رني التدخل عن طريق الحقن في الرنا المزدوج الجديلة ذبابة الفاكهة الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تثبيط التعبير الجيني الداخلي عن طريق حقن أجنة ذبابة الفاكهة (drosophila) بالحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (double stranded RNA) لتحديد الجينات المطلوبة لتطور الأعضاء. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال جمع الأجنة وصفها في خط مستقيم، ثم يتم تحضير الإبر واستخدامها لحقن الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة في الأجنة.

أخيراً، توضع الأجنة في غرفة رطبة لتنمو. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر عيوباً في اندماج الفروع القصبية في ذبابة drosophila من خلال صبغ الأجنة في مراحلها المتأخرة بالأجسام المضادة، أو عن طريق فحص اليرقات تحت مجهر الحقل المضيء. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الفحص الجيني الأمامي لتحديد الجينات المطلوبة لتطور الأعضاء، في أنها نهج جيني عكسي بسيط وسريع نسبياً لتحليل وظائف الجينات قبل توفر طفرة جينية لهذا الجين.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم الأحياء النمائي، مثل تحديد الجينات الحرجة المطلوبة لتطوير الجهاز التنفسي القصبي في ذبابة D. ويُعد هذا نموذجاً ممتازاً لدراسة التشكل المورفولوجي لأعضاء الثدييات مثل الممرات الهوائية للفقاريات، والجهاز الدوري، وقنوات الكلى، والظهارة الاستكشافية. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تعلم هذه الأساليب يستغرق وقتاً، مثل محاذاة الأجنة، وكسر الإبر، وحقن الـ RNA الخيطي في الأجنة.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية لأن الخطوات التي تتضمن كمية الـ RNA مزدوج السلسلة المحقونة تختلف بين الأجنة، كما يمكن أن يكون الوصف المكتوب لمظهر أجنة الطبقة الخارجية الأرومية المدمجة (syncytial blastoderm embryos) صعبًا. وتعتبر هذه الخطوات صعبة التعلم لأن حقن كميات مناسبة من الـ RNA مزدوج السلسلة في أجنة الطبقة الخارجية الأرومية المدمجة يمثل خطوة حاسمة لتعطيل تعبير الجينات الداخلية بشكل فعال.

للبدء، يتم تجهيز الأقفاص عند درجة حرارة 25 درجة مئوية باستخدام ذباب W 1 1 1 8 يتراوح عمره بين يومين إلى أربعة أيام، مع تغيير أطباق عصير العنب كل ساعة خلال النهار لمزامنة جمع البيض على مدار فترة تتراوح من يوم إلى يومين. وقبل عملية الجمع، يتم جمع أجننة syn city أو blaster derm لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية على قطعة مستطيلة من أغار عصير العنب، ثم يتم قطع خط خفيف في منتصف الأغار باستخدام شفرة الحلاقة.

استخدم مسباراً معدنياً لنقل الأجنة من طبق عصير العنب إلى قطعة من آغار عصير العنب. رتب حوالي 50 جنيناً في خط مستقيم بحيث تكون المحاور الطولية للأجنة بزاوية 45 درجة بالنسبة للخط في منتصف الآغار. تأكد من أن جميع الأجنة تشير إلى الاتجاه نفسه، بحيث تكون نهاياتها الخلفية موجهة بعيداً عن الخط.

قص قطعة مستطيلة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه وثبتها على شريحة غطاء مقاس 18 في 18 مليمتر. التقط الأجنة باستخدام الشريط اللاصق الموجود على شريحة الغطاء. ضع شريحة الغطاء على شريحة زجاجية.

اضغط الأجنة قليلاً على الشريط اللاصق مزدوج الجوانب واترك الأجنة لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق تقريباً. غطِّ الأجنة بطبقة رقيقة من زيت الهالوجين الكربوني 700. انتظر لمدة 10 دقائق تقريباً حتى تصبح الأجنة واضحة تحت المجهر.

يتم تحضير الإبر الخاصة بالحقن المجهري عن طريق سحب أنابيب شعيرية زجاجية. ونستخدم جهاز سحب الإبر من شركة World Precision Instruments وفق إعدادات البرنامج التالية: الحرارة 1 (Heat 1)، التأخير 4 (delay 4)، والرجوع للخلف (back).

قم بتعبئة الإبرة بمقدار 2 µL من الـ RNA مزدوج الشريط باستخدام ماصة Einor P 20 مع رؤوس einor micro loader. جهّز شريحة زجاجية مع وضع غطاء شريحة نظيف فوقها، ثم قم بتثبيتهما معاً باستخدام الشريط اللاصق. ضع الإبرة المعبأة مقابل حافة غطاء الشريحة، بحيث تُشكل نقطة حادة.

يتسرب الـ RNA مزدوج السلسلة من طرف الإبرة. عند الضغط على دواسة مضخة البيكو، قم بتجهيز شريحة بها قطرة من الزيت في المنتصف. أدخل الإبرة في قطرة الزيت.

اضبط إعدادات مضخة البيكو لضخ 100 إلى 200 picoliters من الـ RNA مزدوج السلسلة عند الضغط على دواسة القدم. يمكن رؤية الـ RNA مزدوج السلسلة كقطرة صغيرة في الموضع المحدد.

عندما تلامس طرف الإبرة الجزء الخلفي من الجنين الأول، اضغط على دواسة مضخة البيكو. سيظهر الحمض النووي الريبي ثنائي السلسلة كقطرة صغيرة في موقع الحقن.

أكمل حقن الـ RNA مزدوج الشريط في الأجنة الموجودة على الشريحة. تخلص من جميع الأجنة التي لم تصل إلى مرحلة blastoderm. ضع غطاء الشريحة في غرفة رطبة مغلقة، مثل طبق بتري بلاستيكي عند 18 درجة Celsius حتى تنمو الأجنة إلى المرحلة الجنينية أو اليرقية المطلوبة.

بالنسبة للأجنة التي وصلت إلى المرحلة الجنينية المطلوبة، استخدم مسباراً لإزالة الأجنة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه ودفعها إلى حافة غطاء الشريحة. اغسل الأجنة باستخدام الهبتان لنقلها إلى أنبوب تجميع يحتوي على شبكة نايلون في القاع. اغسل الأجنة ثلاث مرات باستخدام PBT، ثم ضعها في محلول Bleach بتركيز 50% لمدة خمس دقائق، واغسل الأجنة مرة أخرى ثلاث مرات باستخدام PBT.

انقل الأجنة من أنبوبة الجمع إلى قطعة من شبكة النايلون باستخدام ماصة، ثم اغمس قطعة شبكة النايلون في محلول التثبيت. ثبّت الأجنة لمدة 30 دقيقة. تخلص من الطبقة السفلية من محلول التثبيت.

ثم يتم تثبيت الأجنة باستخدام الميثانول، وتُنقل إلى أنبوب إيبندورف، وتُصبغ مناعياً باستخدام أجسام مضادة لـ A 12 والانتشار باتباع بروتوكولات صبغ الأجسام المضادة القياسية للأجنة التي وصلت إلى المرحلة اليرقية المطلوبة. قم بتجهيز شريحة تحتوي على قطرة من زيت الهالوجين الكربوني 700 في المنتصف، مع وضع غطائين صغيرين على كل جانب من قطرة الزيت. انقل يرقة واحدة إلى الشريحة ثم ضع غطاء الشريحة فوق قطرة الزيت.

افحص اليرقات تحت مجهر الحقل المضيء. تظهر هنا النتائج التمثيلية لكل من حقن الـ RNA مزدوج الشريط المنتشر وحقن الـ RNA مزدوج الشريط الخاص بـ GFP.

تُظهر الأجنة التي حُقنت بـ RNA مزدوج السلسلة لـ GFP اندماجاً طبيعياً في القصبات الهوائية، مع وجود بروتين الانتشار في خلايا الاندماج. تشير الأسهم إلى خلايا الاندماج الموجبة لبروتين الانتشار في الجذع الجانبي، بينما تشير النجمة إلى موقع الاندماج الطبيعي.

ومع ذلك، تُظهر الأجنة التي حُقنت بـ RNA مزدوج السلسلة والناشر فشلاً في اندماج الفروع، كما أن البروتينات الناشرة لا تكون موجودة في خلايا الاندماج. يشير المثلث إلى موقع فشل اندماج الفروع عندما تطورت الأجنة المحقونة بـ RNA مزدوج السلسلة إلى المرحلة اليرقية. أما يرقات G-F-P-R-N AI فتُظهر اندماجاً طبيعياً للفروع الرغامية كما تشير النجمة.

من ناحية أخرى، أظهرت يرقات diffusion RN AI فشلاً في اندماج التفرعات، وهو ما تشير إليه المثلثات. وتوضح هذه النتائج تأثير تثبيط تعبير جين diffusion الداخلي عن طريق حقن الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة في أجنة ذبابة الفاكهة drosophila. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التخلص من جميع أجنة enseal blaster بعد اكتمال نموها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء النمائي لاستكشاف وظائف الجينات الجديدة المسؤولة عن تطور الأعضاء في ذبابة Drosophila. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تثبيط الجينات الداخلية عن طريق حقن RNA مزدوج السلسلة في أجنة Drosophila.