عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

الهدف العام من هذا الإجراء هو استنبات شرائح حصينية عضوية النمط. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الحصين، ثم تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تقطيع الحصين إلى شرائح.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في فصل وفرز شرائح الحصين. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي استنبات شرائح الحصين. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر شرائح حصين عضوية سليمة من خلال التصوير باستخدام منظار التشريح أو المجهر.

مرحباً، اسمي خيمينا أوبيتز وأنا باحثة علمية في مختبر الدكتور أندريس بار بجامعة واشنطن في سياتل. سأقوم بتوضيح إجراءات استنبات شرائح الحصين النسيجية (organotypic hippocampus slice culture). بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات بسبب الحاجة إلى تشريح وتقطيع الحصين بسرعة، ولتجنب التلوث، يجب استخدام محلول تشريح معقم واستنبات الشرائح في ظروف معقمة.

يمكن تحضير الأوساط الغذائية قبل ما يصل إلى ثلاثة أسابيع وتخزينها عند درجة حرارة 4 °C كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ويمكن تحضير المزارع قبل تقطيع شرائح الحصين. ومن الضروري تعقيم كل من غطاء زراعة الأنسجة والمعدات التي ستُستخدم في عملية التشريح تعقيماً تاماً.

أولاً، امسح السطح الداخلي لغطاء زراعة الأنسجة بـ 70% ethanol. ثم ضع المجهر التشريحي وجميع أدوات التشريح داخل الغطاء. جهز قطاعة الأنسجة بوضع قطعة نظيفة من رقاقة Teflon على المنصة وتركيب شفرة جديدة.

ضع جهاز تقطيع الأنسجة داخل غطاء زراعة الأنسجة، ثم استخدم الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم جميع الأسطح والمعدات لمدة 15 دقيقة. أطفئ الضوء بعد اكتمال عملية التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية. ابدأ العمل داخل غطاء زراعة الأنسجة.

أولاً، قم بتجهيز أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار والتي ستُستخدم لاستزراع شرائح الحصين. انقل 750 µL من SEM إلى كل بئر من آبار الطبق سداسي الآبار. ثم باستخدام ملقط معقم، ضع قطعة إدخال لزراعة الخلايا في كل بئر من آبار طبق زراعة الأنسجة.

مع الحرص على عدم حبس فقاعات هوائية أسفل الغرسة. من المهم أن يكون غشاء كل غرسة زراعة خلوية مبللاً بوسط زراعة الشرائح. إذا كان الغشاء جافاً، تحقق من عدم وجود فقاعات هوائية.

إذا كان الغشاء يقع فوق سطح السائل (المنيسكس) الخاص بوسط SCM، فيمكن إضافة المزيد من الوسط إلى البئر. ضع أطباق الزرع المُجهزة في حاضنة زراعة الأنسجة. اضبط درجة الحرارة عند 35 °C مع 5% carbon dioxide حتى وقت الحاجة إليها.

أخيرًا، املأ دلواً للثلج بمزيج من الثلج والملح وضعه بجانب منطقة قطع الرأس أثناء العمل داخل غطاء التدفق الصفائحي. املأ دورقاً سعة 100 milliliter بمحلول التشريح. اغمر الدورق في مزيج الثلج والملح وقم بفقاعة المحلول بغاز ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5% والأكسجين بنسبة 95% لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة حتى يتغير اللون من الوردي إلى البرتقالي.

ويشكل محلول التشريح مزيجاً شبه سائل من المحلول المجمد والسائل. الآن أصبحت بيئة التشريح وأطباق زراعة الأنسجة جاهزة لعملية التشريح. غلاف من P3 إلى P7.

تُستخدم الجراء في هذا الإجراء. شريحة. يمكن تحضير المزارع من ما يصل إلى ثلاث جراء ملفوفة في المرة الواحدة. سيتم توضيح هذا الإجراء باستخدام جرو واحد.

قم باستئصال الدماغ بسرعة من خادرة wrap المقطوعة الرأس، وضعه في دورق سعة 100 milliliter يحتوي على محلول التشريح Slurry Chill لمدة دقيقة واحدة. وخلال هذا الوقت، قم بتجهيز طبق التشريح عن طريق إضافة حوالي 10 milliliters من محلول التشريح المبرد بالثلج إلى قاع طبق زراعة أنسجة سعة 60 millimeter. وباستخدام ملعقة مستديرة أو ملعقة مجهرية (micros spatula)، انقل الدماغ من الدورق سعة 100 milliliter إلى الطبق سعة 60 millimeter المملوء بوسط التشريح البارد. تأكد من أن محلول التشريح يغطي الدماغ بالكامل.

ضع الطبق الذي يحتوي على الدماغ تحت المجهر التشريحي. انظر عبر المجهر التشريحي وحدد موقع الدماغ. استخدم ملاقط تشريح معقمة لتحريك الدماغ إلى مركز مجال الرؤية.

ثبّت الدماغ عند الخط الناصف باستخدام ملقط التشريح مع الضغط إلى قاع الطبق. وباستخدام أداة تشريح الحصين، قم بتقشير نصفي الكرة القشرية برفق بعيداً عن الدماغ المتوسط مع ترك الدماغ المتوسط في مكانه، ومن الناحية المثالية دون فصل نصفي الكرة القشرية عن بقية الدماغ، وبذلك يصبح الحصين مكشوفاً الآن. خذ أداة تشريح الحصين واستخرج الحصين من أحد نصفي الكرة.

بعد ذلك، استخدم إبرة التشريح لإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة غير الحصينية. وبمجرد عزل الحصين الأول وتنظيفه، كرر هذه العملية للحصين الثاني من النصف الآخر من الدماغ. بعد ذلك، استخدم مقصاً معقماً لقص طرف رأس ماصة ترشيح P 1000.

ضع طرف الماصة على ماصة P 1000 معقمة. اسحب حصينًا واحدًا بلطف بواسطة الماصة ثم ضعه على ورقة التفلون الموجودة في جهاز تقطيع الأنسجة. بعد ذلك، ضع الحصين الثاني على جهاز التقطيع بنفس الطريقة.

ضع نصفي الحصين على جانبيهما المقعرين وقم بمحاذاتهما بشكل عمودي على الشفرة، ثم اشفط السوائل الزائدة من ورقة التفلون. اضبط الميكرومتر على الموضع صفر. قم بتقطيع الحصين إلى مقاطع بسماكة 400 micrometer.

قم بتجهيز رأس مرشح P 1000 مقصوص آخر وثبته على ماصة P 1000 معقمة. صب حوالي 10 milliliters من SCM البارد في طبق زراعة أنسجة معقم بقطر 60 millimeter. باستخدام الماصة، أضف بعض الوسط وانقل شرائح الحصين من القاطع إلى الطبق.

تجنب تكوين الفقاعات بعد تكرار عملية النقل لجميع الشرائح، ثم ضع الطبق تحت المجهر التشريحي. وأخيراً، وباستخدام ملعقة قزحية وملعقة مستقيمة، افصل الشرائح عن بعضها البعض برفق.

افصل الشرائح المحددة جيداً وغير التالفة عن أي شرائح تالفة. وبذلك تصبح شرائح الحصين المحددة جيداً جاهزة الآن للزراعة. أخرج أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار التي تم تحضيرها مسبقاً والتي تحتوي على SCM ودرجات إدخال المزارع الخلوية من الحاضنة، وباستخدام P 1000 مع طرف واسع مقصوص، انقل من أربع إلى خمس شرائح فردية لكل غشاء.

استخدم ملعقة قزحية (iris spatula) لفصل الشرائح عند الضرورة. احذر من وضع الشرائح بالقرب من جدار القطعة المدرجة أو بالقرب من بعضها البعض. مع الحرص على عدم لمس الشرائح، قم بشفط أي وسط زائد من السطح العلوي للمزرعة الخلوية.

أدخل الغشاء. وأخيراً، أعد الطبق، الذي يحتوي الآن على مستنبتات شرائح الحصين، إلى حاضنة زراعة الأنسجة. اضبط درجة الحرارة عند 35 °C ونسبة 5% carbon dioxide.

بعد مرور 48 ساعة، أخرج الطبق من الحاضنة أثناء العمل داخل غطاء زراعة الأنسجة. قم بشفط الوسط باستخدام ماصة خلفية. أضف 750 µL من وسط SCM الجديد والمُدفأ مسبقاً لكل بئر.

ومرة أخرى، تأكد من عدم تكون أي فقاعات تحت غشاء قطعة زراعة الخلايا. هذا مثال لشريحة حصين سليمة وجاهزة للزراعة. تظهر مناطق الحصين، وهي CA1 وCA3 والتلفيف المسنن، بوضوح وبدون تلف.

يظهر هنا شريحة حصين تالفة لم تُستخدم في المزرعة. وأخيرًا، هذا مثال لشريحة حصين سليمة بعد أربعة أيام في المزرعة. لاحظ أن الشريحة تبدو بيضاء تحت المجهر التشريحي وأن سطح الشريحة نظيف.

تظهر مناطق الحصين، وهي CA1 وCA3 والتلفيف المسنن، بوضوح وبدون أي تلف. وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ساعة واحدة تقريباً إذا تم تطبيقها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم جداً تذكر استخدام تقنيات التعقيم المناسبة والتعامل برفق مع الأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استزراع شرائح الحصين النمطية. تحلل الحصين.

شكراً لكم وبالتوفيق في تجاربكم.