Name: الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: تعلم كيفية قياس dsDNA بدقة عالية باستخدام صبغة PicoGreen ومطياف الفلورة Hitachi F-7000 مع قارئ الألواح الدقيقة. يوضح هذا الإجراء إعداد العينات والمعايرة الخطية لتحديد تركيز DNA المجهول.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. إعداد صك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مقياس التألق الطيفي والسماح لالاحماء لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام Excel إنشاء ملف مع المعايير ونموذج البيانات ، كما هو مبين في الشكل (1) وحفظه في قيم مفصولة بفواصل "CSV" تنسيق. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="الشكل 1"> الشكل 1. المعايير وبيانات العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقياس التألق على النحو التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="رمز 1"> زر ، وهذا فتح نافذة أسلوب التحليل ، كما هو موضح في الشكل رقم 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="الشكل 2"> الشكل 2. نافذة تحليل الأسلوب ، التبويب عام. بإجراء التحديدات التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "القياس" ، حدد قياس الشدة الضوئية من سحب أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحقل "المشغل" ، أدخل اسم المشغل المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليست هناك حاجة لإدخال المعلومات في هذا المجال "الصك". يتم تحديد هذا تلقائيا بواسطة البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "المعاينة" حقل غير نشط عند استخدام قارئ microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال أية تعليقات التي قد تريد تضمينها في التقرير في هذا المجال "تعليقات". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "ملحقة" ، أدخل المعلومات المتعلقة الملحقات المستخدمة في هذا الاختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ الأزرار على الجانب الأيمن من النافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> "تحميل" الزر يتيح تحميل أساليب التحليل التي تم حفظها سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> "حفظ" زر يسمح بتحديث مجموعة من المعلمات اختبار أو الطريقة التي تم حفظها سابقا التحليل وتحميلها ، وذلك باستخدام نفس الاسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> "حفظ باسم" الزر يتيح توفير مجموعة جديدة من المعلمات اختبار أو أسلوب التحليل تحت الاسم المطلوب. </li></ul> الآن انقر فوق علامة التبويب "الكميات" ، انظر الشكل رقم 3 وجعل التحديدات التالية. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="الشكل 3"> الشكل 3. نافذة تحليل الأسلوب ، التبويب الكميات. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "الكميات نوع" ، حدد الطول الموجي. يشير هذا وسوف تتاح القراءة مضان باستخدام الطول الموجي المحدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "معايرة نوع" ، حدد 1 ترتيب الحادي والعشرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحقل "عدد من موجات" ، حدد 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "تركيز وحدة" ، أدخل نانوغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجازة غير محددة خانات "لمعايرة يدوي" و "القوة من خلال منحنى الصفر". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "الأرقام العشرية بعد نقطة" الحقل ، حدد 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "السفلى تركيز الحد" ، أدخل 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "أعالي تركيز مجال الحد ، أدخل 10000. </li></ul> الآن انقر على علامة التبويب "الصك" وجعل التحديدات التالية. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="الشكل 4"> الشكل 4. تحليل أسلوب النافذة ، التبويب الصك <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "وضع البيانات :" حقل ، حدد الإسفار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> "سرعة التقطيع" حقل غير نشط في هذا الوقت ، يتم استخدامه فقط لقياس تفسفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "الموجي النمط" ، حدد كلا WL الثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "EX / WL1" دخول 480nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "EM / WL1" حقل إدخال 520nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كافة الحقول الأخرى بموجب EX وEM غير نشطة في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "شق EX" حقل حدد 5.0nm سحب من أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "شق EM" حقل حدد 5.0nm سحب من أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجازة غير محددة المربع أمام "الجهد PMT 1 - 1000V" الميدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "PMT الجهد" الحقل ، حدد 700V سحب من أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "كالك سيارات الإحصائية. رقم" حقل حدد 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مجال "يعيد" حدد 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "تكامل الوقت" حدد 0.1s &lt;/ لى&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحقل "تأخير" أو تحديد دخول 0s. </li></ul> انقر فوق علامة التبويب "مراقب". <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="الشكل 5"> الشكل 5. تحليل أسلوب النافذة ، التبويب مراقب. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "محور Y" ، "الحد الأقصى :" حقل ، حدد 10000 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في "محور Y" ، "الحد الأدنى :" حقل ، حدد 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المربع الموجود على يسار "فتح تجهيز البيانات بعد الحصول على البيانات". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجازة غير محددة المربع الموجود على يسار "طباعة التقرير بعد الحصول على البيانات" ، إلا إذا كنت تريد التقرير المراد طباعتها تلقائيا بعد الانتهاء من القراءات. </li></ul> انقر فوق علامة التبويب "تقرير" ، انظر الشكل 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="الشكل 6"> الشكل 6. تحليل أسلوب النافذة ، تبويب التقرير. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان "إخراج" ، حدد تقرير طباعة من القائمة المنسدلة. هل يمكن أيضا تحديد "استخدام تعليمات Microsoft Excel" إذا كنت تريد أن البيانات التي تم تصديرها إلى Excel ، أو "مولد طباعة ورقة استخدام" في حالة استخدام الوظيفة اختياري على مولد تقرير البرنامج الذي سيسمح توليد مخصص التقارير المقدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق خانات للعناصر التي تريد إدراجها في التقرير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ جميع المعلمات في تحديد علامات تبويب مختلفة من النافذة "تحليل أسلوب" ، انقر مرة أخرى على علامة التبويب "عام" وحفظها تحت اسم ملف ومكان حيث يمكن العثور عليها لاستخدامها في المستقبل ، وانقر على " موافق "الزر لإغلاق هذه النافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا اكتمال إعداد المعلمات اختبار الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن سنقوم بإعداد microplate القارئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="رمز 2"> زر ، والذي سيجلب إطار الإعداد MPR على القمة. </li></ul> حدد آبار للمواصفات والعينات في إطار التبويب MPR / اللوحة الإعداد ، كما هو مبين في الشكل 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="الشكل 7"> الشكل 7. MPR إطار الإعداد ، التبويب اللوحة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على موقف A1 واسحب الماوس لE1 ، ثم انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="رمز 3"> الزر. وهذا اختيار المواقف التي ستستخدم لهذه المعايير. وسيتم تسليط الضوء تلك المواقف في اللون الأخضر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن نحن بحاجة لتحديد المواقف F1 لH3 للعينات. انقر واسحب الماوس بدءا F1 في الموقف ، لوضع H3 ثم انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="رمز 4"> زر ، وتسليط الضوء على هذا تلك المواقف في اللون الأصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم كرر العملية نفسها للمناصب لE3 A2 ، لتحديد تلك المواقف لقياسات العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، دعونا تحميل ملف الفاصلة المفصولة متغير (CSV) ملف معدة مسبقا مع المعايير والمعلومات نموذج. </li></ul> انقر على "حسنا المعلومات" التبويب "نافذة الإعداد MPR" ، كما هو مبين في الشكل 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="الشكل 8"> الشكل 8. MPR إطار الإعداد ، حسنا التبويب معلومات. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="رمز 5"> الزر. وهناك نافذة مفتوحة ويندوز اكسبلورر الذي كما هو مبين في الشكل 9 ، الأمر الذي سيتيح تحديد مكان وجود "حسنا information.csv" ملف وتحميله. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="الشكل 9"> الرقم 9. كذلك تحميل معلومات العينة. بعد تحميل "حسنا معلومات" الملف ، فإن "المعلومات حسنا" تبدو كما هو مبين في الشكل 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="الرقم 10"> الرقم 10. تحميل معلومات العينة جيدا. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. Picogreen تحضير عينة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1X TE العازلة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملم EDTA) وذلك بإضافة 1 مل من 20 العازلة TE Xإلى 19 مل دي H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول الكاشف PicoGreen بإضافة 50 ميكرولتر 200 الكاشف PicoGreen X ل9.95 مل 1 العازلة TE X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معايير (لامدا dsDNA) بجعل التخفيفات المتسلسلة لdsDNA الأسهم (100 ميكروغرام / مل). إعداد أول حل من 50 ميكروغرام / مل dsDNA بإضافة 25 ميكرولتر من dsDNA الأسهم (100 ميكروغرام / مل) و 25 ميكرولتر 1 العازلة TE س. ثم تعد الحلول القياسية من خلال إضافة وحدات التخزين من dsDNA وأشار العازلة كما هو موضح في الجدول أدناه : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تركيز dsDNA </td><td> حجم dsDNA </td><td> حجم الاحتياطي </td></tr><tr><td> 1 ميكروغرام / مل </td><td> 20 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل dsDNA </td><td> 980 ميكرولتر 1 X TE العازلة </td></tr><tr><td> 0،1 ميكروغرام / مل </td><td> 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل dsDNA </td><td> 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة </td></tr><tr><td> 0.01 ميكروغرام / مل </td><td> 100 ميكرولتر من 0،1 ميكروغرام / مل dsDNA </td><td> 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة </td></tr><tr><td> 0،001 ميكروغرام / مل </td><td> 100 ميكرولتر من 0.01 ميكروغرام / مل dsDNA </td><td> 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. قياس المعايير والإسفار نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 150 ميكرولتر من كل معيار في آبار A1 - E1 من 96 لوحة جيدا ، في الشكل 7 ، وفقا للجدول التالي : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> جيد </td><td> معيار </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0،1 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0.01 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0،001 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TE العازلة </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 150 عينات غير معروفة في ميكرولتر F1 الآبار لH3 ، كما هو موضح في الشكل 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حل PicoGreen أعدت في الخطوة 1.2 في حوض مصمم للاستخدام ماصة متعدد القنوات. استخدام ماصة متعدد القنوات لتقديم حل PicoGreen 150 ميكرولتر من الآبار A1 - H3. حل المزيج بلطف مع المعايير وماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة في مكان مظلم ومنطقة الانتظار 2-5 دقائق للرد على تطوير. </li></ol> 4. ممثل النتائج يتم تقييم منحنى المعايرة جيدة باستخدام معلمات مختلفة يقدمها البرنامج F - 7000 على قياس المعايير وحساب منحنى المعايرة بواسطة البرنامج. معامل تقرير يشير الى الخير من يصلح لمعايير قياس والمعايرة منحنى المحسوبة. وهذه القيمة هي أقرب إلى "1" ، وأفضل تناسب قيمة قياس والمعايرة منحنى. إذا كانت القيمة هي أبعد ما تكون عن "1" ، لا بد من اعادة قياس المعايير ، التي أعدت مرة أخرى ، أو تغيير اللياقة البدنية للمنحنى المعايرة. ويبين الشكل 11 مثال على منحنى المعايرة مع احتساب معامل عزم = 0.99993 ، وحصل على تقدير من dsDNA باستخدام PicoGreen صباغة. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="الرقم 11"> الرقم 11. مثال على منحنى المعايرة dsDNA.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

ويعمل لويس مورينو ألف ولام كوكس كندرا تكنولوجيز التي كتبها هيتاشي أمريكا السامية التي تنتج الأداة المستخدمة في هذه المقالة.

pipetting الحذر أثناء إعداد العينات ، وكذلك باستخدام معمل مستقرة وحساسة مضان ضروري للحصول على نتائج جيدة وقابلة للتكرار. في قضية معمل مضان يستخدم لهذا الاختبار ، يقترح استخدام 300 ميكرولتر حجم العينة النهائية في القارئ microplate. انخفاض حجم يقلل من الحساسية ، وزيادة حجمها قد يسبب التلوث المتبادل بين الآبار.

<table><tbody><tr><td>ماء مقطر H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>كاشف</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>طقم مقايسة Quant-iT Picogreen dsDNA من Invitrogen</td><td>كاشف</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>أطباق ميكروية فلورية Nalge Nunc رقم القطعة 237108</td><td>مستلزمات</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>ماصة دقيقة Eppendorf ذات 12 قناة</td><td>مستلزمات</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>ماصة Eppendorf سعة 1000 &amp;mu;L</td><td>مستلزمات</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ماصة Eppendorf سعة 200 &amp;mu;L</td><td>مستلزمات</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ماصة سيرولوجية سعة 10 mL</td><td>مستلزمات</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>رقائق ألومنيوم</td><td>مستلزمات</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>رؤوس ماصات</td><td>مستلزمات</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز Hitachi F-7000 لقياس الطيف الفلوري مع برنامج FL Solutions 2.1</td><td>معدات</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>ملحق قارئ الأطباق الميكروية لجهاز F-7000</td><td>معدات</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

الكمي للdsdna باستخدام f - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ picogreen

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

الكمي من الحمض النووي ، وخصوصا في تجمعات صغيرة ومهمة هامة مع مجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك المعايير البيولوجية المقايسات البيولوجيا الجزيئية مثل تجميع وتنقية من الحمض النووي ، والتطبيقات التشخيصية مثل الكمي للمنتجات تضخيم الحمض النووي ، والكشف عن جزيئات الحمض النووي في قضايا المخدرات التحضيرات. خلال هذا الفيديو سوف نظهر قدرة الطيف هيتاشي F - 7000 الإسفار مجهزة التبعي بلايت القارئ الصغير لأداء dsDNA الكمي باستخدام المسابر الجزيئية كوانت ، أنه كاشف صبغ PicoGreen عدة. في الطيف F - 7000 الإسفار عروض حساسية عالية وقياسات سرعة عالية. وهو نظام مرن للغاية قادرة على قياس مضان ، التألق ، وتفسفر. طرق قياس عدة متاحة ، بما في ذلك فحص الطول الموجي والمسح الضوئي الوقت ، وقياس الضوء وقياس 3 - D الفحص. معمل لديه حساسية في مجموعة من 50 من picomoles فلوريسئين عند استخدام حجم العينة 300 ميكرولتر في microplate ، وقادر على قياس سرعة فحص 60000 نانومتر / دقيقة. كما أن لديها مجموعة واسعة ديناميكية تصل إلى 5 أوامر من حجمها والذي يسمح لاستخدام منحنيات المعايرة على طائفة واسعة من التركيزات. نظام بصري يستخدم كل البصريات الانعكاسية للطاقة القصوى والحساسية. النطاق الموجي هو معيار 200-750 نانومتر ، ويمكن أن تمتد إلى 900 نانومتر عند استخدام واحدة من photomultipliers اختياري الأشعة تحت الحمراء القريب. ويسمح نظام التحكم في درجة الحرارة اختياري للقارئ لوحة 5-60 درجة مئوية درجة الحرارة باستخدام اختياري للرقابة الخارجية دائري السائل. القارئ microplate يسمح للاستخدام من 96 microplates جيدا ، وقياس سرعة لمدة 96 بئرا أقل من 60 ثانية عند استخدام النمط حركية. ضوابط البرمجيات لF - 7000 ، وقارئ Microplate أيضا درجة عالية من المرونة. قد يتم تعيين العينات في عمود أو صف الأشكال سواء ، ويمكن اختيار أي مجموعة من الآبار للحصول على قياسات العينات. وهذا يسمح للاستخدام الأمثل للmicroplate. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح برنامج استيراد التكوينات الدقيقة لوحة عينة التي تم إنشاؤها في Excel وحفظها في قيم مفصولة بفواصل ، أو &quot;CSV&quot; تنسيق. يمكن حفظ تكوينات Microplate قياس وأشار من قبل البرنامج للحصول على الراحة وزيادة الإنتاجية. يمكن أن يكون الناتج نتائج البيانات لتقرير القياسية ، إلى Excel ، أو إلى تقرير برنامج مولد اختيارية.

مظاهرة الكمي للdsDNA باستخدام المسابر الجزيئية PicoGreen صبغ وهيتاشي الطيف الإسفار F - 7000 مجهزة التبعي microplate القارئ.

الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

يُعد تقدير كمية الحمض النووي (DNA)، لا سيما في التركيزات المنخفضة، مهمةً حيوية ذات نطاق واسع من التطبيقات البيولوجية، بما في ذلك البيولوجيا الجزيئية القياسية...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات قدرة مقياس الطيف الفلوري F 7, 000 المزود بقارئ الأطباق الدقيقة (Microplate reader) على إجراء تقدير كمي للحمض النووي DNA مزدوج السلسلة باستخدام صبغة Pico green. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير العينات والكواشف، وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إعداد الجهاز.تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تحميل العينات في قارئ الأطباق الدقيقة (Microplate reader). أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي إجراء قياس المعايير والعينات. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر منحنى معايرة خطي، والذي يمكن استخدامه لتقدير كمية الـ DNA مزدوج السلسلة في العينات المجهولة.قم بتشغيل مقياس الفلورية Hitachi F 7, 000 Spectra للسماح لمصباح الزينون بالإحماء لمدة ساعة واحدة في برنامج Excel. أنشئ ملفاً يحتوي على المعايير وبيانات العينات واحفظه بتنسيق القيم المفصولة بفاصلة أو بصيغة CSV. لإعداد مقياس الفلورية أولاً، انقر فوق زر الطريقة (method) الذي يفتح نافذة طريقة التحليل.في حقل القياس، اختر photometry من القائمة المنسدلة. انقر الآن على علامة تبويب quantitation. في حقل نوع التكميم، اختر wavelength للإشارة إلى أن قراءة الفلورة ستتم باستخدام طول موجي محدد.بالنسبة لنوع المعايرة، اختر المرتبة الأولى (first order)، وبالنسبة لعدد الأطوال الموجية، اختر واحداً. أدخل نانوغرام لكل ميليلتر كوحدة للتركيز. تأكد من عدم تحديد مربعي المعايرة اليدوية (manual calibration) وإجبار المنحنى على المرور بنقطة الصفر (force curve through zero)؛ وبالنسبة لعدد الخانات بعد الفاصلة العشرية، اختر خانتين، وأدخل صفراً في حقل الحد الأدنى للتركيز، و10,000 في حقل الحد الأعلى للتركيز.بعد ذلك، انقر فوق علامة تبويب الجهاز (instrument) وفي حقل وضع البيانات (data mode) اختر الفلورة (fluorescence). تحقق من أن حقل سرعة التقطيع (chopping speed) غير نشط لأنه يُستخدم فقط لقياسات الفسفرة (phosphorescence). في حقل وضع الطول الموجي (wavelength mode)، اختر WL fixed في حقل ex WL، وأدخل 480 nanometers في حقل EM WL.أدخل 520 nanometers. اترك جميع الحقول الأخرى تحت EX و EM غير نشطة. اضبط كلاً من شق الإثارة (ex slit) وشق الانبعاث (EM slit) على 5.0 nanometers.باستخدام القوائم المنسدلة، اترك المربع الموجود أمام حقل جهد PMT من 1 إلى 1000 فولت غير محدد. بالنسبة لجهد PMT، اختر 700 volts من القائمة المنسدلة. وأيضاً، اختر الرقم اثنين لـ auto statistic calc number، والرقم واحد لـ replicates، و0.1 seconds لـ integration time، والصفر لـ delay.الآن افتح علامة تبويب المراقبة (monitor) واضبط الحد الأقصى لمحور الصادات (why axis max) على 10,000 والحد الأدنى لمحور الصادات (why axis min) على صفر. ثم حدد المربع الموجود على يسار خيار "معالجة البيانات بعد الحصول عليها" (open data processing after data acquisition)، وإذا لزم الأمر، حدد المربع الموجود على يسار خيار "طباعة التقرير بعد الحصول على البيانات" (print report after data acquisition) للحصول على تقرير يتم طباعته تلقائياً عند الانتهاء من القراءات. وأخيراً، لحفظ جميع المعايير المختارة في علامات التبويب المختلفة بنافذة طريقة التحليل، انقر فوق علامة التبويب العامة (general) واحفظها باسم ملف جديد في موقع محدد.انقر على زر الموافقة لإغلاق هذه النافذة. بهذا يكتمل إعداد معاملات اختبار الجهاز. ولإعداد قارئ الأطباق الدقيقة، انقر على زر MPR لإظهار نافذة إعداد MPR في المقدمة.أولاً، حدد الآبار الخاصة بالمعايير. على سبيل المثال، انقر فوق الموضع A1 واسحب الماوس حتى الموضع E1، ثم انقر فوق زر مجموعة المعايير.سيؤدي هذا إلى تحديد المواضع التي ستُستخدم للمعايير كما هو موضح باللون الأخضر. بعد ذلك، حدد مواضع العينات. وبالمثل، انقر واسحب الماوس فوق المواضع المقابلة في اللوحة، ثم انقر على زر مجموعة العينات، والذي سيقوم تلقائياً بتظليل المواضع المحددة باللون الأصفر.استمر في تكرار العملية نفسها لمواضع قياسات العينات المطلوبة. لتحميل معلومات المعايير والعينات في ملف المتغيرات المفصول بفاصلة الذي تم إعداده مسبقاً، انقر فوق علامة تبويب معلومات الفجوة (well information) في نافذة إعداد MPR.حدد زر تحميل معلومات البئر (load well information) وستفتح نافذة مستكشف ويندوز (Windows Explorer) لتحديد ملف معلومات البئر بصيغة dot csv. بعد تحميل المعلومات، يجب أن تظهر النافذة على شكل جدول. من أجل تحضير محلول عمل من كاشف Pico green، أضف 50 µL من كاشف pico green بتركيز 200 X إلى 9.95 mL من محلول TE buffer.لإعداد منحنى القياس standard curve، قم بتحضير تخفيفات تسلسلية من Lambda double stranded DNA في محلول TE buffer بتركيزات نهائية تتراوح من 1 إلى 100 nanograms per milliliter، ثم انقل بواسطة الماصة 150 microliters من كل معيار إلى الآبار المخصصة في طبق 96 well plate. بعد ذلك، انقل 150 microliters من كل عينة اختبار إلى الآبار المخصصة المقابلة في الطبق. الآن وباستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 150 microliters من محلول Pico green إلى كل بئر، ثم اخلط المحلول مع عينات DNA.يتم تحضين الطبق برفق في منطقة مظلمة لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق حتى يكتمل التفاعل. انقر على زر شاشة عرض الـ MPR لإظهار نافذة إعداد الـ MPR في مقدمة الشاشة، ثم انقر على زر موضع التبادل. ستتحرك منصة حامل الطبق الدقيق نحو مقدمة الجهاز؛ افتح باب قارئ الأطباق الدقيقة وضع طبق الـ 96 بئرًا على منصة الحامل بحيث يكون البئر A1 متجهًا نحو المقدمة، ثم أغلق باب قارئ الأطباق الدقيقة.انقر على زر الموضع الأولي لوضع الموضع A لأحد ألواح المعايرة الدقيقة في موضع القياس. انقر على زر عرض الشاشة لإظهار نافذة القياس في مقدمة الشاشة. انقر على زر القياس لبدء قياس المعايير والعينات المجهولة.يتم تقييم منحنى المعايرة الجيد باستخدام المعلمات المختلفة التي يوفرها برنامج F 7, 000. على سبيل المثال، فإن منحنى المعايرة المثالي هذا الذي تم الحصول عليه لتقدير كمية DNA مزدوج السلسلة باستخدام صبغة Pico green لديه معامل تحديد محسوب قدره 0.99993. إن النظام عالي الإنتاجية الموصوف هو تجميع تسلسلي لتقنيات تشمل صبغة Pico Green، ومقياس طيف فلوري Hitachi F 7, 000 مزود بقارئ أطباق ميكروية (Microplate reader)، وبرنامج حاسوبي لأتمتة جمع البيانات وتخزينها وتحليلها وعرضها.يمكن لمزيج من التقنيات القوية أن يلبي الحاجة المتزايدة لتحليل كميات صغيرة من الـ double stranded DNA بدقة.

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوصف استخدام نظم microvolume NanoDrop كبدائل عملية وفعالة للحمض النووي التقليدية من خلال منهجية الكميات المظاهرة اثنين من بروتوكولات الكميات microvolume النووية الحمضية.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

نصف مقايسة رقمية لنقطة النهاية لقياس الأحماض النووية بقراءة مبسطة (تناظرية). نقيس التألق السائب للمقايسات الرقمية القائمة على القطرات باستخدام جهاز qPCR قياسي بدلا من الأجهزة المتخصصة ونؤكد نتائجنا عن طريق الفحص المجهري.

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

توضح هذه المخطوطة فحص المزدوجة الرقمي PCR التي يمكن استخدامها لتحديد وقت واحد المعوية النيابة. وعلامات وراثية HF183 كمؤشرات للتلوث برازي العام والمرتبط الإنسان في المياه الترفيهية.

وPCR الفحص دوبلكس الرقمي للوقت واحد الكمي ل<em&gt; المعوية النيابة.</em&gt; وما يرتبط بها من البراز-الإنسان HF183 علامة في المياه

ويرد هنا بروتوكول للتجارب الحنق عالية الدقة على مستوى جزيء واحد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه المنهجية لتحديد ثلاث حالات مطابقة في مجال الربط يجند من مستقبلات N-ميثيل-D-أسبارتاتي (نمدا). تحديد مسافات دقيقة هي الخطوة الأولى نحو بناء النماذج الهيكلية على أساس التجارب فريت.

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

يسمح هذا الأسلوب تلطيخ انتقائية والتقدير الكمي للدنا في المواد الهلامية بامتصاص الجل في "أخضر سيبر" أنا/الحل "نيترو تيترازوليوم الأزرق" وثم يعرضها لأشعة الشمس أو مصدر ضوء أزرق. وهذا ينتج من ترسبات مرئية وتتطلب تقريبا أي معدات، مما يجعله مثاليا للاستخدام الميداني.

الحمض النووي تلطيخ الأسلوب استناداً إلى هطول الأمطار Formazan الناجمة عن التعرض للضوء الأزرق

نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة التفاعلات الحمض النووي-البروتين بالتأمل الداخلي الإجمالي fluorescence مجهرية (تيرفم) استخدام ركيزة λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي وكم-نقطة المسمى البروتين.

تصور التفاعل بين المسمى قدوت البروتين والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي تم التعديل على مستوى جزيء واحد

يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة للكشف عن الارتباط بين المركبات وجزيئات البروتين ، مما يوفر مزايا الحد الأدنى من فقدان عينة البروتين ودقة البيانات العالية.

الكشف عن تفاعل البروتين والأمبيليفيرون CD40 عن طريق مضان المسح التفاضلي

تقدم هذه الدراسة مقايسة FRET نسبية بسيطة وسهلة الاستخدام للكشف عن نشاط DNase والتقييم الكمي لها ، وتوضح تطبيقه في تحليل النوكلياز الضعيف.

تقييم نشاط DNase عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري النسبي

يحدد هذا البروتوكول تصميم مجسات التهجين المنقسمة باستخدام أبتامر الإضاءة الفلورية DAP-10-42 كمراسل إشارة وتطبيقها للكشف عن الحمض النووي والتمايز بين الأهداف ذات بدائل أحادية النيوكليوتيدات.

مسبار التهجين المنفصل باستخدام أبتامر إضاءة فلورسنت للحمض النووي كمراسل إشارة لتحليل الحمض النووي الخاص بالتسلسل

يوفر هذا البروتوكول عمليات مفصلة حول تحضير العينات، وجمع البيانات، وتحليل أطياف الفلورة الجوهرية للحمض النووي.

التصوير الطيفي فائق الدقة لجزيئات الحمض النووي باستخدام التباين الذاتي

تعلم كيفية قياس dsDNA بدقة عالية باستخدام صبغة PicoGreen ومطياف الفلورة Hitachi F-7000 مع قارئ الألواح الدقيقة. يوضح هذا الإجراء إعداد العينات والمعايرة الخطية لتحديد تركيز DNA المجهول.

الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

استكشف المزيد من الفيديوهات