تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

يهدف هذا البروتوكول المرئي إلى عزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من دماغ جنين الفأر باستخدام مقايسة الكرات العصبية. تتضمن العملية حصاد أجنة الفئران في اليوم الجنيني E 14، يلي ذلك التشريح الدقيق للدماغ لحصاد البروزات العقدية، وتفكيك الأنسجة المحصودة للحصول على معلق من الخلايا المفردة، وأخيراً زراعة الخلايا في مستنبت الكرات العصبية. مرحباً، أنا حسن علي من مختبر الدكتور برينت فرينلز في معهد ميت براين بجامعة فلوريدا.

سأوضح لكم اليوم كيفية إنشاء مزرعة كرات عصبية من دماغ جنين الفأر باستخدام مقايسة الكرات العصبية. نحن نستخدم هذه المقايسة بشكل روتيني في مختبرنا لعزل الخلايا الجذعية العصبية وتكثيرها. حسنًا، لنبدأ.

قم بتخدير فأرة حامل تم تزاوجها في وقت محدد. وفي اليوم 14 من فترة الحمل، قم بإجراء خلع فقرات الرقبة وشطف البطن بـ 70% ethanol. أمسك الجلد الموجود فوق البطن باستخدام ملقط كبير، ثم قص الجلد واللفافة الكامنة تحته باستخدام مقص كبير.

لكشف التجويف البطني وقرون الرحم، قم بإزالة قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ml يحتوي على وسط HEM بارد. بعد نقل أنسجة الرحم إلى غطاء التدفق الصفائحي (PC hood)، قم بإزالة وسط HEM من الأنبوب سعة 50 ml واغسل الأنسجة بكمية كافية من وسط HEM البارد والنقي لإزالة الملوثات مثل الدم والشعر، وكرر هذه العملية من مرتين إلى ثلاث مرات. ثم انقل أنسجة الرحم إلى طبق بتري بقطر 10 centimeter يحتوي على وسط HEM بارد.

افتح قرني الرحم باستخدام ملاقط ومقصات منحنية صغيرة، وانقل الأجنّة إلى طبق جديد يحتوي على محلول hem بارد. كرر هذه العملية حتى يتم جمع جميع الأجنّة. ثم ضع الأجنّة تحت المجهر التشريحي.

افصل رؤوس الأجنة عند مستوى النخاع الشوكي الرقبي وانقلها إلى طبق بتري آخر يحتوي على محلول hem بارد. ثبت الرأس باستخدام ملقط منحني دقيق واستخدم مقصات جراحية دقيقة. أولاً، قم بإجراء قطع أفقي فوق الأنف، ثم استمر في القطع على طول الخط المتوسط من الجبهة باتجاه مؤخرة الرأس.

تأكد من القطع عبر الجلد والجمجمة مع تجنب إتلاف الدماغ الموجود تحتهما. قم بإخراج الدماغ من الجمجمة عن طريق دفع حواف القسم المقطوع بحركة إلى الخلف باستخدام الملقط المنحني. استمر في هذا الإجراء حتى يتم إخراج جميع الأدمغة من الجماجم.

ثبّت الدماغ بإحكام باستخدام الملاقط المنحنية بحيث يكون الجانب الظهري موجهاً للأعلى، ثم استخدم المقصات الدقيقة للقص عبر قشرة كل نصف كرة مخية من البصيلات الشمية إلى الجزء الخلفي من نصف الكرة المخية، وذلك للكشف عن البروزات العقدية. مع تثبيت الدماغ في مكانه، استأصل البروز العقدي كاملاً باستخدام ملاقط بزاوية 45 درجة وانقله إلى طبق بتري آخر. يظهر البروز العقدي هنا بوضوح مع أجزائه الإنسية والوحشية.

بدلاً من ذلك، يمكنك تشريح البروزات العقدية عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة باستخدام ملقط دقيق. كما يمكنك قطع البروز بالكامل إلى نصفين، إنسي وجانبي، إذا كنت مهتماً بتنمية خلايا من أي من هاتين المنطقتين.

كرر هذا الإجراء حتى يتم تشريح جميع الأدمغة مجهرياً. استخدم 1 milliliter من وسط الخلايا الجذعية العصبية لجمع قطع الأنسجة ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter. اترك تجمعات الأنسجة تترسب في أنبوب الـ 15 milliliter لضمان عدم ترك أي أنسجة خلفك.

قم بإزالة جزء من الوسط الطافي واغسل قاعدة طبق بتري لنقل أي أنسجة إضافية إلى أنبوب سعة 15 ml. ضع طرف الماصة مقابل قاع الأنبوب، ثم اسحب المعلق للأعلى والأسفل من ثلاث إلى أربع مرات لتفتيت الأنسجة والحصول على معلق من الخلايا المفردة.

بعد ذلك، اترك المعلق يترسب لمدة دقيقة واحدة حتى تترسب التكتلات غير المرتبطة، ثم انقل معظم معلق الخلايا إلى أنبوب آخر سعة 15 مل. بعد ذلك، أضف واحد ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الجذعية العصبية إلى التكتلات المتبقية وقم بتفكيكها إلى خلايا مفردة. ثم اسحب محتويات الأنابيب.

بعد ذلك، قم بطرد المعلق مركزياً بسرعة 700 RPM أو قوة 110 G لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 1 mL من وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل. خذ 10 µL من معلق الخلايا وامزجها جيداً مع 90 µL من صبغة tripan blue.

ثم خذ 10 µL من هذا المعلق وانقله إلى مقياس كرات الدم (hemo cytometer). قم بإجراء عدّ للخلايا. انقل إجمالي 20 ml من وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ml من أجل زراعة قارورة T 80 واحدة.

بعد ذلك، اخلط معلق الخلايا وأضف كمية مناسبة من الخلايا لتحقيق كثافة إجمالية تبلغ 200, 000 خلية لكل ملليلتر أو 4 ملايين خلية لكل قارورة T 80. أضف EGF بتركيز نهائي قدره 20 نانوغرام لكل ملليلتر. اخلط الخلايا الموجودة في وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل مع عامل النمو، ثم انقل معلق الخلايا إلى قوارير T 80.

قم بوضع ملصق تعريف على الدورق وافحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من الحصول على معلق خلوي أحادي دون وجود تكتلات نسيجية. انقل الدورق إلى حاضنة عند 37 °C مع 5% CO2 لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام. بعد مرور خمسة إلى سبعة أيام، قم بتقييم محتوى الدورق تحت المجهر.

بحلول هذا الوقت، تكون الكرات العصبية قد تكونت، ويجب أن يتراوح قطرها بين 150 إلى 200 ميكرون، وتصبح جاهزة للاستنبات الفرعي. اجمع محتويات الدورق في أنبوب زراعة أنسجة معقم وبحجم مناسب، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً وتخلص من الراشح. أعد تعليق الكرات في 1 مل من التريبسين المسخن مسبقاً، وضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

ثم أضف حجماً مساوياً من مثبط التريبسين واخلط جيداً ولكن بلطف لإيقاف نشاط التريبسين. قم بالطرد المركزي مرة أخرى وأزل الرائق. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 1 mL من وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل وأجرِ عدّاً للخلايا كما ذُكر سابقاً. ومن أجل زراعة دورق T 1 75 واحد، انقل إجمالي 40 mL من وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL.

بعد ذلك، اخلط الخلايا وأضف كمية مناسبة منها لتحقيق كثافة إجمالية تبلغ 50,000 خلية لكل M أو 2 مليون خلية لكل قارورة T 1 75. ثم أضف EGF بتركيز نهائي قدره 20 nanograms per mil. اخلط الخلايا الموجودة في وسط الخلايا الجذعية العصبية الكامل مع عامل النمو وانقل معلق الخلايا إلى قارورة T 1 75.

قم بوضع ملصق تعريف على القارورة ثم انقلها إلى الحضانة لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام. هذا مثال على زراعة أولية للخلايا الجذعية العصبية E 14. وبعد ثلاثة أيام من الزرع، تشير الأسهم إلى تجمعات متكاثرة من الخلايا الجذعية العصبية.

يمكنك أيضاً رؤية خلايا ملتصقة بالركيزة ومتميزة. هذا مثال لمزرعة خلايا جذعية عصبية أولية E 14 بعد سبعة أيام من الزرع. وكما تلاحظ، توجد كرات ذات أحجام مختلفة.

هناك أيضاً خلايا متمايزة. كمية الحطام أقل بكثير مما هي عليه في مستنبتات الكرات العصبية الأولية للبالغين. كما أن الكرات ليست متراصة وتظهر حول محيطها نتوءات دقيقة تشير إلى أن الكرات سليمة وحيوية.

يجب عدم السماح للكرات بالنمو بشكل زائد، لأنها قد تصبح داكنة اللون نتيجة موت الخلايا في المركز. كما قد تلتصق الكرات الكبيرة بالركيزة وتتمايز. هذا مثال على الكرات العصبية E 14 في الممر الأول بعد خمسة أيام من الزرع.

هنا مرة أخرى، يمكنك رؤية الأشواك الدقيقة (micro Spikes) عند محيط الكرات. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تنمية الكرات العصبية من البروزات العقدية للفأر في اليوم الجنيني 14 (E 14) باتباع نفس الإجراءات الموضحة هنا. يمكنك أيضاً تنمية كرات عصبية من مناطق أخرى في الدماغ مثل القشرة والمخيخ المتوسط.

شكرًا لكم على المشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في زراعة الكريات العصبية.