تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

يهدف هذا البروتوكول المرئي إلى عزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من دماغ جنين الفأر باستخدام مقايسة الكرات العصبية. تتضمن العملية جمع أجنة الفئران في اليوم الجنيني E 14، يليه التشريح الدقيق للدماغ لجمع البروزات العقدية، وتفكيك الأنسجة التي تم جمعها للحصول على معلق من الخلايا المفردة، وأخيراً زراعة الخلايا في مستنبت الكرات العصبية. مرحباً، أنا حسن علي من مختبر الدكتور برينت فرينيلز في معهد ميت للدماغ بجامعة فلوريدا.

سأوضح لكم اليوم كيفية إنشاء مزرعة كرات عصبية من دماغ جنين الفأر باستخدام مقايسة الكرات العصبية. نحن نستخدم هذه المقايسة بشكل روتيني في مختبرنا لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية. حسنًا، لنبدأ.

قم بتخدير فأرة حامل في وقت تزاوج محدد. وفي اليوم 14 من فترة الحمل، قم بإجراء خلع عنقي واغسل البطن بـ 70% ethanol. أمسك الجلد الموجود فوق البطن باستخدام ملقط كبير، ثم قص الجلد واللفافة الكامنة تحته باستخدام مقص كبير.

لكشف التجويف البطني وقرني الرحم، قم بإزالة قرني الرحم اللذين يحتويان على الأجنة وانقلهما إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ml يحتوي على محلول hem بارد. وبعد نقل أنسجة الرحم إلى غطاء التدفق الصفائحي (PC two hood)، قم بإزالة محلول hem من الأنبوب سعة 50 ml واشطف الأنسجة بحجم كافٍ من محلول hem بارد وطازج لإزالة الملوثات مثل الدم والشعر، وكرر هذه العملية من مرتين إلى ثلاث مرات. ثم انقل أنسجة الرحم إلى طبق بتري بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على محلول hem بارد.

افتح قرني الرحم باستخدام ملقط منحني صغير ومقص، وانقل الأجنة إلى طبق جديد يحتوي على وسط hem بارد. كرر هذا الإجراء حتى يتم جمع جميع الأجنة، ثم ضع الأجنة تحت مجهر التشريح.

افصل رؤوس الأجنة عند مستوى النخاع الشوكي الرقبوي وانقلها إلى طبق بتري آخر يحتوي على محلول hem بارد. ثبت الرأس باستخدام ملقط منحني دقيق مع استخدام مقصات مجهرية. أولاً، قم بإجراء قطع أفقي فوق الأنف، ثم تابع القطع في الخط المتوسط من الجبهة باتجاه الجزء الخلفي من الرأس.

تأكد من القطع عبر الجلد والجمجمة دون إلحاق ضرر بالدماغ الموجود تحتهما. قم بإزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق دفع حواف المقطع المقطوع بحركة خلفية باستخدام الملاقط المنحنية. استمر في تنفيذ هذا الإجراء حتى يتم إزالة جميع الأدمغة من الجماجم.

ثبّت الدماغ بإحكام باستخدام الملقط المنحني بحيث يكون الجانب الظهري مواجهًا للأعلى، ثم استخدم مقصًا دقيقًا للقص عبر القشرة في كل نصف كرة مخية من البصيلات الشمية إلى الجزء الخلفي من نصف الكرة المخية. وللكشف عن البروزات العقدية، مع تثبيت الدماغ في مكانه، قم بتشريح البروز العقدي بأكمله باستخدام ملقط بزاوية 45 درجة وانقله إلى طبق بتري آخر. يظهر البروز العقدي بوضوح هنا بأجزائه الإنسية والجانبية.

بدلاً من ذلك، يمكنك تشريح البروزات العقدية عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة باستخدام ملقط دقيق. كما يمكنك قطع البروز بالكامل إلى نصفين، إنسي وجانبي، إذا كنت مهتماً بتنمية خلايا من أي من هاتين المنطقتين.

كرر هذا الإجراء حتى يتم إجراء التشريح المجهري لجميع الأدمغة. استخدم 1 mL من وسط الخلايا الجذعية العصبية لجمع قطع الأنسجة ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL. اترك تكتلات الأنسجة تترسب في أنبوب الـ 15 mL لضمان عدم ترك أي أنسجة خلفك.

قم بإزالة جزء من الوسط الطافي واغسل قاعدة طبق بيتري لنقل أي أنسجة إضافية إلى أنبوبة سعة 15 مل. ضع طرف الماصة مقابل قاع الأنبوبة، ثم قم بماص السائل للأعلى وللأسفل من ثلاث إلى أربع مرات لتفتيت الأنسجة والحصول على معلق من الخلايا المفردة.

بعد ذلك، اترك المعلق يترسب لمدة دقيقة واحدة حتى تترسب التكتلات غير المرتبطة، ثم انقل معظم معلق الخلايا إلى أنبوب آخر سعة 15 ml. ثم أضف 1 ml من وسط زراعة الخلايا الجذعية العصبية (neuro stem cell medium) إلى التكتلات المتبقية وفككها إلى خلايا مفردة. اسحب محتويات الأنابيب.

بعد ذلك، قم بطرد المعلق مركزياً بسرعة 700 RPM أو 110 G لمدة خمس دقائق. أزل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 1 milliliter من وسط زراعة الخلايا الجذعية العصبية الكامل. خذ 10 µL من معلق الخلايا واخلطها جيداً مع 90 µL من صبغة tripan blue.

ثم خذ 10 µL من هذا المعلق وانقله إلى مقياس كرات الدم (hemocytometer). قم بإجراء عدّ للخلايا. انقل إجمالي 20 ml من الوسط الغذائي الكامل للخلايا الجذعية العصبية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ml من أجل زراعة قارورة واحدة من نوع T 80.

بعد ذلك، اخلط معلق الخلايا وأضف كمية مناسبة من الخلايا لتحقيق كثافة إجمالية تبلغ 200,000 خلية لكل milliliter أو 4 ملايين خلية لكل قارورة T 80. أضف EGF بتركيز نهائي قدره 20 nanograms per milliliter. اخلط الخلايا الموجودة في وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل مع عامل النمو، ثم انقل معلق الخلايا إلى قوارير T 80.

ضع ملصقاً على الدورق وافحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من الحصول على معلق خلوي أحادي دون وجود تكتلات نسيجية. انقل الدورق إلى حضانة عند 37 °C مع 5% CO2 لمدة خمسة إلى سبعة أيام. بعد مرور خمسة إلى سبعة أيام، قم بتقييم الدورق تحت المجهر.

بحلول هذا الوقت، تكون الكرات العصبية قد تشكلت، ويجب أن يتراوح قطرها بين 150 إلى 200 ميكرون وتصبح جاهزة للاستزراع الثانوي. اجمع محتويات الدورق في أنبوب زراعة أنسجة معقم وبحجم مناسب، ثم قم بمركزة الأنبوب وتخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الكرات في 1 ملليلتر من التريبسين المُدفأ مسبقاً وضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

ثم أضف حجماً مساوياً من مثبط التريبسين واخلط المزيج جيداً ولكن بلطف لإيقاف نشاط التريبسين. قم بالطرد المركزي مرة أخرى وأزل السائل الطافي. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 1 Milliliter من وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل وقم بإجراء عد للخلايا كما ذكر سابقاً. ومن أجل زراعة دورق T 1 75 واحد، انقل إجمالي 40 mls من وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ml.

ثم اخلط الخلايا وأضف كمية مناسبة منها للوصول إلى كثافة إجمالية تبلغ 50,000 خلية لكل M أو 2 مليون خلية لكل قارورة T 1 75. بعد ذلك، أضف EGF بتركيز نهائي قدره 20 nanograms per mil. اخلط الخلايا الموجودة في وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل مع عامل النمو، ثم انقل معلق الخلايا إلى قارورة T 1 75.

قم بتسمية القارورة ونقلها إلى الحاضنة لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام. هذا مثال على المزرعة الأولية للخلايا الجذعية العصبية E 14. بعد ثلاثة أيام من الزرع، تشير الأسهم إلى تجمعات متكاثرة من الخلايا الجذعية العصبية.

يمكنك أيضاً رؤية خلايا ملتصقة بالركيزة ومتمايزة. هذا مثال على مزرعة خلايا جذعية عصبية أولية E 14 بعد سبعة أيام من الزراعة. وكما يتضح، هناك كرات بأحجام مختلفة.

هناك أيضًا خلايا متمايزة. وتكون كمية الحطام أقل بكثير مما هي عليه في مستنبتات الكرات العصبية الأولية للبالغين. كما أن الكرات ليست متكتلة وتظهر حول محيطها نتوءات دقيقة تشير إلى أن الكرات سليمة وحيوية.

يجب عدم السماح للكرات بالنمو بشكل زائد، لأنها قد تصبح داكنة اللون بسبب موت الخلايا في المركز. كما قد تلتصق الكرات الكبيرة بالركيزة وتتمايز. هذا مثال لكرات عصبية E 14 من الممر الأول بعد خمسة أيام من الزرع.

هنا مرة أخرى، يمكنك رؤية النتوءات الدقيقة عند محيط الكرات. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تنمية الكرات العصبية من البروزات العقدية للفئران في اليوم الجنيني E 14 باتباع نفس الإجراءات الموضحة هنا. يمكنك أيضاً تنمية الكرات العصبية من مناطق أخرى من الدماغ مثل القشرة والمستدير المتوسط.

شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في استزراع الكريات العصبية.