Name: الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: اكتشف طريقة كشف نشاط MMPs باستخدام تقنية الزيموغرافي الجيلاتيني. يتيح هذا البروتوكول تحليل إفراز الإنزيمات من خلايا أولية مزروعة وقياس كثافة الحزم إلكترونياً.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر الدكتور س. ريسلر (قسم علم الأحياء الجزيئية والخلوية ، وكلية بايلور للطب) ليشير الى ان استخدام مركزات البروتين لزيادة تركيز MMPs supernatants في ثقافة الخلية. وقد أيد هذا المشروع من المنح المقدمة من الصندوق المسنين السيدة كليفورد غراهام الابيض بحوث وهبوا NIAMS المعاهد الوطنية للصحة / (AR059838) لبناء القدرات. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر رسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. تحميل وتشغيل جل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يكون مستعدا على نحو كاف جميع العينات للحفاظ على وظيفة الأنزيمات واستخدامها على الفور بعد ان جمع أو تخزينها في المجمد -80 درجة مئوية. يجب أن العينات لا تحتوي على الحد من عوامل (مثل هذا β - المركابتويثانول) أو أن يغلى قبل تحميل هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الحقيبة التي تحتوي على مادة هلامية داخل الكاسيت ، كاسيت شطف مع الماء منزوع الأيونات. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريط الواقية من الجزء السفلي من الكاسيت والمشط من أعلى الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف ثلاث مرات مع العازلة تشغيل الآبار (مخفف ل1X في الماء منزوع الأيونات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل في الخلوي البسيطة ، وضمان أن أصغر جانب الكاسيت تواجه الداخل. القفل في مكانه مع جل إسفين التوتر. ميني سيل يسمح لتشغيل واحد أو اثنين الهلام بشكل متواز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل أعلى (في الداخل) مع الغرفة العازلة 1X فوق مستوى تشغيل الآبار ، وتحقق من وجود أي تسرب. في حالة حدوث تسرب ، وإزالة المنطقة العازلة وإعادة الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة السفلى مع 1X العازلة على التوالي. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10 ميكرولتر من علامة البروتين الجزيئي في واحدة أيضا. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج مبلغ مساو من هلام تحميل العازلة والعينة وتحميل في الآبار لاستخدام هلام هلام تحميل نصائح (تغيرت بين كل عينة). يمكن تحميل هذه الآبار مع ما يصل مجموعه إلى 20 ميكرولتر. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء على خلية صغيرة وأسلاك توصيل كهربائي لتزويد الطاقة. التبديل إمدادات الطاقة على وضعه للتشغيل عند 125 V المستمر لمدة 90 دقيقة. تحقق من تشكيل فقاعات صغيرة على السلك من مجلس النواب ، مشيرا الى التداول الحالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تشغيل هلام الأولى ، ورصد التقدم المحرز في الهجرة كل 15 دقيقة ، وذلك باستخدام اللون الأزرق bromophenol المدرجة في المنطقة العازلة تحميل كمؤشر. السماح للتشغيل حتى هلام الصبغة المؤشر يصل إلى الجزء السفلي من هلام. </li></ol> 2. Renaturing وتطوير جل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل جيل ، وإعداد 100 مل من 1X renaturing العازلة و 200 مل من تغيير طبيعة العازلة ، سواء في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تتبع bromophenol صبغة زرقاء تصل إلى الجزء السفلي من هلام ، والتبديل إمدادات الطاقة إيقاف ، افتح الخلية البسيطة ، وإزالة هلام. فصل الجانبين من الكاسيت باستخدام سكين هلام (أو ملعقة وزنها). قطع الزاوية للاحتفال في اتجاه الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الجل من الكاسيت ووضع في وعاء مع 100 مل renaturing العازلة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة renaturing وإضافة 100 مل من تطوير العازلة إلى هلام. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة النامية وإضافة أكثر من 100 مل العازلة النامية إلى هلام. يحضن بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة النامية وشطف ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) مع الماء منزوع الأيونات في إطار التحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح هلام لحفظ المواقع الدقيقة للفرق القياسية البروتين لأنها سوف تصبح أقل وضوحا أو لا بعد تلطيخ هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الجل وذلك بإضافة 20 مل من Safestain SimplyBlue إلى هلام. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة SafeStain SimplyBlue وإزالة وصمة عار في جل 100 مل أو أكثر منزوع الأيونات الماء لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على أفضل النتائج ، مع استبدال الماء منزوع الأيونات الطازجة واحتضان لمدة ساعة أو أكثر في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li></ol> 3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الجل من الماء ووضعه في حامية ورقة من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح هلام مع دقة 300 نقطة في البوصة أو أعلى. حفظ الصورة بتنسيق TIFF (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة الموجات مع ImageJ (أو برامج أخرى مشابهة). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف TIFF في ImageJ (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور بالأبيض والأسود عن طريق اختيار "&gt; صورة نوع&gt; 8 بت" (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة التحديد المستطيل لمخطط الفرقة الأولى ، رسم مستطيل على الأقل مرتين أعلى مما هو عليه واسعة (وهذا هو شرط البرمجيات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على "1" أو حدد "تحليل&gt; الهلام&gt; تحديد المسار الأول" سيتم تحديدها ، والفرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف يظهر مستطيل جديدة ، نقله إلى الفرقة القادمة ، وحدد "تحليل&gt; الهلام حارة تحديد&gt; المقبلة". تكرار حتى يتم تحديد جميع نطاقات (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على "3" أو حدد "تحليل&gt; الهلام مسارب الأرض&gt;" لإنشاء ملف لكل مؤامرة فرقة (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار استخدام خط مستقيم (يجب أن يكون بالفعل تحديد تلقائيا) لرسم خطوط الأساس بحيث ذروة الفائدة هي منطقة مغلقة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد أداة العصا فوق وداخل كل الذروة لتحديده. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد "تحليل&gt; الهلام قمم تسمية&gt;" للحصول على طاولة المفاوضات مع كل منطقة لتحديد الذروة. يمكن رسم هذه البيانات على هذا النحو (Fويمكن تطبيع igure 1D) أو إلى قيمة الشريط الذي تم اختياره. هذا التطبيع مهم خصوصا عندما تجمع القيم من المواد الهلامية نسخ عديدة لتحديد الدلالة الإحصائية للنتائج. </li></ul></li></ol> 4. ممثل النتائج نظهر هلام مع 11 بئرا محملة supernatants ثقافة مختلفة الخلية التي تحتوي على كميات مختلفة من MMP - 2 (الشكل 1A). الملاحظة المباشرة لهذا الهلام يظهر اختلافات واضحة في MMP - 2 التركيزات بين بعض الآبار. على سبيل المثال ، فإنه من الواضح أن آبار # 4 و 5 تحتوي على أكثر بكثير من MMP - 2 جيدا أو جيدا # 11 حتى 10 #. الهدف من القياس الكمي للنطاقات استخدمنا قياس كثافة مع برنامج ImageJ (الشكل 1B - D) ، مؤكدا وجود فرق ما يقرب من 4 أضعاف في MMP - 2 كميات جيدة بين 11 و # # الآبار 4 و 5 و فرق ما يقرب من 2 أضعاف في MMP - 2 كميات جيدة بين # 10 # والآبار 4 و 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. الكشف عن MMP - 2 بواسطة zymography الجيلاتين. صورة ، الممسوحة ضوئيا من جل الجيلاتين. وأشارت الأرقام بشكل جيد في الجزء العلوي من هلام. ب ، الجل نفسه كما في هو موضح في بالأبيض والأسود لقياس كثافة. وقد تم اختيار كل الفرقة مع مستطيل في ImageJ. C ، وهناك مثالان لمحات عن كثافة الجل هو مبين في ألف وباء (العصابات # # 4 و 11). وقد رسم خط مستقيم عند قاعدة كل الذروة إلى إنشاء منطقة مغلقة. D قطعة من المناطق الذروة للهلام هو مبين في ألف وباء التطبيع (يمين) قبل (يسار) وبعد أن كثافة الفرقة رقم 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2 ، وهذا الرقم يوضح كيف يمكن استخدام zymography كأسلوب نصف الكمية. وقد حملت لنا التخفيفات المتسلسلة (الخطوات من التخفيفات 01:01) في 7 آبار على التوالي ، وقياس كثافة الموجات على حد سواء المؤيدة - 2 - MMP و MMP - 2.

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
<li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+regulators+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li>
<li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li>
<li>Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metallopreoteinases%3A+what+do+they+not+do%3F+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li>
<li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+%28TIMPs%29%3A+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li>
<li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+activities%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li>
<li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li>
<li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+activity+assays%3A+importance+of+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li>
<li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+zymography%3A+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li>
<li>Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد أثبتت لنا كيفية تنفيذ تحليل zymographic من MMP - 2 في supernatants ثقافة الخلية. يجب تحديد كمية العينة ليتم تحميلها اعتمادا على هلام تجريبيا في الأصل وMMP من الفائدة. قد تحميل القليل جدا سوف يمنع الكشف أثناء تحميل الكثير يؤدي إلى تشبع وهناك ركيزة فقط بقدر ما هو البروتيني يمكن هضم في مجال الفرقة. يمكن إذا لزم الأمر ، يمكن أن تضعف العينة في الماء منزوع الأيونات قبل الاختلاط العازلة التحميل أو الوقت النامية من خفض دي بين عشية وضحاها إلى 4 ساعات. ومن الممكن أيضا أن تركز البروتينات في حل باستخدام مركزات (مثل ميليبور التسويقي UFC803024 #). إذا نطق تبقى مرئية بالكاد ، قد يكون من الضروري لتطوير المواد الهلامية لفترة أطول من الزمن ، حتى تصل إلى 48 ساعة. عند إعداد عينات من supernatants زراعة الأنسجة ، ينبغي الإشارة إلى أن مصل بقري جنيني (والأمصال الأخرى) يحتوي على MMPs التي يمكن أن تؤثر على النتائج. لهذا السبب ، نقوم بجمع كافة supernatants لدينا ثقافة في المصل بعد خالية من المتوسط. ويغسل وصفها في الفقرتين 2.9 و 2.10 للبروتوكول ضرورية لإزالة الخلفية من تلطيخ العصابات هضمها. وسوف يعد مرات غسل إزالة أكثر الخلفية ، ولكن قاتمة أيضا تلون الركيزة في جميع أنحاء هلام. إذا غسل أوقات أطول ضرورية ، نوصي مسح هلام كل بضع ساعات لتحديد تفحص مع أفضل التباين. ويمكن استخدام هذه التقنية لكشف MMPs الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن الكشف عن MMP - 9 على الجيلاتين الهلام ، وأيضا إلى انخفاض مدى MMP - 1 ، MMP - 8 ، 13 - MMP والجيلاتين وليس الركيزة المفضل لديهم. تم الكشف عن أفضل MMP - 1 و MMP - 13 على zymography الكولاجين بينما الكازين هو الركيزة المفضل لMMP - 11 ويسمح أيضا للكشف عن MMP - 1 ، MMP - 3 ، MMP - 7 ، MMP - 12 ، و 13 - MMP 9. MMP - 7 (matrilysin) وcollagenases (MMP - 1 و MMP - 13) يصعب الكشف عندما تكون موجودة عند مستويات منخفضة في الكازين المواد الهلامية أو الجيلاتين. إضافة إلى نموذج الهيبارين في وقت التحميل جل تحسن كبير في الحد من الكشف عن MMP - 7. لMMP - 1 و 13 - MMP ، والهيبارين يحتاج إلى إضافته إلى هلام بعد تشغيل الكهربي جار بالفعل 12. منذ zymography تدابير النشاط الأنزيمي بعد تمسخ واستعادة الطبيعة من الإنزيمات ، فإنه سيتم قياس نشاط كل MMPs موجودة في العينة. وتشمل هذه الانزيمات ، والانزيمات المؤيدة ، والانزيمات منضمة إلى مثبطات الذاتية (على سبيل المثال TIMP - 2). ومع ذلك فمن الممكن لتحديد مستوى التنشيط MMP في العينة من خلال مقارنة الكثافة عصابة من الإنزيم النشط وذلك لإنزيم للمحترفين ، والتي سوف يكون لها وزن جزيئي أعلى قليلا. Zymography غالبا ما تكون غير كافية لتحديد هوية MMP. مقارنة بين مستوى الهجرة من MMP مع معايير معروفة الوزن الجزيئي لا يساعد في تحديد الهوية ولكن تجدر الإشارة إلى أن بعض هذه المعايير تتضمن خفض عامل ، وأنه عندما تستخدم في ظل عدم الحد من الظروف التي قد تشير إلى أوزان جزيئية مختلفة 9. الخيار هو لتحميل MMP المؤتلف للذوبان في هلام نفس عينات الاختبار. ولكن قد تكون مرتبطة MMPs مع بروتينات أخرى ، الأمر الذي أدى إلى تغيير في الوزن الجزيئي واضح. يمكن إضافة مثبطات انتقائية لMMP الجل (أو جزء من قطع هلام في نصف) خلال حضانة في المخزن النامية كأدوات الدوائية للهوية يوصى MMP تقنية interest.A الثاني (الغربية وصمة عار ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، أو ELISA) ل المساعدة في تحديد هوية MMP من الفائدة. وتجدر الإشارة إلى أن حدود الكشف عن البقع الغربية غالبا ما تكون أقل بكثير من تلك المواد الهلامية zymographic ، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة عند استخدام هذه التقنية.

<table><tbody><tr><td>جهاز الفصل الكهربائي Xcell SureLock Mini-Cell الحاصل على علامة CE</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>مزود الطاقة (موديل 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>هلامات Novex لعمل تخطيط إنزيمي بالجيلاتين بتركيز 10%، 1.0 ملم، 12 بئراً</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>محلول تحميل الهلام Blue Juice</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>رؤوس تحميل الهلام (Gel loading tips)</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>معيار الوزن الجزيئي للبروتين</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>محلول التشغيل Novex Tris-Glycine-SDS</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>محلول إعادة الطبيعة لنمط الزيموجرام من Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>محلول تطوير الزيموجرام من Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>صبغة SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>الماسح الضوئي للصور Epson Perfection 4490</td><td>أمازون</td><td>لم يتوفر نص للترجمة. يرجى تزويدنا بالمحتوى المراد ترجمته.</td><td></td></tr><tr><td>برنامج ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>لا ينطبق</td><td>تأليف: دبليو. راسباند، معاهد الصحة الوطنية/ المعهد الوطني للصحة العقلية (NIH/NIMH)</td></tr></tbody></table>

الكشف عن مصفوفة metalloproteinases الوظيفية التي zymography

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

metalloproteinases المصفوفة (MMPs) هي التي تحتوي على الزنك endopeptidases. انها تتحلل البروتينات التي تشطر سندات ببتيد. وقد تم تحديد أكثر من عشرين MMPs ويتم فصل إلى ست مجموعات على أساس بنيتها التحتية ونوعية (collagenases ، gelatinases ، نوع الغشاء [MT - MMP] ، stromelysins ، matrilysins ، وغيرها). MMPs تلعب دورا حاسما في غزو الخلية ، وتدهور الغضاريف ، إعادة تشكيل الأنسجة والتئام الجروح ، والتخلق. ولذلك كانت تشارك في كل العمليات الطبيعية والمرضية في كثير من الأمراض ، مثل التهاب المفاصل الروماتيزمي ، والسرطان ، أو مرض الانسداد الرئوي المزمن 1-6. هنا ، سوف نركز على MMP - 2 (جيلاتيناز A ، النوع الرابع كولاجيناز) ، وأعرب عن MMP على نطاق واسع. سوف نقوم شرح كيفية الكشف عن MMP - 2 في خلية ثقافة supernatants zymography ، وهي شائعة الاستخدام ، وتقنية بسيطة ، وحتى الآن حساسة للغاية لأول مرة في عام 1980 من قبل المجلس التنفيذي وHeussen جيم Dowdle 70-10. هذا الأسلوب هو نصف الكمية ، ويمكن بالتالي استخدامها لتحديد مستويات MMP في عينات الاختبار عندما يتم تحميل تركيزات المعروفة MMP المؤتلف على نفسه جل 11. يتم تحميل محاليل تحتوي على MMPs (مثل supernatants خلية ثقافة والبول ، أو مصل) إلى مادة هلامية تحتوي على كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد دوديسيل (SDS ؛ ليصبح خطي البروتينات) ، والجيلاتين (الركيزة لMMP - 2). تم تصميم العينة عازلة لزيادة اللزوجة عينة (لتسهيل التحميل هلام) ، وتوفير صبغة التتبع (أزرق bromophenol ؛ لمراقبة الهجرة العينة) ، وتقديم الجزيئات تغيير طبيعة (ليصبح خطي البروتينات) ، والتحكم في درجة الحموضة في العينة. ويسمح للبروتينات ثم إلى الهجرة تحت تيار كهربائي في منطقة عازلة مصممة لتوفير تشغيل معدل الهجرة المستمرة. يرتبط ارتباطا عكسيا المسافة للهجرة مع الوزن الجزيئي للبروتين (بروتينات صغيرة تتحرك بشكل أسرع من خلال هلام من البروتينات ، وبالتالي لا كبيرة ترحيل مزيد من أسفل الجل). بعد الهجرة ، ويتم وضع الجل في renaturing عازلة للسماح للبروتينات لاستعادة بنيتها العالي ، واللازمة لنشاط الأنزيمي. ثم يتم وضع الجل في منطقة عازلة مصممة النامية للسماح للبروتياز لهضم ركيزة لها. المخزن يحتوي أيضا على تطوير ف aminophenylmercuric خلات (APMA) لتنشيط بروتين غير الموالية للMMPs في MMPs النشطة. الخطوة التالية يتكون من تلطيخ الركيزة (الجيلاتين في مثالنا). بعد غسل الصبغة قبالة هلام ، ومجالات الهضم البروتيني تظهر الفرق واضح. وأوضح الفرقة ، وأكثر تركيزا على البروتياز التي يحتوي عليها. ويمكن بعد ذلك الفرقة كثافة تلوين تحددها كثافة ، وذلك باستخدام برامج مثل ImageJ ، مما يسمح للمقارنة العينة.

يصف هذا البروتوكول مقايسة على أساس النشاط لاكتشاف metalloproteinases مصفوفة في supernatants الثقافة أو سوائل الجسم.

الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography

تعد البروتينات المعدنية المصفوفية (MMPs) إنزيمات ببتيداز داخلية تحتوي على الزنك، وهي تعمل على تحلل البروتينات عن طريق شطر الروابط الببتيدية. وقد تم تحديد أكثر من عشرين نوعاً من البروتينات المعدنية المصفوفية...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن إنزيمات ميتالوبروتياز المصفوفة الوظيفية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير العينة للتحليل الكهربائي عن طريق إضافة منظم تحميل خالٍ من العوامل المختزلة. بعد ذلك، يتم تحميل هلام ZY Graham gel بالعينة ويُترك ليعمل حتى يصل صبغ التتبع إلى نهاية الهلام.بعد عملية الفصل الكهربائي، يتم استعادة الطبيعة الأصلية للهلام، ثم تحميضه، وتلوينه، وإزالة اللون منه. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في مسح الهلام ضوئياً لتحليل البيانات. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح نشاط matrix metalloproteinase في العينات من خلال تحليل كثافة الحزم.مرحباً، أنا من مختبر الدكتورة Kristin bitten في قسم الفسيولوجيا الجزيئية والفيزياء الحيوية في كلية الطب LER. سنعرض لكم اليوم إجراءً للكشف عن البروتينات المعدنية المصفوفة (matrix metalloproteinases) بواسطة تقنية zymography. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة البروتينات المعدنية المصفوفة التي تفرزها الخلايا الأولية المستنبتة.لنبدأ الدراسة. قبل البدء بهذا البروتوكول، قم بتحضير جميع ميتالوبروتينيز المصفوفة أو MMPs بشكل مناسب للحفاظ على وظيفة الإنزيمات. يمكن استخدام العينات فوراً أو تخزينها عند درجة حرارة -80 °C.هنا، يُستخدم MMP two، المعروف أيضاً باسم gelatinize A أو type four collagenase، لتوضيح تصور نشاط MP باستخدام synography. بمجرد تحضير إنزيمات MMP، احصل على كيس هلام gelatin zy gram بنسبة 10% يحتوي على هلام داخل كاسيت. اشطف الكاسيت بالماء منزوع الأيونات.قم بإزالة الشريط الواقي من أسفل الكاسيت والمشط من أعلى الهلام. اشطف الآبار ثلاث مرات باستخدام tris glycine SDS running buffer.ضع الهلام في جهاز الفصل الكهربائي للخلية الصغيرة (mini cell electrophoresis apparatus) مع التأكد من أن الجانب الأصغر من الكاسيت موجه للداخل. ثبّت الهلام في مكانه باستخدام إسفين شد الهلام. املأ الحجرة العلوية للجهاز بمحلول التشغيل tris glycine SDS buffer بحيث يتجاوز مستوى الآبار، ثم تحقق من عدم وجود أي تسريبات.املأ الحجرة السفلية لجهاز الفصل الكهربائي للهلام (gel electrophoresis) بمحلول التشغيل (running buffer) أيضاً. بعد ذلك، قم بتحميل 10 µL من مؤشر الوزن الجزيئي للبروتين. اخلط كمية مساوية من العينة مع محلول تحميل الهلام (gel loading buffer) الذي لا يحتوي على عوامل مختزلة.على عكس تقنية SDS page العادية، لا تقم بغلي العينات، وبدلاً من ذلك، قم بتحميلها مباشرة في آبار الهلام. وباستخدام رؤوس تحميل الهلام، يمكن لهذه الآبار استيعاب حجم يصل إلى 20 microliters. ضع الغطاء على الخلية الصغيرة وقم بتوصيل أسلاك القطب الكهربائي بمصدر الطاقة.قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط الهلام ليعمل بجهد ثابت قدره 125 volts لمدة 90 دقيقة. تحقق من تكون فقاعات صغيرة على سلك الغرفة السفلية، مما يشير إلى تدفق التيار عند التشغيل في الهلام الأول. راقب تقدم عملية الهجرة كل 15 دقيقة باستخدام bromo phenol blue الموجود في محلول التحميل كمؤشر لكل هلام.قم بتحضير 100 ملليلتر من منظم رينا (Rena buffer) بتركيز xmo جرام، و200 ملليلتر من منظم التظهير (developing buffer) بتركيز xmo جرام، وكلاهما في ماء منزوع الأيونات. عندما تصل صبغة التتبع برومو فينول بلو (bromo phenol blue) إلى أسفل الهلام، قم بإيقاف تشغيل مزود الطاقة. افتح الخلية الصغيرة (mini cell) وأخرج الهلام.افصل جانبي الكاسيت. وباستخدام سكين الجل، قم بقص زاوية لتحديد اتجاه الجل. أخرج الجل بعناية من الكاسيت وضعه في وعاء يحتوي على 100 milliliters من Rena Buffer.قم بتحضين الهلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف، ثم قم بإزالة محلول Rena المنظم وأضف 100 milliliters من محلول التظهير المنظم إلى الهلام. يتم التحضين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف. بعد ذلك، قم بإزالة محلول التظهير المنظم وأضف 100 milliliters إضافية من محلول تظهير منظم جديد إلى الهلام.يُحضن الهلام طوال الليل عند 37 درجة مئوية. وبعد انتهاء فترة التحضين، يُزال محلول التظهير ويُغسل الهلام عن طريق تحضينه في ماء منزوع الأيونات مع الرج اللطيف. كرر عملية الغسل هذه مرتين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.ضع الهلام على واقية ورقية بلاستيكية وقم بإزالة الفقاعات. ثم قم بمسح الهلام ضوئيًا باستخدام ماسح ضوئي للصور لحفظ الموضع الدقيق لنطاقات المعيار البروتيني، حيث ستصبح بالكاد مرئية بعد صبغ الهلام.قم بصبغ الهلام بإضافة 20 milliliters من صبغة simply blue safe إلى الهلام. حضّن الهلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وتحت تأثير رجّ خفيف، قم بإزالة صبغة simply blue safe واغسل الهلام في 100 milliliters من الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة تحت تأثير رجّ خفيف.بعد مرور ساعة واحدة، استبدل الماء بماء منزوع الأيونات جديد وواصل تحضين الهلام لمدة ساعة واحدة على الأقل. ولتحليل البيانات باستخدام قياس التدفق الخلوي، قم أولاً بإزالة الهلام بعناية من الماء وضعه في غلاف بلاستيكي واقٍ. وباستخدام ماسح ضوئي، قم بمسح الهلام بدقة 300 نقطة في البوصة أو أعلى.احفظ الصورة بتنسيق TIFF. افتح ملف TIFF في برنامج Image J أو أي برنامج قياس كمي مماثل لقياس كثافة النطاقات. اعرض الصورة باللونين الأبيض والأسود عن طريق اختيار نوع الصورة ثمانية بت (eight bit).استخدم أداة التحديد المستطيلة لتحديد النطاق الأول عن طريق رسم مستطيل يكون ارتفاعه على الأقل ضعف عرضه. اختر "analyze gels". اختر "first lane"، وسيتم تحديد النطاق.بعد ذلك، سيظهر مستطيل جديد. قم بتحريكه إلى النطاق التالي واختر "Analyze gels"، ثم اختر "next lane". كرر هذه العملية حتى يتم تحديد جميع النطاقات.حدد خيار "analyze gels plot lanes" لإنشاء مخطط الملف الشخصي لكل حزمة. استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لرسم خطوط الأساس بحيث تكون القمة المستهدفة منطقة مغلقة تماماً. حدد أداة العصا السحرية (wand tool) وانقر داخل كل قمة لتحديدها.اختر "analyze gels" ثم "label peaks" للحصول على جدول يتضمن المساحة لكل قمة محددة. يمكن رسم هذه البيانات كما هي أو يمكن تطبيعها (normalization) بناءً على قيمة حزمة مختارة. ويُعد هذا التطبيع هاماً بشكل خاص عند تجميع القيم من عدة هلامات مكررة لتحديد الدلالة الإحصائية للنتائج.تم تحميل كل بئر من الهلام الموضح هنا بمستنبت خلوي مختلف. يحتوي السائل الطافي على كميات مختلفة من MMP two. وتظهر الملاحظة المباشرة لهذا الهلام اختلافات واضحة في تركيزات MMP two بين بعض الآبار.على سبيل المثال، من الواضح أن كلاً من البئرين الرابعة والخامسة تحتويان على كمية أكبر بكثير من MMP two مقارنة بالبئرين 10 و11 من أجل التحديد الكمي الموضوعي للنطاقات. وقد استُخدم قياس الكثافة الخلوية باستخدام برنامج Image J، والذي أظهر وجود فرق تقريبي بمقدار أربعة أضعاف في mmp.تم رصد كميتين بين البئر 11 والبيرين الرابعة والخامسة. وبالمثل، لوحظ فرق بمقدار ضعفين في كميات MMP2 بين البئر 10 والبيرين الرابعة والخامسة. نحن نقوم فقط بتوضيح كيفية الكشف عن المقاييس الوظيفية.تستمر المعادن بواسطة xog. عند إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر عدم غلي العينة؛ وإلا فلن تتمكن من رؤية أي حزم على الهلام.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجربتكم.

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذه المادة ونحن وصف استخدام ملاقط المغناطيسي لدراسة تأثير القوة على التحلل البروتيني الأنزيمية على الصعيد جزيء واحد بطريقة موازاة للغاية.

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء تصوير الزيموغرافيا ، وهي تقنية كهربائية ، لتحليل النشاط المحلل للبروتين داخل العينات البيولوجية.

التصوير بالزيموغرافية للببتيد الفلوري: تقنية معدلة للكشف عن نشاط البروتياز باستخدام ركائز الفلورية في المواد الهلامية للزيموغرام

&lt; p class = "jove_content"&gt;يوضح هذا الفيديو تقنية الرحلان الكهربائي للهلام الزيموغرافيا لتقييم نشاط البروتينات المعدنية المصفوفة (MMPs) الموجودة في طافي زراعة الخلايا. تعمل MMPs النشطة على تدهور الركيزة الخاصة ب MMP المضمنة في هلام بولي أكريلاميد ، والذي يظهر على شكل أشرطة شفافة على خلفية ملطخة داكنة بعد التلوين.

الرحلان الكهربائي للهلام بالزيموغرافيا: تقنية كهربائية للكشف عن البروتينات المعدنية المصفوفة من خلال تقييم النشاط الأنزيمي

يمثل قياس كتلة دقيقة خطوة هامة أثناء التحقيق في البروتينات. بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين (MALDI) مطياف الكتلة (MS) يمكن استخدامها لمثل هذا القرار والميزة الرئيسية له هو التسامح إلى الأملاح والمنظفات والملوثات. نحن هنا توضيح نهج الوصول إليها لتحليل البروتينات أكبر من 100 كيلو دالتون بواسطة MALDI-MS.

بمساعدة مصفوفة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة (MALDI-TOF) قداس التحليل الطيفي من البروتينات سليمة أكبر من 100 كيلو دالتون

يصف هذا البروتوكول كيفية إعداد مصفوفة مختلطة 2D، تتكون من الجيلاتين والكولاجين الأول، وكولاجين 3D أنا سد لدراسة إنفادوسوم الخطي. هذه البروتوكولات تسمح لدراسة تشكيل إنفادوزوم الخطي، نشاط تدهور مصفوفة، وقدرات الغزو من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا السرطانية.

2D و 3D مصفوفات لدراسة إنفادوسوم الخطي تشكيل والنشاط

هنا، نقدم بروتوكول لتحديد خصوصية حوزتي في النسيج الخام الماوس مقتطفات استخدام TOF استخدام قياس الطيف الكتلي.

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية زيموجرافيك معدلة التي تستخدم الببتيدات فلوري كالركيزة القابلة للتحلل بدلاً من البروتينات الأصلية. التفريد العينات البيولوجية في الببتيد نيون زيموجرامس تمكن من كشف طائفة أوسع من البروتياز تقنيات زيموجرافيك السابقة.

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

ويرد هنا، بروتوكولا لتغليف واستزراع الخلايا في الهلاميات المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) فونكتيوناليزيد مع أية مصفوفة فلوروجينيك (MMP)-الببتيد القابلة للتحلل. يتم قياس MMP الخلوية والنشاط الأيضي مباشرة من الثقافات المائية باستخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية.

قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D

يتم استخدام تنقية علامته وغسيل الكلى والتنشيط لزيادة غلة التعبير عن بروتين المجال الحفاز ميتالوبروتيناز-3 القابل للذوبان والنشط في البكتيريا. يتم تحليل كسور البروتين عبر المواد الهلامية SDS-PAGE.

التعبير البكتيري وتنقية ميتالوبروتيناز المصفوفة البشرية -3 باستخدام كروماتوغرافيا التقارب

البروتينات حيوية للتسبب في المرض البكتيري ، مما يتيح الغزو والتهرب المناعي. يعد الاستخراج أحادي الخطوة للبروتينات السيتوبلازمية والغشائية للبكتيريا في شكلها النشط أمرا مروعا. توضح مقالة الفيديو هذه استخراج البروتينات الخلوية الكاملة من Leptospira لتحليل الزيموغرافيا لاكتشاف وتوصيف الجيلاتيناز.

الاستخراج بخطوة واحدة والتحليل الزيموغرافي للجيلاتينات البكتيرية

اكتشف طريقة كشف نشاط MMPs باستخدام تقنية الزيموغرافي الجيلاتيني. يتيح هذا البروتوكول تحليل إفراز الإنزيمات من خلايا أولية مزروعة وقياس كثافة الحزم إلكترونياً.

الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography

استكشف المزيد من الفيديوهات