تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل الخلايا السلفية العضلية والشحمية القابلة للحياة من انعكاس العضلات الهيكلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الأنسجة العضلية أولا من الفئران الرحيم. كخطوة ثانية ، يتم هضم العينة إنزيميا ، مما يؤدي إلى فصل الأنسجة إلى خلايا مفردة.

بعد ذلك ، يتم استخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية أو الحقائق من أجل عزل الخلايا السلفية. يتم الحصول على النتائج التي تظهر صلاحية الخلايا المعزولة وتمايزها عند زرعها في الفئران المتلقية بناء على التلوين الكيميائي النسيجي للملصق الجيني ، والذي في هذا المثال هو الفوسفاتيز القلوي البشري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الموجودة مسبقا مثل prepl هي أنه يمكن عزل الخلايا مباشرة عن في نقاط زمنية مختلفة.

على سبيل المثال ، بعد إحداث تلف الأنسجة ، مما يعني أنه لا يوجد اختيار لمجموعة الخلايا ويمكن تحليل مجموعة الخلايا على المستوى الجزيئي للنظر في المراحل المختلفة التي تعبر فيها الخلايا أثناء عملية التجديد في الجسم الحي. لذلك يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على سؤال حاسم في مجال تجديد الأنسجة ، وعلى وجه الخصوص ، ما هو الدور الذي يلعبه كل نوع من الخلايا أثناء التجديد في الجسم الحي وكيف تتفاعل هذه الأنواع من الخلايا مع بعضها البعض لإعادة بناء الأنسجة السليمة؟ يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج أمراض مثل ضمور العضلات.

نظرا لأن دراسة هذه الأسلاف يمكن أن تمكن في النهاية من استراتيجيات التجدد لهذا النوع من الأمراض. بالإضافة إلى ذلك ، تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى عدد من الأنسجة الأخرى التي تتراوح من القلب إلى الدهون لأنه تم العثور على أسلاف الدهون الليفية على الأقل في كل نسيج اختبرناه حتى الآن. بشكل عام ، سيكافح الوافدون الجدد إلى هذه التقنية لأن تقنيات التفكك القاسية ستقلل من صلاحية الخلية وستخلق الكثير من الحطام ، مما سيتداخل بعد ذلك مع الفصل النظيف للخلايا لاحقا.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قررنا تطبيق قياس التدفق الخلوي ، والذي يستخدم عادة لخلايا APOE لدراسة الخلايا الجذعية في الأنسجة الصلبة. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمرا مهما حيث يصعب تعلم خطوات تفكك الأنسجة لأنه من الصعب جدا وصفها بشكل صحيح. سيكون إظهار هذه التقنية اليوم مرتبطا ، مساعد باحث في مختبري قام أولا بتطوير التقنية وتحسينها لهذا الإجراء ، يلزم وجود فأرين على الأقل.

يتم استخدام فأر واحد للخلايا لتوفير عناصر التحكم اللازمة في النمط الإسوي أحادي اللون والجسم المضاد للحقائق ، والآخر سيوفر العينة المراد فرزها. للبدء ، احصل على الفئران التي يتراوح عمرها بين سبعة و 12 أسبوعا والتي تم قتلها رحيما سابقا في غطاء مختبر معقم. ضع الفأر القتل الرحيم على منشفة ورقية معقمة ، ووجهه لأعلى ورش الفراء جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث بالملقط في يد ومقص حاد في اليد الأخرى.

ارفع الجلد في منطقة البطن وقم بعمل شق طولي صغير. أمسك الجلد على كل جانب من الشق وقشر الجلد لكشف عضلات الأطراف الخلفية تماما. بعد ذلك ، قم باستئصال الأنسجة العضلية عن طريق إدخال المقص المغلق أسفل العضلة وفوق الساق ثم فتح المقص.

ستجبر الحافة الخلفية للشفرات برفق على فصل العضلات عن الساق. كرر ذلك على جانبي الساق وضع الأنسجة في طبق بتري 60 ملم. الآن استئصال الأنسجة العضلية من عظم الفخذ بنفس الطريقة وأضف الأنسجة إلى طبق بتري.

كرر مع كل فأر باستخدام طبق بتري واحد لكل فأر. بعد ذلك ، قم بفصل الأنسجة إلى خلايا مفردة. أضف ملليلترين أو 1000 وحدة من الكولاجيناز ، واثنين و 20 ميكرولتر من محلول مخزون كلوريد الكالسيوم 250 ملليمولار إلى كل طبق بتري من الأنسجة العضلية.

ثم العمل بسرعة وبعناية. استخدم ملقطين رماديين ، أحدهما مسنن والآخر بأسنان لتمزيق الأنسجة إلى قطع ملليمتر مكعب واحد. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة غير العضلية والتخلص منها.

غطي أطباق بتري واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، استرجع الأطباق وأعدها إلى غطاء المختبر المعقم. قم بإزالة المكبس من حقنة سعة ثلاثة ملليلتر واستخدمه لهرس الأنسجة.

استخدم مكبس واحد لكل لوحة لتجنب التلوث المتبادل. أضف ما يقرب من خمسة ملليلتر من PBS المعقم البارد إلى كل طبق بتري وانقل محتويات الطبق إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اشطفها بخمسة ملليلتر إضافية من PBS لاستعادة جميع الأنسجة وإضافتها إلى الأنبوب المخروطي.

اغسل العينات وطردها ثلاث مرات وفقا للبروتوكول. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من محلول يتكون من الكولاجيناز D ثنائي المسافة الثانية وكلوريد الكالسيوم إلى كل أنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع الدوران لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، أضف خمسة ملليلتر من PBS المعقم البارد إلى الأنابيب ، وقم بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة وقم بتقطيعها عدة مرات لفصل الكتل.

املأ الأنابيب ب PBS واخلطها جيدا وضعها على الثلج لإزالة أي قطع كبيرة متبقية من الأنسجة ، ضع مصفاة خلية 40 ميكرون فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر على الجليد وقم بتصفية تعليق الخلية. قسم التدفق بالتساوي إلى ثلاثة أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر مملوءة ب PBS بارد ومعقم وأجهزة طرد مركزي عند 1600 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق عند ثماني درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة S بعناية وضع الخلايا على الجليد لتلوين وفرز الخلايا السلفية العضلية والشحمية.

أولا ، قم بإعداد ستة عناصر تحكم مختلطة في تلطيخ اللون الواحد وفقا للبروتوكول المكتوب المصاحب. تشمل هذه الضوابط عدم وجود صبغة هيكل وصمة عار ، ويوديد البروبيديوم ، والأجسام المضادة المسماة CD 31 و CD 45 FSE ، و SC one P الحجم سبعة الأجسام المضادة المسماة بسبعة والجسم المضاد المسمى ألفا سبعة A PC. بعد ذلك ، قم بإعداد خلطات تلطيخ النمط المتشافي الثلاثة للتحكم في الأجسام المضادة وفقا للبروتوكول المكتوب.

بمجرد تحضير خلطات التلوين ، تم تسمية تسعة أنابيب einor سعة 1.5 ملليلتر لعينات التحكم أحادية اللون والنمط المتماثل. يقوم Resus بتعليق الخلايا من الأنابيب المخروطية الثلاثة ودمجها بحجم إجمالي قدره ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للفاكس. بعد ذلك ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الخلايا على كل أنبوب تحكم وماصة einor مصنفة بين خمسة و 10 ميكرولتر من خلطات التلوين اعتمادا على تركيز الأجسام المضادة لأنابيب التحكم المقابلة.

أعد تعليق الخلايا من عينة الفأر في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس ودمجها في أحد الأنابيب المخروطية سعة 50 مل. ثم أضف 800 ميكرولتر من كوكتيل الجسم المضاد. امزج كل من أنابيب التحكم وأنابيب العينة.

حسنا ، احتضنهم على الجليد لمدة ساعة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بإضافة مليلتر واحد من مخزن الفاكس إلى كل من أنابيب التحكم التسعة وحوالي 20 مل من مخزن الفاكس المؤقت إلى أنبوب العينة. الطرد المركزي أنابيب التحكم einor عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

الطرد المركزي عينة الأنبوب المخروطي عند 1600 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. ثم استنشق وتخلص من snat بعد الطرد المركزي. أعد تعليق خلايا التحكم في كل أنبوب أورف بملليلتر واحد من المخزن المؤقت للفاكس وأعد تعليق خلايا العينة في أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس.

أضف يوديد البروبيديوم إلى خلايا العينة وعناصر التحكم في النمط المتماثل وكذلك إلى pi. أنبوب التحكم أحادي اللون. قم بسحب الخلايا في أنابيب فاكس من خلال غطاء مصفاة الخلية لإزالة الكتل المتبقية التي قد تؤثر على مقياس الخلوي.

قم بإعداد أداة الفاكس بعناصر تحكم واحدة باللون ونمط متساوي. قم بفرز خلايا العينة وفقا للبروتوكول المكتوب المصاحب واجمع كل مجموعة على حدة. وأنبوب تجميع 3.5 ملليلتر أسلاف عضلية قابلة للحياة هي السكان الذين يتم تقسيمها وألفا سبعة ، و PC إيجابي و PI CD 31 FE CD 45 FE و SKA.

واحد حجم PE سبعة سلبية قابلة للحياة أسلاف شحمية هي هيكل و ska واحد PE حجم سبعة إيجابي و pi CD 31 FE CD 45 FE وألفا سبعة جهاز كمبيوتر سلبي. قد ينتج عن فأر من النوع البري الواحد حوالي 1 في 10 إلى الأسلاف الشحمية الخامسة ، و 1.5 إلى مرتين في 10 إلى الخامس. أسلاف عضلية المنشأ مع أكثر من 95٪ من الجدوى.

لتحضير الخلايا للزرع في الفئران المضيفة ، يتم غسل الخلايا. أول جهاز طرد مركزي تشوهت الخلايا عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS ونقلها إلى أنابيب einor.

الطرد المركزي الأنابيب عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية. ثم يعلق resus الأسلاف العضلية في PBS أو الأسلاف الشحمية في matri matrigel عند حوالي 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر. بعد تحضير الفئران المضيفة المخدرة لكل نوع من أنواع الخلايا المانحة ، وفقا للبروتوكول المكتوب ، استخدم حقنة الأنسولين بحجم ثلاثة أعشار السنتيمتر المكعب لحقن 20 ميكرولتر تقريبا 20،000 خلية من الأسلاف العضلية أو الشحمية.

اترك القدر المناسب من الوقت للخلايا المزروعة للتمايز عادة حوالي ثلاثة أسابيع. ثم عزل الأنسجة المستهدفة وإعدادها للاستئصال بالتبريد كما هو موضح في البروتوكول في هذا الشكل ، تم إثبات استراتيجية الفرز لعزل الخلايا القابلة للحياة من الأسلاف الشحمية والعضلية التي تم تحديدها بناء على التشتت الأمامي وتم استخدام تلطيخ الصقر المبعثر الجانبي لاستبعاد الحطام النووي وتم استخدام يوديد البروبيديوم أو تلطيخ PI لاستبعاد الخلايا الميتة ، ثم تم استبعاد الخلايا المكونة للدم والبطانة ، أو خلايا CD 45 و CD 31 على التوالي من بوابات الفرز. أخيرا ، المجموعة الفرعية التي هي ألفا سبعة موجبة.

يحتوي SKA واحد سلبي على جميع الأسلاف العضلية والسكان الذين هم ألفا سبعة سلبيون. يحتوي SKA one positive على جميع الأسلاف الشحمية ، مضان ناقص عنصر تحكم في النمط المتماثل ، تؤكد خصوصية البقعة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء فحوصات نقاء للمجموعات الفرعية الشحمية والعضلية.

بعد الفرز في هذا المثال التمثيلي ، يمكن التعرف على الخلايا المانحة السلفية الشحمية التي تعبر عن الفوسفاتيز القلوي البشري المعدد وراثيا المحقون تحت الجلد في الأنسجة المضيفة عن طريق الكيمياء النسيجية كما هو موضح في التلوين البني. الخلايا المانحة السلفية العضلية التي تعبر عن الجينات المعدلة وراثيا. تم تحديد الفوسفاتيز القلوي البشري المحقون في العضل في قسم الأنسجة هذا كما هو موضح باللون البني.

باستخدام الكيمياء النسيجية بمجرد إتقان ، يمكن إجراء هذه التقنية في خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. إذا تمت معالجة المزيد من العينات ، فسيزداد الوقت. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بسرعة وبلطف.

لذلك ، تجنب معالجة عدد كبير جدا من العينات في المرة الواحدة. سيؤدي إطالة وقت المعالجة إلى تقليل تباين الخلية بشكل كبير بعد هذا الإجراء. يمكن أيضا أن تؤدي طرق أخرى مثل تحليل تعبير القولون SC OG عن طريق R-T-P-C-R الكمي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف تستجيب هذه الخلايا الإيجابية للتلف في الجسم الحي بعد تطوره؟

مهدت هذه التقنية الطريق لباحثين آخرين في مجال تجديد الأنسجة لاستكشاف الحديث المتبادل بين الخلايا الإيجابية في الأنسجة التالفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل هذه الأنسجة دون تلف. تحدد الخلايا السلفية الخلايا السلفية بناء على علامات الخدمة الخاصة بها وتحلل إمكاناتها التنموية في الجسم الحي.

شكرا لك على المشاهدة. حظا سعيدا في تجربتك.