتكوين الأغشية الحيوية (biofilms) بمرور الوقت من خلال قياس الكريستال البنفسجي.
تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في أنها تسمح للباحثين بتقييم تكوين الغشاء الحيوي الرقيق بسرعة في الكائنات البكتيرية والفطرية. كما يمكن تهيئتها لإجراء عمليات مسح جيني عالية الإنتاجية، أو لتحديد مركبات علاجية جديدة تثبط تكوين الغشاء الحيوي الرقيق. قم بتحضير مزرعة ليلية بحجم 5 mL من سلالة pseudomonas من النوع البري، أو aerogen، أو السلالة الطافرة.
في وسط LB، يتم تخفيف 10 µL من المزرعة في 1 mL من وسط M 63 الأدنى الطازج والمُدعم بالمغنيسيوم، والكبريتات، والجلوكوز، وأحماض الكازينو. بعد ذلك، وباستخدام الماصة، يتم نقل 100 µL من المزرعة المخففة إلى آبار منفصلة في طبق ذي قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً. تُحضن الصفيحة عند 37 °C لمدة تتراوح من 4 إلى 24 ساعة للسماح بنمو الغشاء الحيوي الرقيق.
بمجرد تشكل الأغشية الحيوية، أخرج الطبق من الحاضنة وتخلص من السوائل الطافية للمزرعة عن طريق قلب الطبق وهزّه لإخراج السائل. بعد ذلك، اغمر الطبق برفق في حوض صغير من الماء لغسل أي خلايا غير مرتبطة متبقية أو مكونات من الوسط قد تسبب تلوينًا خلفيًا. قم بهز الطبق للتخلص من الماء، وجففه بالتربيت، ثم كرر عملية الغسل.
بمجرد تنظيف الطبق، أضف 125 µL في كل بئر من محلول crystal violet بتركيز 0.1%. ولصبغ الخلايا، قم بحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة.
بعد ذلك، اغسل الطبق ثلاث أو أربع مرات كما تم توضيحه سابقاً. قم بتجفيف الطبق بقوة عن طريق التربيت عليه فوق مجموعة من المناشف الورقية لإزالة السوائل الزائدة بعد الغسلة الأخيرة، ثم ضع الطبق مقلوباً واتركه ليجف في هذا الوضع لبضع ساعات. وبمجرد جفاف الطبق، يمكن تصوير الآبار باستخدام كاميرا رقمية لتقييم جودة الأغشية الحيوية (biofilms).
كما هو موضح هنا، تميل البكتيريا المتحركة مثل pseudomonas aerogen على اليسار وpseudomonas fluorescence على اليمين إلى تكوين أغشية حيوية عند موقع الواجهة بين الهواء والسائل أثناء نمو الغشاء الحيوي. وفي المقابل، تقوم بكتيريا staphylococcus ora، وهي بكتيريا غير متحركة، بتكوين أغشية حيوية في قاع الآبار. ومن أجل تقدير كمية الأغشية الحيوية، أضف أولاً 125 µL من حمض الأسيتيك بتركيز 30% إلى كل بئر، بما في ذلك بئر فارغ يحتوي على حمض الأسيتيك فقط، واحضر الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة للسماح بإذابة صبغة الكريستال البنفسجي المحتجزة بواسطة الأغشية الحيوية.
بعد ذلك، انقل 125 µL من الصبغة المُذابة من كل بئر إلى صفيحة معايرة دقيقة جديدة ذات 96 بئراً وقاع مسطح. وباستخدام قارئ الصفائح، قم بقياس الامتصاصية لكل بئر عند طول موجي يبلغ 550 nm. وتتناسب تركيزات الكريستال البنفسجي في كل بئر طردياً مع عدد الخلايا في الغشاء الحيوي.
يوضح هذا الرسم البياني قياساً كمياً لتكوين الغشاء الحيوي وتراكمه بواسطة *Pseudomonas fluorescence* بمرور الوقت أثناء الحضن عند 37 °C. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مقايسة الغشاء الحيوي في طبق 96 بئراً، والتي تُستخدم بالتزامن مع طرق أخرى مثل المجهر الإلكتروني. ويمكن أن تساهم هذه الطريقة بشكل كبير في فهمنا لعملية تكوين الغشاء الحيوي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا المقايسة طريقة سريعة لقياس التكوين المبكر للغشاء الحيوي (biofilm) في البكتيريا والفطريات باستخدام لوحة معايرة دقيقة. يتم تصور الغشاء الحيوي عن طريق الصبغ بصبغة البنفسج البلوري (crystal violet)، مما يسمح بإجراء تحليل نوعي وكمي على حد سواء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأحياء الدقيقة
- أبحاث الغشاء الحيوي
- تطوير المقايسات
خلفية علمية
- الأغشية الحيوية هي مجتمعات من الكائنات الحية الدقيقة التي تلتصق بالأسطح.
- تعد دراسة تكوين الغشاء الحيوي أمراً بالغ الأهمية لفهم السلوك الميكروبي.
- البنفسج البلوري هو صبغة شائعة الاستخدام لتصوير الأغشية الحيوية.
- تسمح هذه الطريقة بالتقييم السريع لتطور الغشاء الحيوي.
الغرض من الدراسة
- لتأسيس مقايسة موثوقة لتكوين الغشاء الحيوي المبكر.
- لتقدير كمية تراكم الغشاء الحيوي بمرور الوقت.
- لتسهيل دراسة التفاعلات الميكروبية في الأغشية الحيوية.
الطرق المستخدمة
- أضف المزرعة البكتيرية إلى لوح معايرة دقيقة مكون من 96 بئراً.
- حضّن المزرعة عند درجة الحرارة والوقت المناسبين.
- أضف صبغة البنفسج الكريستالية لصبغ الغشاء الحيوي الرقيق.
- اغسل الآبار والتقط صوراً فوتوغرافية لتقدير كمية تكوين الغشاء الحيوي الرقيق.
النتائج الرئيسية
- تظهر النتائج تراكم الأغشية الحيوية بمرور الوقت.
- يمكن الحصول على بيانات كمية من خلال قياسات البنفسج البلوري.
- يوفر هذا المقايسة تصوراً واضحاً لتكوّن الغشاء الحيوي.
الاستنتاجات
- تعد هذه الطريقة فعالة لدراسة التكون المبكر للغشاء الحيوي الرقيق.
- يمكن تطبيقها على مختلف أنواع البكتيريا والفطريات.
- يعزز هذا الفحص من فهم ديناميكيات الغشاء الحيوي الميكروبي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح مقايسة تكوين الغشاء الحيوي في أطباق المعايرة الدقيقة (microtiter dish) تقييماً سريعاً وعالي الإنتاجية لتطور الغشاء الحيوي في مراحله المبكرة، مما يدعم التحقق من الأهداف في عملية اكتشاف مضادات الميكروبات. ومن خلال تحديد كمية تراكم الغشاء الحيوي عبر صبغة البنفسج البلوري (crystal violet)، توفر هذه الطريقة بيانات كمية قابلة للتكرار تساعد في تقليل المخاطر المرتبطة بالمرشحات العلاجية التي تستهدف الالتصاق الميكروبي والاستمرارية. هذا النهج القابل للتوسيع قابل للتطبيق عبر الأنظمة البكتيرية والفطرية، مما يسهل الفرز في المراحل المبكرة للمركبات المعدلة للأغشية الحيوية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تحديد الجينات والعوامل المطلوبة لبدء تكوين الغشاء الحيوي (biofilm)، مثل اللاصقات (adhesins)، والبروزات الشعرية (pili)، ومسارات cyclic-di-GMP.
- القيمة التشغيلية: تمكين التحقق من الأهداف الوظيفية من خلال فحوصات فقدان الوظيفة في السلالات الميكروبية تحت ظروف معيارية.
- القيمة التنبؤية: دعم فرز مجموعة المركبات من خلال التمييز بين المركبات التي تثبط التكوين المبكر للغشاء الحيوي وتلك التي ليس لها تأثير.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير أنظمة ميكروبية موثقة لفحص المركبات لاحقاً من خلال وضع مقاييس قابلة للتكرار لتكوين الغشاء الحيوي.
- القيمة التشغيلية: معالجة توحيد المقايسات من خلال خطوات موحدة للتحضين والصبغ والتقدير الكمي باستخدام تنسيق أطباق 96 بئراً.
- القابلية للتوسع: تسليط الضوء على الجاهزية للفحص وإعادة استخدام المنصة في الفحوصات الجينية ومكتبات المركبات عبر سلالات ميكروبية متعددة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الأهمية الانتقالية: يربط بيانات تكوين الغشاء الحيوي المبكرة بملفات المقاومة المظهرية، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية للمركبات الرائدة المضادة للميكروبات.
- الاستمرارية قبل السريرية: يتيح اتخاذ قرارات تقدم معدلة وفقاً للمخاطر من خلال ربط تثبيط الغشاء الحيوي في المختبر (in vitro) بالتحمل ضد المضادات الحيوية والمؤثرات المناعية.
- تواءم المؤشرات الحيوية: يدعم تطوير المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال مخرجات قابلة للقياس ترتبط بأنماط التحمل المظهرية المرتبطة بالغشاء الحيوي.
تكامل مسار العمل والتدفق التشغيلي
يتناسب هذا المقايسة مع سلسلة عمليات الاكتشاف بدءًا من تحديد الهدف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، لا سيما في البرامج المضادة للعدوى التي تستهدف المقاومة التي يتوسطها الغشاء الحيوي.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمسارات الالتصاق الميكروبي وتكوين الغشاء الحيوي من خلال الاضطراب الجيني والكيميائي.
- الفحص المسحي: يصف جاهزية المقايسة عبر تكوين الغشاء الحيوي الموحد والتقدير الكمي بصبغة البنفسج البلورية، مما يتيح تقييماً موثوقاً للمركبات.
- التحليلات: يسلط الضوء على قياسات الامتصاص الكمية عند 550 nm التي تسمح بمقارنة الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي عبر مختلف الظروف والسلالات.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بيانات تثبيط الغشاء الحيوي المبكرة بالأهمية قبل السريرية من خلال نمذجة آليات التحمل الملحوظة في العدوى المزمنة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يطرح هذه الطريقة كمنصة فحص قابلة لإعادة الاستخدام لبرامج مضادات الميكروبات ومضادات الفطريات ومضادات الغشاء الحيوي عبر نماذج ممرضات متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: ثقة تنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال خفض ملموس في تكوين الغشاء الحيوي (biofilm) عند التدخل الجيني أو الدوائي.
- القيمة التشغيلية: التوحيد القياسي وقابلية التكرار وقابلية التوسع عبر تنسيقات الأطباق ذات 96 بئراً للتطبيقات عالية الإنتاجية.
- القيمة الاستراتيجية: اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف في تحديد المركبات الرائدة من خلال تقليل النتائج الإيجابية الكاذبة عبر القياس الكمي المتعامد للغشاء الحيوي.
- التأثير على المحفظة: تحديد أولويات المركبات بناءً على تعديل المخاطر وفقاً للتثبيط المعتمد على الجرعة لتكوين الغشاء الحيوي المبكر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الأحياء الدقيقة في التقنيات المعقمة، وتحضير المزارع، والتعامل مع الغشاء الحيوي.
- يعتمد على توفر أجهزة قراءة الأطباق القادرة على قياس الامتصاص عند 550 nm وأطباق معايرة دقيقة قياسية ذات 96 بئراً.
- يستلزم توحيداً بين الفرق في أوقات الحضن، وخطوات الغسل، وبروتوكولات الصبغ لتقليل التباين بين الآبار.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند التوسع ليشمل كائنات غير نموذجية أو فطريات ذات خصائص التصاق مختلفة.
- يشمل قيوداً عملية مثل عدم القدرة على نمذجة بنية الغشاء الحيوي الناضج أو الأنماط الظاهرية المعتمدة على التدفق، كما ورد في المصدر.
