الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار قدرة مقياس الطيف الضوئي الفلوري F 7 ، 000 مع قارئ Microplate لإجراء قياس كمية الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل باستخدام صبغة بيكو الخضراء. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير العينات والكواشف أولا. الخطوة الثانية من الإجراء هي إعداد الأداة.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي تحميل العينات في قارئ Microplate. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي إجراء قياس المعايير والعينات. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر منحنى معايرة خطي ، والذي يمكن استخدامه لقياس الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل لعينات غير معروفة.

قم بتشغيل مقياس الفلور الطيفي هيتاشي F 7 ، 000 للسماح لمصباح زينون بالتسخين لمدة ساعة واحدة في Excel. قم بإنشاء ملف بالمعايير وبيانات العينة واحفظه بقيم مفصولة بفواصل أو تنسيق CSV. لإعداد مقياس الفلور أولا ، انقر فوق زر الطريقة الذي يفتح نافذة طريقة التحليل.

في حقل القياس ، حدد القياس الضوئي من القائمة المنسدلة. انقر الآن على علامة التبويب الكمية. في حقل نوع القياس الكمي ، حدد الطول الموجي للإشارة إلى أن قراءة التألق سيتم إجراؤها باستخدام طول موجي محدد.

بالنسبة لنوع المعايرة، حدد الترتيب الأول، وبالنسبة لعدد الأطوال الموجية، حدد واحدا. أدخل نانوجرام لكل مليلتر لوحدة التركيز. تأكد من عدم تحديد المعايرة اليدوية ومنحنى القوة من خلال مربعات الصفر بحثا عن رقم بعد الفاصلة العشرية ، حدد اثنين ، وأدخل صفرا لحد التركيز الأدنى ، و 10 ، 000 لحقل حد التركيز الأعلى.

بعد ذلك ، انقر فوق علامة تبويب الأداة وفي حقل وضع البيانات حدد التألق. تحقق من أن مجال سرعة التقطيع غير نشط لأنه يستخدم فقط لقياسات الفسفور. في حقل وضع الطول الموجي، حدد كلا WL الثابت في حقل WL السابق واحد، وأدخل 480 نانومتر في حقل EM WL واحد.

أدخل 520 نانومتر. اترك جميع الحقول الأخرى ضمن EX و EM غير نشطة. اضبط كل من الشق السابق وشق EM على 5.0 نانومتر.

باستخدام القوائم المنسدلة ، اترك الصندوق أمام حقل جهد PMT من واحد إلى 1000 فولت غير محدد. بالنسبة لجهد PMT ، حدد 700 فولت من القائمة المنسدلة. أيضا، حدد اثنين لحساب الإحصاء التلقائي رقم واحد للتكرارات 0.1 ثانية لوقت التكامل وصفر للتأخير.

افتح الآن علامة تبويب الشاشة وقم بتعيين سبب الحد الأقصى لحقل المحور إلى 10 ، 000 ولماذا الحد الأدنى للمحور إلى الصفر. ثم حدد المربع الموجود على يسار معالجة البيانات المفتوحة بعد الحصول على البيانات، وإذا لزم الأمر، المربع الموجود على يسار التقرير المطبوع بعد الحصول على البيانات لتقرير يتم طباعته تلقائيا عند الانتهاء من القراءات. أخيرا ، لحفظ جميع المعلمات المحددة في علامات التبويب المختلفة لنافذة طريقة التحليل ، انقر فوق علامة التبويب عام واحفظها تحت اسم ملف جديد في موقع محدد.

انقر فوق الزر موافق لإغلاق هذه النافذة. هذا يكمل إعداد معلمات اختبار الأداة. لإعداد قارئ اللوحة الدقيقة ، انقر فوق الزر MPR لإحضار نافذة إعداد MPR إلى الأمام.

حدد أولا الآبار للمعايير. على سبيل المثال ، انقر فوق موضع A واحد واسحب الماوس إلى E واحد. ثم انقر فوق زر الضبط القياسي.

سيؤدي هذا إلى تحديد المواضع التي سيتم استخدامها للمعايير كما هو موضح باللون الأخضر. ثم حدد مواضع العينات. وبالمثل ، انقر فوق الماوس واسحبه فوق المواضع المقابلة على اللوحة ، ثم انقر فوق زر تعيين العينة ، والذي سيسلط الضوء تلقائيا على المواضع المحددة باللون الأصفر.

استمر في تكرار نفس العملية لمواضع قياسات العينة المطلوبة. لتحميل المعايير وعينة المعلومات على ملف المتغير المفصول بفواصل الذي تم إعداده مسبقا. انقر فوق علامة التبويب معلومات البئر في نافذة إعداد MPR.

حدد زر معلومات التحميل جيدا وستفتح نافذة مستكشف Windows لتحديد ملف csv لمعلومات البئر. بعد تحميل المعلومات ، يجب أن يتم عرض النافذة كجدول. من أجل تحضير محلول عملي لكاشف بيكو الأخضر ، أضف 50 ميكرولترا من الكاشف الأخضر 200 X بيكو إلى 9.95 مل من المخزن المؤقت TE.

بالنسبة للمنحنى القياسي ، قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للحمض النووي المزدوج Lambda الذي تقطعت به السبل في المخزن المؤقت TE للتركيزات النهائية ، تتراوح من واحد إلى 100 نانوجرام لكل ماصة ملليلتر 150 ميكرولتر من كل معيار في آبار معينة من لوحة 96 بئر. بعد ذلك ، قم بوضع 150 ميكرولترا من كل عينة اختبار في الآبار المعينة المقابلة للوحة. الآن باستخدام ماصة متعددة ، أضف 150 ميكرولترا من محلول بيكو الأخضر إلى كل بئر واخلط المحلول وعينات الحمض النووي.

احتضن اللوحة برفق في منطقة مظلمة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق حتى يتطور رد الفعل. انقر فوق زر شاشة عرض MPR لإحضار نافذة إعداد MPR أعلى الشاشة وانقر فوق زر موضع التبادل. ستتحرك منصة تثبيت الصفيحة الدقيقة نحو مقدمة الأداة ، وتفتح باب قارئ الصفيحة الدقيقة وتضع لوحة البئر 96 على منصة التثبيت مع بئر A باتجاه الأمام وتغلق باب قارئ Microplate.

انقر فوق زر الموضع الأولي لوضع الموضع A واحد من الصفيحة الدقيقة في موضع القياس. انقر فوق زر عرض الشاشة لإحضار نافذة القياس أعلى الشاشة. انقر فوق زر القياس لبدء قياس المعايير والعينات غير المعروفة.

يتم تقييم منحنى المعايرة الجيد باستخدام المعلمات المختلفة التي يوفرها برنامج F 7 ، 000. على سبيل المثال ، تم حساب منحنى المعايرة المثالي هذا للقياس الكمي للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل باستخدام صبغة بيكو الخضراء معامل التحديد البالغ 0.99993. نظام الإنتاجية العالية الموصوف عبارة عن مجموعة تسلسلية من التقنيات بما في ذلك Pico Green Dye ، ومقياس الطيف الضوئي الفلوري Hitachi F 7 ، 000 ، والمجهز بقارئ Microplate وبرنامج برمجي لأتمتة جمع البيانات وتحليلات التخزين والعرض التقديمي.

يمكن أن يلبي الجمع بين التقنيات القوية الحاجة المتزايدة لتحليل كميات صغيرة من الأجزاء المزدوجة التي تقطعت بهم السبل بدقة. دنا.