Name: عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: تعلم استخراج الحمض النووي الجينومي من ذيول جراء الفئران بعمر عشرة أيام باستخدام خزع الذيل. يوضح هذا الأسلوب تقنيات تجنب التلوث وتحديد الفئران فردياً لضمان نتائج دقيقة في الدراسات الوراثية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style="margin-top: 0in;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطع الذيل (3mm) وآذان العلامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 720 متر و 30 لتر STE م ل ك بروتين (10 ملغ / مل الأسهم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند درجة حرارة 55 مئوية على كتلة التدفئة ودوامة كل ساعة لمدة 3 ساعات في سرعة قصوى لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل بروتين كاف في 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي للطرد المركزي لمدة 10 دقيقة الذيل بأقصى سرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب في أنبوب جديد يحتوي على 720 م ل الأيزوبروبانول. &nbsp; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي يعجل بواسطة أنبوب أو عكس vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار لمدة 5 دقائق الحمض النووي بأقصى سرعة. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل الحمض النووي الجيني 5 دقائق بأقصى سرعة. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي يسمح لتجف لمدة 1-2 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي في Resuspend ل م 100-200 اعتمادا على حجم بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب مكان عند درجة حرارة 55 مئوية لمدة 1 ساعة لتسهيل حل من الحمض النووي. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>محلول منظم</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / في H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>محلول منظم</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

هذا جرو فأر يبلغ من العمر 10 أيام، وسأقوم بأخذ خزعة من الذيل ثم استخلاص DNA جينومي من ذيله. ما سأفعله هو قص جزء صغير من الذيل، بطول 3 mm تقريباً، ثم سأضع قطعة الذيل في أنبوب إبندورف، وأضع أنبوب إبندورف على الثلج الجاف. والآن، لتجنب التلوث من فأر إلى آخر، أقوم عادةً بتحديد شفرة الحلاقة عند الجزء الذي أجريت فيه القص الأخير.وبهذه الطريقة، سأحرص عند التعامل مع الفأر التالي على استخدام قطعة نظيفة من شفرة الحلاقة لأخذ خزعة الذيل التالية. ومن أجل التمييز بين الفئران المختلفة في البطن الواحد، ستحتاج إلى وسيلة لتحديد هوية الفئران. إحدى الطرق للقيام بذلك هي ثقب آذانها باستخدام خرامة ثقوب الأذن الموضحة هنا.أمسك الفأر برفق من رقبته بهذا الشكل، ثم اقلبه واضغط على ذيله بين أصابعك. أمسك أداة ثقب الأذن باليد الأخرى وقم بعمل قص سريع في أذن الفأر هناك. هل رأيت كيف كانت العملية غير مؤلمة؟حسنًا، يمكنكم الآن رؤية وجود بعض قطع الذيل في هذه الأنابيب، وسأقوم الآن بإضافة المحاليل التي ستساعد في هضمها. أولاً، سأضيف 720 µL من محلول STE، ثم سأضيف 30 µL من بروتين Proteinase K. وإليكم نظرة على قطعة الذيل التي قمنا بقصها قبل عملية الهضم.سأقوم الآن بوضع قطع الذيل على كتلة تسخين عند درجة حرارة 55 درجة مئوية. تتطلب العديد من البروتوكولات هزاً مستمراً عند 55 درجة مئوية، ولكن لهذا الغرض لن يكون ذلك ضرورياً لأنني سأقوم بعملية الخلط الدوامي لقطع الذيل. سأقوم الآن بخلط قطعة الذيل دوامياً لمدة ثانيتين.واحد، اثنان. لذا بعد الرج الدوامي، إليكم نظرة على ما تبقى داخل أنبوب Eppendorf هنا، ويمكنكم ملاحظة أن قطعة الذيل قد ذابت تماماً؛ قم بتنشيط proteinase K عند 70 °C لمدة خمس دقائق. ثم قم بإيقاف التفاعل على الثلج لمدة خمس دقائق.قم بتدوير قطع الذيل في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 10 دقائق بالسرعة القصوى. وتبلغ السرعة القصوى في هذا الجهاز 13,000 RPMs. وأثناء عملية تدوير الذيول المهضومة، قم بتسمية بعض أنابيب إبيدورف (Eppendorf) ثم املأ هذه الأنابيب بـ 750 µL من الإيزوبروبانول.بعد طرد ذيول العينات المهضومة مركزياً، سيشكل الشعر والمواد غير المهضومة قرصاً (pellet) في قاع الأنبوب، قم بصب المحلول الذي يحتوي على المادة المهضومة وSTE وproteinase K في أنبوب إبيدور يحتوي على isopropanol. سيبدأ الـ DNA بالترسب من المحلول، وسيظهر بشكل شبحي أو يشبه الريش، وهذا ما يسبح داخل تلك الفقاعة هو الـ genomic DNA الذي تم عزله من ذيل الفأر. بعد خلط محلول isopropanol وSTE، سيترسب الـ genomic DNA ويظهر على شكل هذه الكرة الصغيرة هنا، قم بطرد الـ genomic DNA المترسب مركزياً لمدة خمس دقائق بالسرعة القصوى في جهاز طرد مركزي دقيق (micro centrifuge).يظهر في قاع الأنبوب راسب الحمض النووي الجينومي. سأقوم الآن بسحب المحلول الموجود داخل الأنبوب، تاركةً راسب الحمض النووي الجينومي فقط. سأقوم بتغيير طرف الماصة في كل مرة أسحب فيها المحلول من أنبوب آخر.نضع طرف الشفاط هنا. بعد شفط STE والإيزوبروبانول، سأضيف 1 mL من الإيثانول بتركيز 70% لغسل كرة الحمض النووي الجينومي (genomic DNA). ولأن كرة الحمض النووي الجينومي عادة ما تلتصق بجدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق (microfuge tube) ويصعب إزالتها لغسلها جيداً في الإيثانول بتركيز 70%، ستحتاج إلى كشطها باستخدام حامل أنابيب الطرد المركزي الدقيق الموجود هنا.يمكن القيام بذلك بهذه الطريقة. إليكم نظرة على الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي (genomic DNA) بعد ترسيبه وغسله بـ 70% ethanol. سأقوم بتدوير هذه العينة مرة أخرى بالسرعة القصوى لمدة خمس دقائق، ثم سأقوم بشفط 70% ethanol وتدوير حبيبات genomic DNA بعد غسلها.يتم الطرد المركزي للإيثانول 70% لمدة خمس دقائق بالسرعة القصوى، ثم يتم سحب الإيثانول 70% وترك الـ DNA ليجف لمدة خمس دقائق. تظهر هنا كتلة الـ DNA الجينومي في قاع الأنبوب، وقد وصلت إلى درجة الجفاف المطلوبة. بعد أن جففت كتل الـ DNA الجينومي المستخلصة من ذيول الفئران، سأقوم الآن بإضافة 100 µL من محلول tris بتركيز 40 mM وبدرجة pH 8.لذا، سأحتفظ بالحمض النووي الجينومي (genomic DNA) عند درجة حرارة 50 درجة مئوية، حيث سيذوب في المحلول بسرعة أكبر مما لو كان في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور ساعة تقريباً عند 50 درجة مئوية، سأقوم إما بتجميده أو وضعه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يحين وقت إجراء تفاعلات PCR لتحديد الفئران التي تحمل الجين المنقول (transgene) بشكل إيجابي.

isolation-of-genomic-dna-from-mouse-tails

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويتم ذلك على التنميط الجيني الكامل للماوس عينة الذيل ، بما في ذلك هضم الأنسجة وقراءات PCR ، في واحدة ونصف الساعة باستخدام سيغما SYBR الاخضر المقتطف - N - PCR الأمبير الأنسجة عدة.

التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت

نحن يبرهن على وجود مناعي لونين (CHIP) طريقة لتحديد التفاعلات عامل في جينات محددة الأنسجة أثناء أو بعد ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني في الأنسجة الجنينية الماوس. هذا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع بروتوكول لدراسة تفعيل الجين الأنسجة محددة كما يحدث أثناء التطور الجنيني الطبيعي.

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

نقدم نهجا لجمع العينات موسع بكفاءة عينات الشعر من الثدييات الصغيرة بعيد المنال ، كما هو موضح لبيكا الأميركية. نحن لشرح فائدة هذا الأسلوب من خلال استخراج الحمض النووي من عينات الشعر وتضخيم عدة أنواع من المؤشرات الجزيئية التي يشيع استخدامها في دراسات البيئة البرية والمحافظة عليها.

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء قص الذيل في نموذج الفأر لجمع الدم المحيطي. يخضع الدم الذي تم جمعه لاحقا للطرد المركزي لفصل البلازما ، والتي يمكن استخدامها لمزيد من التجارب.

إجراء قص ذيل الفأر لجمع الدم المحيطي وعزل البلازما

نحن تصف الإجراء التجريبي بسيطة وسريعة لتوليد الخلايا الليفية الأولية من الأذنين وذيول الفئران. لا يتطلب إجراء تدريب خاص الحيوان، ويمكن استخدامها لتوليد الثقافات الليفية من آذان المخزنة في RT لمدة تصل إلى 10 يوما.

الثقافات توليد الخلايا الليفية الأولية من ماوس الأذن والذيل الأنسجة

يستخدم حقن ميكروينجكتيون من البويضات الماوس لكل من ترانسجينيسيس الكلاسيكية ( أي التكامل العشوائي للجينات المحورة وراثيا) و كريسبر بوساطة استهداف الجينات. هذا البروتوكول يستعرض أحدث التطورات في ميكروينجكتيون، مع التركيز بشكل خاص على مراقبة الجودة واستراتيجيات التنميط الجيني.

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من خلال ميكروينجكتيون من البويضات

يصف لنا بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً" في الخلايا المستزرعة من القوارض المعدلة وراثيا أو الحيوانات المقابلة تعامل مع عامل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. وقد استخدمت هذا النهج على نطاق واسع لاختبار المحدثة للطفرات من المواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات.

"حدد أمداً" الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات"

نقدم هنا، بروتوكولا لسرعة عزل نواة عالية الجودة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. نحن تشمل الأنسجة الميكانيكية والمنظفات الصناعية والميكانيكية وناقص التوتر تعطل وخلية تحلل الخيارات، التي يمكن أن تستخدم لعزل نواة.

عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع

يصف البروتوكول الحالي طفرة M213L واحدة في Gja1 تحتفظ بجيل Connexin43 كامل الطول ولكنها تمنع ترجمة الشكل الأصغر GJA1-20k المترجم داخليا.

إزالة موقع بدء انتقالي داخلي من mRNA مع الاحتفاظ بالتعبير عن البروتين كامل الطول

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي لتحليل تغيرات ميكروبات الأمعاء الفئرانية أثناء تطور أمراض المناعة الذاتية.

تحليل ديناميكيات الميكروبات البرازية في الفئران المعرضة لمرض الذئبة باستخدام طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي

لقد طورنا نهجا مقارنا لعلم الأورام الجيني عبر الأنواع باستخدام التحليلات الجينومية والشاشات الجينومية الوظيفية لتحديد ومقارنة الأهداف العلاجية في الأورام الناشئة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ونوع الورم البشري المقابل.

التنميط الجيني وفحص التسرب على نطاق الجينوم لتحديد الأهداف العلاجية في نماذج الفئران لورم غمد العصب المحيطي الخبيث

تعلم استخراج الحمض النووي الجينومي من ذيول جراء الفئران بعمر عشرة أيام باستخدام خزع الذيل. يوضح هذا الأسلوب تقنيات تجنب التلوث وتحديد الفئران فردياً لضمان نتائج دقيقة في الدراسات الوراثية.

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات