Name: تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: تعلم عزل الخلايا السلفية العضلية والدهنية من عضلات الهيكل العظمي للفئران باستخدام الهضم الإنزيمي وفرز الخلايا المُنشَّطة بالفلورية. تُحسّن هذه الطريقة قابلية الخلايا للحياة وتتيح دراسة التجدد النسيجي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الهدف من هذا البروتوكول هو تحقيق توازن معقول بين عوائد عالية وقابلية عالية للخلايا النقية. الخطوة الأكثر أهمية في ضمان أن يتم استرداد الخلايا السليمة وكما كان متوقعا ، وتفكك النسيج الأنزيمية للانطلاق. وينبغي التعامل مع الأنسجة بشكل خاص أن يكون لطيف ، والتي من الصعب إثبات أو حتى نقدر في شكل السمعي البصري. عاملا رئيسيا آخر هو طول الداخلي. أطول يستغرقه الانتقال من الجهة المانحة إلى الحيوان المتلقي ، وأقل جدوى ، وبالتالي كفاءة engraftment. يجب أن يكون هناك أي سؤال حول الجدوى التي لم يتم الإجابة على الفور من خلال النظر في وتيرة الحدث PI إيجابية في عينات خلايا النقي بعد الفرز ، ونقترح أن يتم إجراء فحص لقياس الحد من تخفيف clonogenicity 3. أنواع نموذجية من العضلات غير التالفة العائد بشكل روتيني حوالي 1 في 15-20 خلايا قادرة على الشروع في المنشأ العضلي الليفي أو / مكون الشحم المستعمرات في المختبر. بينما اساسا 100 ٪ من المستعمرات التي انطلقت من النواب تتضمن myotubes متباينة ، إلا حوالي ثلث عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها من FAPs تحتوي على الخلايا الشحمية ، بالإضافة إلى سلسة myofibroblasts أكتين العضلات إيجابية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> كولاجيناز الثاني </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C - 6885 ، </td><td> 500 ش / مل </td></tr><tr><td> كولاجيناز D </td><td> روش </td><td> 11088882001 </td><td> 1.5 ش / مل </td></tr><tr><td> تهجير الثاني </td><td> روش </td><td> 04942078001 </td><td> 2.4 ش / مل </td></tr><tr><td> خلية مصفاة </td><td> دينار بحريني </td><td> 352340 </td><td> 40 ميكرون </td></tr><tr><td> أنبوب مصفاة مع خلية </td><td> دينار بحريني </td><td> 352235 </td><td> 40 ميكرون </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> B2261 </td><td> 2-5 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> CD31 - FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> استنساخ 390 </td></tr><tr><td> CD45 - FITC </td><td> المنزل الذي أدلى </td><td></td><td> استنساخ I3 / 2 </td></tr><tr><td> Sca1 - PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> استنساخ D7 </td></tr><tr><td> α - 7 إنتغرين APC </td><td> المنزل الذي أدلى </td><td> استفسار مع مختبر روسي </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

يحتوي على العضلات والهيكل العظمي من السكان من أصول متعددة السلف جنينية متميزة وإمكانات النمو. الأسلاف عضلي ، ويقيم عادة في &quot;خلية موقف فضائية&quot; بين غشاء البلازما myofiber والغشاء القاعدي laminin الغنية التي ensheaths عليه ، وتجديد الخلايا الذاتية التي تلتزم فقط إلى 1،2 النسب عضلي. وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة من الدرجة الثانية من أسلاف السفينة المرتبطة بها والتي يمكن أن تولد خلايا شحمية بيضاء وmyofibroblasts ، الذي يستجيب للضرر عن طريق إدخال بكفاءة الانتشار وتقدم الدعم الغذائي للخلايا المنشأ العضلي أثناء تجديد الأنسجة 3،4. واحدة من المقايسات الأكثر ثقة لتحديد إمكانات نمو والتجدد من السكان تعتمد على خلية معينة من عزلتهم وزرع 5-7. تحقيقا لهذه الغاية ونحن الأمثل لتنقية البروتوكولات من خلال التدفق الخلوي من العضلات نأت إنزيمي ، وهو ما سيوضح في هذه المقالة. سوف السكان الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تحتوي على أي خلايا مولدة للعضل أو مستعمرة الليفي / تشكيل مكون الشحم : لا يوجد أنواع الخلايا الأخرى قادرة على التوسع في المختبر أو على قيد الحياة في الجسم الحي التسليم. ومع ذلك ، عندما يتم استخدام هؤلاء السكان على الفور بعد فرز للتحليل الجزيئي (مثلا qRT - PCR) واحد يجب أن نضع في اعتبارنا أن مجموعات فرعية فرزها حديثا قد تحتوي على خلايا الملوثات الأخرى التي تفتقر إلى القدرة على تكوين مستعمرات أو engrafting المتلقين.

طريقة لتفارق الأنزيمية ، ووضع العلامات السطحية وتنقية بواسطة الخلوي تدفق الليفي / مكون الشحم والأسلاف عضلي من الهيكل العظمي والعضلات الفئران.

تحتوي العضلة الهيكلية على مجموعات متعددة من الخلايا السلفية ذات أصول جنينية وقدرات تطورية متميزة. وتستقر الخلايا السلفية المكونة للعضلات عادةً...

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل خلايا سلفية عضلية ودهنية قابلة للحياة من العضلات الهيكلية المتقابلة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصاد الأنسجة العضلية من الفئران التي تم قتلها رحيمًا. وكخطوة ثانية، يتم هضم العينة إنزيميًا، مما يؤدي إلى تفكيك النسيج إلى خلايا مفردة.يُستخدم بعد ذلك فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لعزل الخلايا السلفية. ويتم الحصول على نتائج تُظهر حيوية وتمايز الخلايا المعزولة عند زرعها في فئران مستقبلة، وذلك استناداً إلى الصبغ الكيميائي النسيجي للوسم الجيني، والذي يكون في هذا المثال هو الفوسفاتاز القلوي البشري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات السابقة مثل prepl في إمكانية عزل الخلايا مباشرة من الحيوان في نقاط زمنية مختلفة.على سبيل المثال، بعد تحفيز تلف الأنسجة، وهو ما يعني عدم وجود انتقاء في الجمهرة الخلوية، يمكن تحليل هذه الجمهرة على المستوى الجزيئي لدراسة المراحل المختلفة التي تمر بها الخلايا خلال عملية التجديد في الجسم الحي. لذا، يمكن لهذه التقنية أن تساعد في الإجابة على سؤال محوري في مجال تجديد الأنسجة، وبالأخص: ما الدور الذي يلعبه كل نوع من الخلايا أثناء التجديد في الجسم الحي، وكيف تتفاعل هذه الأنواع الخلوية مع بعضها البعض لإعادة بناء نسيج صحي؟ وتمتد آثار هذه التقنية لتشمل علاج أمراض مثل الحثل العضلي.حيث إن دراسة هذه الخلايا السلفية يمكن أن تتيح في نهاية المطاف استراتيجيات تجديدية لهذا النوع من الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، تمتد تطبيقات هذه التقنية إلى عدد من الأنسجة الأخرى التي تتراوح من القلب إلى الأنسجة الدهنية، وذلك لأن الخلايا السلفية الليفية الدهنية قد وُجدت على الأقل في كل نسيج تم اختباره حتى الآن. وبوجه عام، سيواجه المبتدئون في هذه التقنية بعض الصعوبات لأن تقنيات التفكيك القاسية ستقلل من حيوية الخلايا وستؤدي إلى تكوين الكثير من الحطام، مما سيتداخل لاحقاً مع الفصل النظيف للخلايا.لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قررنا تطبيق قياس التدفق الخلوي، والذي يُستخدم عادةً لخلايا APOE، في دراسة الخلايا الجذعية في الأنسجة الصلبة. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً هاماً لأن خطوات تفكيك الأنسجة يصعب تعلمها نظراً لصعوبة وصفها بشكل دقيق. سيقوم بعرض هذه التقنية اليوم لينكي، وهو مساعد باحث في مختبري، وهو من قام بتطوير هذه التقنية وتحسينها لأول مرة. يتطلب هذا الإجراء وجود فأرين على الأقل.يُستخدم فأر واحد لجمع الخلايا من أجل توفير ضوابط اللون الواحد وضوابط النمط المناعي للأجسام المضادة اللازمة، بينما يوفر الفأر الآخر العينة المراد فرزها. للبدء، يتم إحضار فئران تتراوح أعمارها بين 7 و12 أسبوعاً سبق قتلها رحيماً داخل غطاء مختبري معقم. يُوضع الفأر الذي تم قتله رحيماً على منشفة ورقية معقمة بحيث يكون وجهه للأعلى، ويُرش الفراء جيداً بـ 70%ethanol لمنع التلوث، مع الإمساك بملقط في يد ومقص حاد في اليد الأخرى.ارفع الجلد في منطقة البطن وأجرِ شقاً طولياً صغيراً. أمسك الجلد على كل جانب من جوانب الشق وقم بسحبه للخلف للكشف تماماً عن عضلات الطرف الخلفي. بعد ذلك، استأصل النسيج العضلي عن طريق إدخال المقص وهو مغلق تحت العضلة وفوق عظمة الظنبوب (tibia) ثم فتح المقص.ستعمل الحافة الخلفية للشفرات على فصل العضلة عن tibia بلطف. كرر هذه العملية لكل من جانبي tibia وضع النسيج في طبق Petri بقطر 60 millimeter. الآن، قم باستئصال النسيج العضلي من femur بنفس الطريقة وأضف النسيج إلى طبق petri.كرر العملية لكل فأر باستخدام طبق بتري واحد لكل فأر. بعد ذلك، قم بتفريق النسيج إلى خلايا مفردة. أضف 2 mL أو 1000 units من الكولاجيناز (collagenase)، و 20 µL من المحلول المخزني لكلوريد الكالسيوم بتركيز 250 mM إلى كل طبق بتري يحتوي على النسيج العضلي.بعد ذلك، وبسرعة وعناية، استخدم ملقطين رماديين، أحدهما مسنن والآخر بسنين، لتمزيق النسيج إلى قطع بحجم 1 mm³ واحدة. قم بإزالة والتخلص من أكبر قدر ممكن من الأنسجة غير العضلية.قم بتغطية أطباق بيتري واحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد انتهاء فترة الحضن، استخرج الأطباق وأعدها إلى غطاء المختبر المعقم. أزل مكبس حقنة سعة ثلاثة ملليلتر واستخدمه لهرس النسيج.استخدم مكبساً واحداً لكل طبق لتجنب التلوث الخلطي. أضف حوالي 5 milliliters من محلول PBS المعقم والبارد إلى كل طبق بتري، ثم انقل محتويات الطبق إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اشطف الطبق بـ 5 milliliters إضافية من محلول PBS لاستعادة جميع الأنسجة وإضافتها إلى الأنبوب المخروطي.اغسل العينات وقم بطردها مركزياً ثلاث مرات وفقاً للبروتوكول. بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول يتكون من collagenase D dys space two وكلوريد الكالسيوم إلى كل أنبوب، ثم حضنه عند 37 °C مع التدوير لمدة ساعة واحدة. بعد التحضين، أضف 5 mL من PBS المعقم البارد إلى الأنابيب، وقم برج الأنابيب باستخدام جهاز vortex لفترة وجيزة، ثم أجري عملية التritration عدة مرات لتفكيك التكتلات.املأ الأنابيب بمزيج PBS وامزج جيداً ثم ضعها على الثلج. ولإزالة أي قطع متبقية كبيرة من الأنسجة، ضع مصفاة خلايا بمسام 40 ميكرون فوق أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر على الثلج وقم بترشيح معلق الخلايا. قسم السائل المترشح بالتساوي في ثلاثة أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر مملوءة بـ PBS بارد ومعقم، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 1600 RPM لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 8 °C. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي بعناية وضع الخلايا على الثلج لصبغ وفرز الخلايا السلفية العضلية والدهنية.أولاً، قم بإعداد ضوابط الخلط لصبغ الألوان المنفردة الستة وفقاً للبروتوكول المكتوب المرفق. وتشمل هذه الضوابط صبغة hulk بدون صبغة، ويوديد البروبيديوم، والأجسام المضادة المسمى بـ FSE لكل من CD 31 و CD 45، والجسم المضاد المسمى بـ SC one P size seven، والجسم المضاد المسمى بـ alpha seven A PC. بعد ذلك، قم بإعداد خلائط صبغ ضوابط النمط الإيزotypي لثلاثة أجسام مضادة وفقاً للبروتوكول المكتوب.بمجرد تحضير خلائط الصبغ، يتم وضع ملصقات على تسعة أنابيب إبندورف سعة 1.5 مل لعينات اللون الواحد وعينات الضابط من النمط المتماثل (isotype control). يتم إعادة تعليق ودمج الخلايا من الأنابيب المخروطية الثلاثة في حجم إجمالي قدره 1 مل من محلول FACS buffer. بعد ذلك، يتم توزيع 100 µL من الخلايا في كل أنبوب إبندورف ضابط مُصنف، ثم تُنقل بواسطة الماصة كمية تتراوح بين 5 و10 µL من خلائط الصبغ إلى أنابيب الضبط المقابلة، وذلك بناءً على تركيز الأجسام المضادة.أعد تعليق الخلايا المأخوذة من الفأر العينة في 200 µL من منظم الفاكس (fax buffer) واجمعها في أحد الأنابيب المخروطية سعة 50 mL. ثم أضف 800 µL من خليط الأجسام المضادة. اخلط كل واحد من أنابيب التحكم وأنابيب العينة.يتم تحضينها على الثلج لمدة ساعة واحدة. بعد التحضين، تُغسل الخلايا بإضافة 1 mL من منظم الفاكس (fax buffer) إلى كل من أنابيب التحكم التسعة، وحوالي 20 mL من منظم الفاكس إلى أنبوب العينة. تُفصل أنابيب التحكم بجهاز الطرد المركزي بسرعة 3000 RPM لمدة خمس دقائق.قم بطرد أنبوب العينة المخروطي مركزياً بسرعة 1600 RPM لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بسحب والتخلص من الرائق الناتج عن عملية الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا الضابطة في كل أنبوب بنهاية دائرية باستخدام 1 مل من fax buffer، وأعد تعليق خلايا العينة في 4 مل من fax buffer.أضف propidium iodide إلى خلايا العينة وضوابط isotype، وكذلك إلى أنبوب ضابط اللون الواحد pi. انقل الخلايا إلى أنابيب fax عبر غطاء مصفاة الخلايا لإزالة أي تكتلات متبقية قد تؤثر على جهاز قياس التدفق الخلوي.قم بإعداد جهاز الفاكس (fax) باستخدام لون واحد وعناصر تحكم من النوع النظيري (isotype controls). قم بفرز خلايا العينة وفقاً للبروتوكول المكتوب المرفق واجمع كل مجموعة بشكل منفصل في أنبوب تجميع سعة 3.5 milliliter. وتعتبر السلائف العضلية الحيوية هي المجموعة التي تكون موجبة لـ hulked و alpha seven a PC، وسالبة لـ PI و CD 31 FE و CD 45 FE و ska.تكون السلائف العضلية التي تحمل العلامات One PE size seven negative وviable adipogenic progenitors ضخمة، وتكون ska one PE size seven positive وpi CD 31 FE CD 45 FE وalpha seven a PC negative. يمكن أن ينتج الفأر الواحد من النوع البري (wild type) حوالي 1×10⁵ من السلائف العضلية (adipogenic progenitors)، ومن 1.5 إلى 2×10⁵ من السلائف العضلية (myogenic progenitors) مع حيوية تزيد عن 95%.لتحضير الخلايا لزراعتها في الفئران المضيفة، يتم غسل الخلايا. أولاً، يتم طرد الخلايا المشوهة مركزياً بسرعة 1500 RPM لمدة خمس دقائق. يتم إزالة السائل الطافي، ثم إعادة تعليق الخلايا في 500 microliters من PBS ونقلها إلى أنابيب einor.قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 3000 RPM لمدة خمس دقائق وأزل الطافي. بعد ذلك، أعد تعليق السلف العضلية في PBS أو السلف الدهنية في matrigel بتركيز تقريبي يبلغ 10^6 خلية لكل مليليتر. بعد تحضير الفئران المضيفة المخدرة لكل نوع من الخلايا المانحة، وفقاً للبروتوكول المكتوب، استخدم حقنة إنسولين سعة 0.3 سنتيمتر مكعب لحقن 20 µL تحتوي على ما يقرب من 20,000 خلية من السلف العضلية أو الدهنية.اترك الوقت الكافي للخلايا المزروعة لتتمايز، وعادة ما تكون هذه المدة حوالي ثلاثة أسابيع. بعد ذلك، قم بعزل النسيج المستهدف وتجهيزه للتقطيع بالتجميد (cryosectioning) كما هو موضح في البروتوكول في هذا الشكل؛ حيث يتم توضيح استراتيجية الفرز لعزل أسلاف الخلايا المكونة للدهون والخلايا المكونة للعضلات، وتم تحديد الخلايا الحية بناءً على التشتت الأمامي (forward scatter) والتشتت الجانبي (side scatter)، واستُخدم صبغ Hoechst لاستبعاد الحطام النووي، بينما استُخدم صبغ يوديد البروبيديوم أو PI لاستبعاد الخلايا الميتة. بعد ذلك، تم استبعاد الخلايا المكونة للدم والخلايا البطانية، أي خلايا CD 45 وCD 31 على التوالي، من بوابات الفرز. وفي النهاية، يتم تحديد المجموعة الفرعية الموجبة لـ alpha seven.تحتوي العينة السالبة لـ SKA one على جميع السلائف العضلية والمجموعة السالبة لـ alpha seven. بينما تحتوي العينة الموجبة لـ SKA one على جميع السلائف الدهنية. وتؤكد ضوابط النظائر من نوع fluorescence minus one خصوصية الصبغ. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء فحوصات نقاوة للمجموعات الفرعية الدهنية والعضلية.بعد الفرز في هذا المثال التمثيلي، يمكن تحديد الخلايا المانحة السلفية المكونة للدهون التي تعبر عن الفوسفاتاز القلوي البشري المعدل وراثياً والمحقونة تحت الجلد في أنسجة المضيف عن طريق الكيمياء النسيجية، كما يتضح من التلوين البني. كما تم تحديد الخلايا المانحة السلفية المكونة للعضلات التي تعبر عن الفوسفاتاز القلوي البشري المعدل وراثياً والمحقونة داخل العضلات في هذا المقطع النسيجي كما يظهر باللون البني.باستخدام الكيمياء النسيجية؛ وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون خمس ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. أما في حال معالجة المزيد من العينات، فستزداد المدة الزمنية. ومن المهم تذكر العمل بسرعة ورفق أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء.لذلك، تجنب معالجة عدد كبير جداً من العينات في وقت واحد. إن إطالة وقت المعالجة سيقلل بشكل كبير من تباين الخلايا بعد هذا الإجراء. يمكن أيضاً إجراء طرق أخرى مثل تحليل تعبير colono SC OG عن طريق quantitative R-T-P-C-R للإجابة على أسئلة إضافية مثل: كيف تستجيب هذه الخلايا السلفية للتلف في الجسم الحي بعد تطورها؟مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الآخرين في مجال تجديد الأنسجة لاستكشاف التواصل المتبادل بين الخلايا السلفية في الأنسجة التالفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تفكيك هذه الأنسجة دون إتلافها. يتم تحديد الخلايا السلفية بناءً على علاماتها السطحية وتحليل قدراتها التطويرية في vivo.شكرًا للمشاهدة. بالتوفيق في تجربتكم.

purification-of-progenitors-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

العزلة وثقافة السكان نقية من الخلايا الأقمار الصناعية هادئة، والسكان الخلايا الجذعية العضلية، أمر ضروري لفهم العضلات الجذعية بيولوجيا الخلايا وتجديدها، فضلا عن زرع الخلايا الجذعية لعلاج ضمور العضلات في والأمراض التنكسية الأخرى.

العزلة والثقافة، وزرع خلايا العضلات الأقمار الصناعية

الأوعية الدموية داخل الميناء الهيكل العظمي والعضلات العديد من السكان السلائف متعددة النسب البشرية التي هي مثالية لتطبيقات التجدد. هذه الطريقة العزلة يسمح تنقية وقت واحد من ثلاثة السكان الخلية متعددة القدرات السلائف على التوالي من ثلاث طبقات الهيكلية الأوعية الدموية: خلايا المنشأ العضلي من البطانية البطانية، pericytes من وسائل الإعلام، وخلايا الغلالة البرانية من البرانية.

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

هنا، نحن تصف البروتوكول استنادا إلى إعادة برمجة جينية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) نحو توليد السكان متجانسة من الأسلاف العضلات والهيكل العظمي أنه في ظل ظروف ثقافة متساهلة تشكيل مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres)، والتي تلخص السمات البيولوجية البشرية عضلات الهيكل العظمي.

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

في الثقافة المختبر أثبتت أنظمة لا غنى عنها في فهمنا لتكون العضل الفقاريات. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن تنمية العضلات والهيكل العظمي nonmammalian والنمو، لا سيما في الأصناف القاعدية. بروتوكول كفاءة وقوية لعزل الخلايا الجذعية البالغة من هذا النسيج، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، والحفاظ على التجديد الذاتي، والانتشار، وتمايز في إطار الثقافة الأولية يسمح لتحديد آليات تنظيمية والحفظ في جميع أنحاء متباينة الأنساب الفقاريات.

إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب

&lt; p class = 'jove_content'&gt; أنواع الخلايا الملتصقة الرئيسية المشتقة من العضلات البشرية هي الخلايا العضلية والخلايا الليفية. هنا ، يتم إثراء مجموعات الخلايا باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا بناء على مستضد CD56. يسمح وضع العلامات المناعية اللاحقة بأجسام مضادة محددة واستخدام تقنيات تحليل الصور بالقياس الكمي للخصائص السيتوبلازمية والنووية في الخلايا الفردية.

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

يصف هذا البروتوكول وسيلة قوية، يمكن استنساخه وبسيطة من العزلة والثقافة من الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية السلف من العضلات والهيكل العظمي من الكبار والمسنين. وتشمل العضلات المستخدمة هنا القدم وعضلات الساق. هذا النهج يمكن عزل السكان المخصب من myoblasts الأولية للدراسات وظيفية.

إعداد والثقافة من الخلايا عضلي السلائف / Myoblasts الابتدائية من العضلات الهيكلية من الكبار والمسنين البشر

هنا، نحن تصف منهجية للحصول على السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من الأنسجة العضلية الكبار. وتستخدم هذه الخلايا لدراسة في المختبر التمايز العضلات والهيكل العظمي، وعلى وجه الخصوص، لدراسة البروتينات المشاركة في كا 2 + الإشارات.

عزل ميوبلاستس الإنسان، تقييم التمايز العضلي، وقياس دخول الكالسيوم التي تديرها المخازن

نقدم تقنيات لعزل خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) التي تم الحصول عليها من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية، وزراعة وتميزها، وتميزها.  ويمكن استخدام hMPCs التي تم الحصول عليها وتتميز من خلال هذه الأساليب لمعالجة الأسئلة البحثية المتعلقة بعضلة عضلية الإنسان وتجديد العضلات الهيكلية.

العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية

يعد التحديد الدقيق للخلايا السلفية الليفية الدهنية المنشأ (FAPs) والخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) أمرا بالغ الأهمية لدراسة وظيفتها البيولوجية في الحالات الفسيولوجية والمرضية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات لعزل وتنقية وزراعة FAPs و MuSCs من عضلات الفئران البالغة.

FACS-عزل وثقافة السلف الليفي الأديبوجينيك والخلايا الجذعية العضلية من العضلات الهيكلية للفئران غير المضطربة والمصابة

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الجذعية العضلية والأسلاف الليفية المسببة للدهون من عضلات الهيكل العظمي الفردية في الفئران. يتضمن البروتوكول تشريح عضلة واحدة ، وعزل الخلايا الجذعية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، وتقييم النقاء عن طريق تلطيخ التألق المناعي ، والقياس الكمي لدخول المرحلة S بواسطة مقايسة دمج 5-ethynyl-2'-deoxyuridine .

عزل مجموعات الخلايا الجذعية الهادئة عن العضلات الهيكلية الفردية

يوفر هذا البروتوكول طريقة موحدة لعزل وإثراء الخلايا العضلية الأولية من عضلات الفئران العظمية البالغة وحديثي الولادة من خلال تفكك الأنسجة، والترشيح المتسلسل، والطلاء المسبق، وتحديد ظروف الزرعة، مما يمكن من إنشاء وصيانة مزارع الخلايا العضلية المشتقة من الأقمار الصناعية للتطبيقات التجريبية لاحقا.

عزل خلايا القمر الصناعي العضلي الهيكلي لدراسات تكوين العضلات في المختبر

تعلم عزل الخلايا السلفية العضلية والدهنية من عضلات الهيكل العظمي للفئران باستخدام الهضم الإنزيمي وفرز الخلايا المُنشَّطة بالفلورية. تُحسّن هذه الطريقة قابلية الخلايا للحياة وتتيح دراسة التجدد النسيجي.

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

استكشف المزيد من الفيديوهات