أسلوب Alternant لنموذج ناسا التقليدية تفريغ Hindlimb في الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنفيذ تفريغ حمولة الطرف الخلفي أو hu في الفئران باستخدام طريقة أبسط وأكثر مباشرة تقلل من الإجهاد الذي يتعرض له الحيوان. تنجح طريقة تعليق الذيل هذه في تحفيز ضمور الطرف الخلفي دون التأثير سلباً على الصحة العامة ووزن الجسم. تتمثل الخطوة الأولى في زرع حلقة ذيل في فأر بالغ.

من المهم تسجيل وزن الجسم والملاحظات الصحية طوال فترة الدراسة. بعد ذلك، يتم تجميع جهاز تفريغ حمل الطرف الخلفي ووضعه في القفص الذي ستتم فيه عملية التفريغ. وبمجرد تعافي الحيوان، يتم وضعه في الجهاز لبدء إجراء تفريغ الحمل.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على النتائج من خلال قياسات كل من كتلة الجسم وكتلة العضلات التي أظهرت ضموراً عضلياً في الأطراف الخلفية للفئران غير المحملة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تقنية Maori Holton للتثبيت، في أن جلد الذيل يظل مرئياً دائماً. كما أن الفئران لا تستطيع الخروج من جهاز التعليق أو العبث بالحلقة، وتتعافى بشكل أسرع وتحافظ على وزن جسم مستقر.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات فسيولوجيا الجهاز العضلي الهيكلي، وكذلك في بيولوجيا الجاذبية والفضاء، مثل كيفية منع ضمور العضلات الهيكلية وفقدان الكتلة العظمية بعد فترات طويلة من الخمول البدني، أو الراحة في الفراش، أو تثبيت الأطراف، أو الجاذبية الصغرى، أو الأمراض العصبية العضلية، ومع التقدم في السن. لقد خطرت لنا هذه الفكرة لأول مرة عندما واجهنا مضاعفات في تقنية تثبيت الذيل لـ Maury Holden؛ حيث كنا نفقد الحيوانات والبيانات التجريبية باستمرار بسبب هروب الفئران من جهاز تثبيت الأطراف الخلفية أثناء تطبيق هذه التقنية.

يشاركنا اليوم أندريه فيرارا، وهو باحث مشارك أول من مختبري، وتساعده جاكلين كريسي، طالبة الدكتوراه في المختبر، وأندرو دان، وهو طالب جامعي في المختبر أيضاً. ابدأ بتعقيم المنطقة الجراحية، ثم خدر فأراً بالغاً باستخدام isof fluorine، وبعد ذلك سجل وزن الفأر وضعه على وسادة تدفئة. جهز الذيل للجراحة عن طريق فركه بمحلول chlorhexidine.

ابدأ العد من نهاية شعر الجسم عند قاعدة الذيل لتحديد المسافة بين الفقرات الخامسة أو السادسة أو السابعة بين نتوئين عظميين على الذيل. استخدم ملقطاً شريانياً (hemostat) وإبرة قياس 20 5G لعمل ثقب تجريبي بين فقرتين وصولاً إلى المسافة بين الفقرات. أخرج الإبرة ثم أدخل خيط جراحة فولاذياً.

قم بالقص بطول 10 سنتيمتر من خلال الفتحة. يجب أن يبرز 5 سنتيمتر من خيط الجراحة من كلا جانبي الذيل. ضع طرف إبهامك على الذيل واستخدم يدك الحرة للف خيط الجراحة الفولاذي حول إبهامك.

قم بلف الطرفين لتشكيل حلقة كبيرة. يجب أن يكون طول الجزء الملتف أو الدائري حوالي 3 mm (بزيادة أو نقصان). قم بتثبيت خيط واحد من خيوط الجراحة باستخدام ملقط مرقئ (hemostat) واثنهِ لتشكيل حلقة أصغر، بحيث يكون طرفها متصلاً قدر الإمكان بالالتواء الموجود في الحلقة الكبيرة الأصلية.

قص الأسلاك الزائدة واثنِ السلك الملتوي للخلف. أوقف أي نزيف زائد باستخدام أعواد نترات الفضة. اترك الحيوان ليتعافى لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام قبل البدء في عملية تفريغ حمولة الطرف الخلفي أو hu بعد الجراحة.

يتم وضع المنزل المقتصد بشكل فردي لمنع تشابك حلقات الذيل. ضع قضيباً فولاذياً مجوفاً ومطلياً بعرض بوصة واحدة وسماكة ثلاثة أثمان فوق الجزء العلوي من القفص وثبته بالشريط اللاصق. أضف حلقة أخرى وصامولة مجنحة، ولكن لا تقم بإحكام ربطهما بالكامل للسماح بإجراء التعديلات لاحقاً.

أدخل المسمار الآلي عبر الثقب المركزي للبكرة لمنعها من السقوط. اربط صامولة قفل نايلون في نهاية المسمار الآلي. يجب أن تدور البكرة بحرية.

أدخل خطاف التثبيت (snap hook) الخاص بدوار الصيد عبر الجزء السفلي من البوبين (bobin). استخدم كماشة لتشكيل خطاف على شكل حرف S من مشبك ورق. أدخل أحد طرفي الخطاف الذي على شكل حرف S عبر فتحة دوار الصيد ثم أحكم إغلاقه باستخدام الكماشة.

ضع سلكاً على شكل حرف U موازياً للمسمار الآلي في الجزء الداخلي من القفص، ثم اثنِ الطرفين فوق الجانب. ولدعم زجاجة مياه ممتلئة، أدخل زجاجة مياه في السلك الذي على شكل حرف U بحيث يكون الصنبور متجهاً للأسفل، دون أن يلامس القاع. ثبت زجاجة المياه في القفص باستخدام شريط لاصق عريض.

قم بثني مشبك ربط بطول بوصتين لفتحه، مع ترك قوة شد كافية للإمساك بقطع قليلة من الطعام دون سحق الكريات قبل البدء في إجراء تفريغ حمولة الطرف الخلفي. سجل وزن الفأر لاستخدامه في المقارنات. لاحقاً، أدخل الطرف المفتوح من الخطاف الذي على شكل حرف S عبر الحلقة الأصغر البارزة من الذيل.

اضبط ارتفاع الفأر عن طريق ربط أو فك صامولة الجناح السفلية في مسمار الآلة. يجب ألا تكون الأطراف السفلية حاملة للوزن. وبمجرد الوصول إلى الارتفاع الأمثل، أحكم ربط صامولة الجناح العلوية، وأعد وضع زجاجة الماء بسلك مُشكل حديثاً بحيث لا يستطيع الفأر تسلق الصنبور بأطرافه الخلفية.

لقياس استهلاك الغذاء خلال الدراسة، قم بوزن الكريات قبل وضعها في مشبك التثبيت. وفر حوالي 8 إلى 10 غرامات للسماح باستهلاك حوالي 5 إلى 6 غرامات من العلف يومياً. لكل موضع فأر، ضع مشبك التثبيت الذي يحتوي على الغذاء في قاع القفص بحيث لا يتمكن الفأر من التسلق فوقه، وثبته باستخدام شريط لاصق عريض.

استخدم قطع "Gores" بمقاس بوصتين في بوصتين بشكل فضفاض. لف طرف الخيط حول دوارة الصيد. لف قطعة صغيرة من طرف الخيط حول قطع "Gores" لتثبيتها بالخيط.

تعد هذه الخطوة مهمة لمنع تدلي الذيل نحو الأسفل، مما يؤدي إلى تجمع الدم في الطرف وتخلق الذيل. كرر الإجراء نفسه لحيوان إضافي على الجانب الآخر من القفص. عند إيواء حيوانين في القفص الواحد، ضع بينهما مسافة تسمح لهما بملامسة بعضهما البعض تقريبًا.

في منتصف القفص. أضيف كمية صغيرة من فراش الذرة إلى القفص، مع التأكد من أنها ليست كافية لتمكين الفأر من استخدامها لتكوين كومة. بعد إجراء عملية تفريغ تحميل الطرف الخلفي، يتم إخراج الحيوان من الجهاز وإزالة حلقة الذيل.

باستخدام قاطعة أسلاك، قم بتسجيل وزن الجسم ثم أعد الحيوان إلى قفصه لاستعادة عافيته. وبعد فترة النقاهة، يتم وزن الحيوانات مرة أخرى وقياس كتلة العضلة النعلية والكتل الكظرية. لم تكن أوزان الجسم قبل جراحة قطع الذيل مختلفة بشكل ملحوظ عن الأوزان بعد خمسة أيام من الجراحة وقبل hu.

على الرغم من أن تفريغ حمولة الطرف الخلفي لمدة 14 و28 يوماً أدى إلى فقدان طفيف ولكن غير معنوي في كتلة الجسم، إلا أن الفئران استعادت أوزان أجسامها السابقة لعملية HU بشكل كامل بعد ثلاثة أيام من التعافي. يظهر هنا استهلاك الغذاء لكل من فئران التحكم المتنقلة وفئران HU.

لم يختلف متوسط التناول اليومي للغذاء في الفئران التي خضعت لتعليق الطرف الخلفي (HU) على مدار 28 يوماً مقارنة بمجموعات الضبط. لُوحظ ضمور معنوي في العضلة النعلية بعد تعليق الطرف الخلفي لمدة 14 و 28 يوماً، مما يشير إلى فعالية الإجراء بعد ثلاثة أيام من التعافي. كانت كتلة العضلة النعلية أكبر معنوياً من كلتا مجموعتي تعليق الطرف الخلفي، ولكنها ظلت أقل معنوياً من حيوانات الضبط التي تتحرك بحرية.

تم استئصال الغدتين الكظريتين اليمنى واليسرى ووزنهما لتوفير مؤشر على مستوى الإجهاد لدى الحيوان. وكما هو موضح هنا، كانت متوسطات الأوزان متقاربة بين فئران المجموعة الضابطة وفئران HU. وبمجرد إتقان العملية الجراحية لتفصيل الجسم، يمكن إكمالها في غضون 5 إلى 10 دقائق لكل فأر، كما يمكن إكمال إعداد القفص في غضون 15 دقيقة بعد هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل mice، وHein، وإعادة تحميل الأطراف والتعافي من الضمور الناتج عن عدم الاستخدام، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تعافي واستجابة الجهازين العضلي والعظمي لفترات عدم الاستخدام الطويلة هذه.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، من المفترض أن تكون قد اكتسبت فهماً جيداً لكيفية إجراء عملية تفريغ حمولة الأطراف الخلفية في الفئران. تتيح هذه التقنية دراسة أنسجة وأجهزة متعددة، مثل الجهاز القلبي الوعائي، والجهاز العضلي الهيكلي، والنسيج الخلالي تحت ظروف التحميل وإعادة التحميل، وباستخدام مجموعة متنوعة من نماذج الفئران مثل نماذج التعطيل الجيني (knockouts) أو الإدراج الجيني (knockins).