إضفاء الطابع المحلي على البروتين في 3D الجذعية العصبية خلية الثقافة : منهجية التصور الهجين

عندما تنمو في معلق، تتكاثر الخلايا السلفية العصبية المعزولة من المناطق المولدّة للأعصاب في الدماغ لتشكل كرات عصبية. نوضح هنا كيفية عزل وتقطيع متسلسل للكرات العصبية المشتقة من الحصين بعد الولادة والتي تسبح بحرية، وذلك لتحديد موقع تعبير البروتين داخل الكرة العصبية ثلاثية الأبعاد. سنقوم بإجراء صبغ مناعي لبروتين مستهدف، وهو في هذه الحالة Conexion 29، يليه تجميع وترجمة لصور مجهرية ثنائية الأبعاد إلى إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للكرة العصبية.

يتيح تصور البروتينات ضمن سياق هياكلها ثلاثية الأبعاد الأصلية، مثل الكرة العصبية طافية الحر أو الأنسجة، فهماً أفضل لوظيفة البروتين بناءً على موقعه داخل هذه الهياكل، كما يسمح باستنتاج قواعد محتملة للبروتينات ذات التموضع المعروف ولكن ذات الوظائف المجهولة. مرحباً، أنا صوفيا أمبو من مختبر التجديد العصبي في جامعة أوتاوا. وأنا نيكولاس فالينزويلا من استوديو كارلتون للوسائط الغامرة في جامعة كارلتون في أوتاوا.

سنقوم اليوم بتوضيح كيفية عزل وتوسيع وتقطيع الخلايا السلفية العصبية بعد الولادة المشتقة من الحصين تسلسلياً على هيئة كرات عصبية. ومن أجل تحديد موقع التعبير البروتيني عبر التلوين المناعي، سنستخدم بعد ذلك صوراً ثنائية الأبعاد للمقاطع التسلسلية للكرات العصبية التي تم جمعها بعد التلوين المناعي، وذلك لتوضيح طريقة إعادة بناء الموقع الخلوي والبروتيني في البنية ثلاثية الأبعاد، وبالتالي تقييم التنظيم المكاني للتعبير البروتيني في جميع أنحاء الكرات العصبية. لذا، فلنبدأ.

بمجرد جمع الأدمغة، استعد لوضعها على ظرف التثبيت (chuck) عن طريق إنشاء سطح مستوٍ لترتكز عليه الأدمغة بشكل صحيح. تُعرف هذه العملية بالتثبيت (blocking). قم بتثبيت المخيخ باستخدام شفرة حلاقة وملقط.

بعد ذلك، ضع قطرة من الغراء القوي (crazy glue) على ظرف التثبيت (chuck) وثبّت الدماغ الأول عليه، بحيث يكون الجانب الأمامي للأعلى والجانب الظهري مواجهاً لك. تابع العملية ذاتها مع الأدمغة الأخرى، وبالنسبة للدماغ الأخير، من الحكمة وضع الجانب الظهري بعيداً عنك لأن القطع يكون غير مكتمل أحياناً في هذا الاتجاه. وفي حال حدوث قطع غير مكتمل، استخدم المشرط للقطع عبر النسيج وجمع المقطع.

تعتبر السرعة أمراً جوهرياً في خطوة اللصق نظراً لعدم إمكانية تعريض الأدمغة للهواء لفترة طويلة. وبمجرد لصق جميع الأدمغة، يوضع الظرف في جهاز الاهتزاز ويُملأ الحامل بـ CSF بارد جداً.

اضبط الهزاز على تردد 8.5 وسرعة تتراوح من 3.5 إلى 4.5. اجعل الشفرة تلامس الـ A CSF واضبط القطع التلقائي. سنقوم الآن بقطع شرائح بسمك 500 micron.

احتفظ بالشرائح التي تحتوي على الحصين. ضعها في طبق مملوء بـ A CSF بارد جداً وتخلص من بقية الشرائح. بمجرد جمع كافة الشرائح، انتقل إلى مرحلة تشريح الحصين.

باستخدام المجهر الستيريو، نأخذ فقط منطقة الحصين الظهرية ما بين bgma ناقص 1.65 millimeters وناقص two point 10 millimeters تقريباً. ضع عينات الحصين في طبق فارغ مبرد بالثلج. وعندما يتم جمع كافة عينات الحصين من الشرائح، يحين وقت نقلها إلى خزانة التدفق الصفحي لإجراء التفكيك الميكانيكي.

باستخدام المشرط، قم برش شفرة المشرط بـ 70%ethanol ثم عرضها للهب للتعقيم. اقطع النسيج بالمشرط حتى يظهر بقوام سائل. الآن، وباستخدام وسط تفكيك يحتوي بالفعل على pepane DNAs و neural protease، اجمع النسيج بواسطة الماصة وانقله إلى أنبوب سعة 15 milliliter.

لإجراء التشريح الإنزيمي، ضع الأنبوب في فرن دوار مضبوط على 37 درجة واترك عملية الهضم تستمر لمدة تتراوح بين 45 دقيقة وساعة واحدة. وبمجرد اكتمال الهضم، أضف 10 milliliters من محلول PBS المعقم الخاص بمزرعة الأنسجة لإيقاف التفاعل الإنزيمي، ثم قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 300 ×g لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب.

في 5 mL من محلول PBS، استخدم ماصة بستيور وقم بنقل العينة ذهاباً وإياباً لتفكيك النسيج بشكل أكبر. استمر في هذه العملية حتى لا تعود قطع النسيج تتقلص في الحجم. عند هذه النقطة، قم بترسيب الخلايا مرة أخرى.

قم بإزالة الـ PBS وأعد تعليق الراسب في ثلاثة ملليلتر من وسط الصيانة. بمجرد القيام بذلك، قم بتجنيس العينة جيداً. خذ جزءاً مقدار 15 µL واخلطه بحجم مساوٍ من صبغة tripan blue.

خذ عينتين بحجم 10 µL وحمّلهما في مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لعد الخلايا. قم بعدّ الخلايا في ثلاثة حقول من كل قسم، بإجمالي ستة حقول. احسب متوسط الأعداد لاستخراج كثافة الخلايا.

مع مراعاة أن العينة مخففة. في صبغة تريبان الزرقاء (trypan blue)، قم بزراعة الخلايا في أطباق منخفضة الالتصاق بكثافة 2.5 × 10⁵ خلية لكل طبق في حجم نهائي قدره 5 mL من وسط الصيانة. في حال عدم توفر الأطباق منخفضة الالتصاق، يمكن استخدام أطباق بتري.

في هذه الحالة، سيتعين عليك النقر على الكرات العصبية (neurospheres) في الصباح وبعد الظهر يومياً خلال الأيام الستة الأولى لضمان عدم التصاق الكرات العصبية بقاع الطبق. أضف EG وF وFGF قبل وضع الأطباق في الحاضنة. ستحتاج هذه العوامل المساعدة على النمو إلى التجديد كل يومين طوال فترة الزرع. في اليوم 14 من الزرع المختبري (in vitro)، قم بتثبيت الكرات العصبية باستخدام الفورمالديهايد بتركيز نهائي يبلغ حوالي 4% عن طريق إضافته مباشرة إلى المزرعة والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

مع التحريك، يتم تجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 ×g لمدة خمس دقائق. تُغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وتُعلق مجدداً في محلول سكروز بتركيز 15 إلى 20% مُحضر في محلول منظم من الفوسفات بتركيز 10 millimolar. تُترك للخماية بالتبريد عند درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التقطيع باستخدام الميكروتوم المجمد (cryostat).

أخرج الكرات العصبية المحمية بالتجميد من الثلاجة وضعها في طبق قطرُه 60 مليمتر. بالنسبة للتسليح التسلسلي حيث يكون جمع كل مقطع على حدة أمراً بالغ الأهمية، وجدت أن الأفضل هو اختيار كرات عصبية ذات حجم وشكل جيدين باستخدام مجهر ستيريو، ثم ضع كرة عصبية باستخدام الماصة في قالب تجميد مملوء بمركب OCT. حدد الموقع الذي توجد فيه الكرات العصبية على قالب التجميد.

ستساعد هذه الخطوة في تحديد موقع الكرات العصبية أثناء عملية التقطيع. بمجرد وضع خمس إلى 10 كرات في القالب بسرعة، قم بتجميدها باستخدام CO2. وباستخدام المؤشرات الموجودة على قالب التجميد، حدد مواقع الكرات العصبية مباشرة على كتلة OTC المجمدة.

أخرج كتلة الـ OCT من القالب وضعها على محور جهاز التجميد (cryostat chuck). ثبت القالب على المحور باستخدام CO2 ثم ضعه داخل جهاز التجميد. اترك العينات لتصل إلى حالة التوازن لمدة 30 دقيقة على الأقل.

بمجرد الانتهاء من ذلك، قم بالقص بسرعة عند العلامات الموضوعة على القالب، ثم ابدأ في جمع كل مقطع من تلك النقطة فصاعداً. وتحقق من مكان بدء شرائح الكرة العصبية باستخدام مجهر ضوئي. وبمجرد اكتمال عملية التقطيع، قم بتخزين الشرائح في المجمد حتى تصبح مستعداً لإجراء الكيمياء المناعية. وفي هذه الخطوة، استخرج الشرائح التي تحتوي على إحدى الكرات العصبية المقطعة تسلسلياً، وقم بتضمين الشرائح التي تحتوي على خمسة مقاطع سابقة وخمسة مقاطع لاحقة.

سيضمن ذلك تصوير الكرة العصبية بأكملها. سيكون استخدام صبغة مضادة للنواة أمراً ضرورياً من أجل العثور على جميع مقاطع الكرة العصبية الخاصة بك. لذا ضع ذلك في الاعتبار أثناء تخطيطك لعملية التلوين المناعي للشرائح من خلال تطبيق PBS وتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل، حيث نستخدم محلولاً منظماً للأجسام المضادة يحتوي على 0.3% Triton X 100 للنفاذية و 3% bovine serum albumin للحجب.

خفف الجسم المضاد الأولي بشكل مناسب في هذا المنظم، ثم قم بالتحضين في الغرفة البشرية طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. استخدم PBS لرفع مادة البارافورم عن الكرات العصبية وأزلها بعناية باستخدام الملقط. تعد هذه الخطوة هي الأولى من بين أربع عمليات غسل بـ PBS، مدة كل منها خمس دقائق.

يُوضع الجسم المضاد الثانوي على الشرائح وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وكما سبق، يتم تعويم مادة البارافورم بعيداً عن الشريحة باستخدام PBS وإزالتها باستخدام الملقط. ومرة أخرى، تُعد هذه الخطوة هي الأولى من أربع عمليات غسيل بـ PBS، مدة كل منها خمس دقائق.

في الغسلة الثالثة، نستخدم HOS 3 3 2, 5 8 كصبغة مضادة للنواة، والتي يتم تخفيفها إلى 0.5 micrograms per milliliter. وفي محلول PBS، يتم إجراء غسلة إضافية لمدة خمس دقائق بعد الغسيل بـ hos. وبمجرد اكتمال جميع عمليات الغسيل، توضع كمية وافرة من وسط التثبيت على الجزء السفلي من الشريحة وتُغطى بغطاء زجاجي.

قم بتثبيت الزوايا باستخدام طلاء الأظافر. وبمجرد وضع أغطية الشرائح على جميع الشرائح، قم بتثبيت بقية حواف الغطاء. قم بتصوير الشريحة على الفور أو قم بتخزينها عند -20 °C حتى تصبح جاهزاً للقيام بذلك.

عند التصوير، يمثل العثور على الخلايا في الشريحة الجزء الأكثر صعوبة، وسيكون من السهل اكتشاف الخلايا التي تنتمي إلى الكرة إذا بحثت عنها باستخدام صبغة مضادة للنواة. وبمجرد العثور على بداية الكرة العصبية، والتي قد تتكون من بضع خلايا فقط، قم بتصوير كل مقطع من تلك النقطة فصاعداً. التقط صوراً للصبغة النووية، والبروتين أو البروتينات محل الدراسة، وصورة تباين طوري.

ستكون صورة تباين الطور هذه مهمة جداً في مراحل النمذجة. يتم استيراد الصور التي تحتوي على أشرطة مقياس مدمجة بقيمة 10 micrometers و 50 micrometers، والتي تم إنشاؤها باستخدام برنامج open lab 3.56، إلى برنامج Photoshop CS four باستخدام حجم لوحة قياسية يبلغ 3,300 في 2,550 بكسل.

يتم حفظ جميع صور المقاطع المتسلسلة كملفات TIFF مع الحفاظ على حجم مساحة العمل القياسية. افتح صور التباين للمرحلتين الأولى والثانية للمقاطع المتسلسلة من الكرات العصبية. قم بزيادة شفافية المقطع الثاني من تبويب الصورة، ثم افتح تدوير الصورة واختر تدويرًا عشوائيًا.

قم بتدوير المقطع الثاني حتى تتمكن من تحديد نقاط الاستمرارية الهندسية والتركيبية بين الصور. كرر هذه العملية لجميع المقاطع المتسلسلة، مع حفظ كل مقطع في طبقة منفصلة. تأكد من ربط كل طبقة صور مقابلة للتصوير الطوري والتعبير البروتيني بحيث يتم تنفيذ جميع عمليات التدوير لكل قناة في وقت واحد.

قم بإنشاء مستوى في Maya يكون بنفس أبعاد ملف Photoshop من شريط الحالة في واجهة مستخدم Maya. قم بتغيير شريط القوائم من إعدادات الرسوم المتحركة الافتراضية إلى الأسطح (surfaces). استخدم كرة تقسيم بدائية (primitive subdivision sphere) لإنشاء جسم الخلية مع تحديد الكرة.

ابدأ في تعديل رؤوس المجسم عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الكائن واختيار vertex من قائمة التحديد. علاوة على ذلك، قم بتفصيل سطح الكرة عن طريق تغيير مستوى العرض من قائمة التحديد من علامة تبويب subdivision surfaces في القائمة الرئيسية. افتح مربع خيارات collapse hierarchy واضبط عدد المستويات على اثنين.

قم بتقليص الكرة. قم بتغيير شريط القائمة من الأسطح (surfaces) إلى المضلعات (polygons) بينما تكون الكرة محددة. افتح أداة نحت الهندسة (sculpt geometry tool) من علامة تبويب المش (mesh) في القائمة الرئيسية.

قم بتنقيح سطح الخلية للوصول إلى شكلها النهائي. استخدم مجموعة أدوات نحت الهندسة (sculpt geometry) من علامة تبويب إعدادات الأدوات. كرر هذه العملية لكل خلية من خلايا النمط الشكلي الخاص بك لمحاكاة تنوع الخلايا السلفية الموجودة في الكرات العصبية (neurospheres).

في هذا العرض التوضيحي، ستشكل 10 خلايا سلفية مختلفة أساس الكرة العصبية. اختر النمط الخلوي وقم بتجميد التحويلات باستخدام الخلايا الخاصة بنمطك. سيتم تصميم مظللين سطحيين لتمثيل كل من الخلايا التي تعبر عن البروتين connects in 29 والخلايا التي يغيب فيها هذا البروتين.

افتح نافذة hyper shade من علامة تبويب windows rendering editor في القائمة الرئيسية. اختر ramp shader من علامة تبويب surface materials. افتح محرر السمات (attribute editor) وقم بتعيين سمات لون المظلل (shader color)، واللون المتوهج (incandescent)، ولون الإضاءة المحيطة (ambient color)، وbump، وmap، وسمات اللون المرآوي (specular color).

قم بتعيين ملمس براوني ثلاثي الأبعاد (Brownian 3D texture) لعقدة اللون المحيط، وملمس فركتلي ثنائي الأبعاد (2D fractal texture) لعقدة تخطيط النتوءات (bump mapping). حدد توصيلات الإدخال والإخراج لظلال التظليل الناتجة وقم بتصدير الشبكة المحددة. حدد نمط الخلايا وافتح مربع خيارات تصدير التحديد.

اختر نوع الملف Maya A-S-C-I-I وألغِ تحديد مربع "include these inputs" في خيار "export selection". افتح ملف المقاطع المتسلسلة المحاذات في برنامج Adobe Photoshop. أنشئ مفتاحاً من خطوط قلم الرصاص لتحديد موقع كل خلية سلف في المقاطع المتسلسلة.

في هذا العرض التوضيحي، سيتم استخدام مفتاح مكون من ثلاثة رموز: مربع مصمت، ومربع بخط متقطع، ومربع بعلامة كروس؛ للإشارة إلى ما إذا كانت الخلية تقع في قسم واحد أو قسمين أو ثلاثة أقسام.

يتم تحديد مفتاح الضربات هذا بشكل إضافي من خلال اللون الأحمر الذي يمثل الخلايا التي تعبر عن conexion 29 واللون الأبيض الذي يمثل الخلايا التي لا تعبر عن Conexion 29. قم بتفعيل طبقة الطور وابدأ في تحديد مركز كل خلية سلفية بضربة قلم بيضاء. استخدم طبقة منفصلة داخل مجلد المقطع لبناء خرائطك.

بدّل بين المقاطع لتحديد موقع الخلية، مع ضمان تدوين الخلايا الموجودة في أكثر من مقطع بشكل صحيح. ومع تفعيل طبقة CX 29، اختر الخلايا التي تقع في المناطق التي يظهر فيها تعبير إيجابي لـ CX 29.

اختر أمر التعبئة (fill) من علامة تبويب التحرير (edit) في شريط القائمة الرئيسي لبرنامج Photoshop، وقم بتغيير الخطوط البيضاء إلى اللون الأحمر بعد إكمال الخرائط. احفظ كل قسم كصورة JPEG منفصلة في مجلد الصور المصدرية (source images) الخاص بمشروع Maya. وللقيام بذلك، يجب أولاً إنشاء مشروع Maya جديد من سطر الحالة في واجهة مستخدم Maya.

قم بتغيير شريط القائمة من إعداد الرسوم المتحركة الافتراضي إلى استيراد المضلعات للمستويات. قم بتنفيذ ma وشريط المقياس. ملفات ma من مجلد المشاريع المرئية مع تحديد المستوي.

قم بتعيين مضلل Lambert من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على الكائن وفتح علامة تبويب تعيين مادة جديدة (assign new material) في محرر السمات (attribute editor). انقر فوق المربع المربعات الموجود إلى يمين سمة لون المواد من القائمة المنبثقة. اختر "ملف" (file) من قسم نسيج ثنائي الأبعاد (2D texture) ضمن قسم سمة الملف في محرر السمات.

انقر على أيقونة الملف الموجودة على يمين سمة اسم الصورة. اختر القسم الأول من مجلد الصور المصدرية. قم بتحويل كاميرا نافذة مساحة العمل من منظور العرض المنظوري إلى عرض المسقط الرأسي الافتراضي عن طريق فتح علامة تبويب تلك اللوحة.

اختر أداة إنشاء المضلع (create polygon tool) من علامة تبويب المش (mesh) في القائمة الرئيسية، وقم بتتبع المخطط التفصيلي للمقطع. اختر الخريطة الأولى من مجلد الصور المصدرية وخصصها لمستوى المضلع الذي تم إنشاؤه حديثاً. باتباع الخطوات المحددة لإنشاء مستوى المضلع مع تحديد الكائن، اختر UV من قائمة التأشير (marking menu) عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوق المستوى.

حدد جميع نقاط UV للمستويات وافتح محرر أنسجة UV من تبويب النوافذ في القائمة الرئيسية، ثم قم بتغيير مقياس UV بشكل تناسبي ليتناسب مع مستوى المقطع. كرر هذه العملية لكل مقطع من مقاطع كرة الأعصاب، مع التأكد من أن المسافات بين كل مقطع تتوافق مع ارتفاع شريط المقياس الموجود في سطر الحالة بواجهة مستخدم برنامج Maya. قم بتغيير شريط القائمة من إعداد الرسوم المتحركة الافتراضي إلى الديناميكيات، مع إبقاء المقطع الأول فقط من كرة الأعصاب مرئياً.

قم بإخفاء جميع الأقسام الأخرى عن طريق تغيير إعدادات العرض من علامة تبويب العرض في القائمة الرئيسية، ومع فتح مربع خيارات أدوات منحنى CV، اختر "linear" واحدًا من إعدادات منحنى CV. عند عرض المشهد من كاميرا العرض العلوي، ابدأ في تعيين النقاط لخرائط الخلايا، مع إنشاء منحنى واحد للخلايا CX 29 السالبة والخلايا CX 29 الموجبة. وتظهر المنحنيات الناتجة مسطحة عند عرضها من كاميرا العرض الجانبي.

قم بتقدير سُمك المقاطع عن طريق إزاحة نقاط المنحنى على المحور Y، مع استخدام شريط القياس كدليل. كرر هذه العملية لكل مقطع من مقاطع الكرة العصبية.

قم باستيراد ملف cell typology.ma من مجلد المشاهد الخاص بالمشروع، ثم قم بمضاعفة cell typology لكل من السلائف CX 29 negative و CX 29 positive. افتح نافذة hyper shade من علامة تبويب windows rendering editors في القائمة الرئيسية.

قم باستيراد المظللات (shaders) التي تم بناؤها سابقاً وتعيينها لخلايا النموذج التصنيفي (typology) من نافذة المخطط التفصيلي (outliner). قم بإزالة اسم الملف من بداية الكائنات المستوردة؛ حيث سيكون هذا الأمر مهماً في المراحل اللاحقة من عملية النمذجة.

اختر علامة تبويب الجسيمات (particles) من القائمة الرئيسية وأنشئ باعث جسيمات للمنحنى CV الأول. افتح علامة تبويب شكل الجسيم واحد (particle shape one) ومن تحت سمات الانبعاث (emission attributes)، قم بتغيير الحد الأقصى للعدد (max count) من سالب واحد إلى عدد النقاط الموجودة في المنحنى الأول. في علامة تبويب سمات الرندرة (render attributes)، قم بتغيير نوع رندرة الجسيمات إلى سطح فقاعي (blobby surface).

انقر على مربع نوع التصيير الحالي أدناه وقم بتغيير نصف قطر الجسيمات إلى 0.01. قم بربط الجسيمات برؤوس المنحنى عن طريق تحديد الجسيمات أولاً، ثم تحديد المنحنى مع الضغط على مفتاح shift.

افتح خيارات الهدف (goal options) من تبويب الجسيمات (particles) في القائمة الرئيسية واضبط وزن الهدف على قيمة واحد. انقر فوق إنشاء (create). حدد الخلايا من الرقم 1 إلى 10 بالترتيب في نافذة المخطط التفصيلي (outliner window)، ثم افتح مربع خيارات الاستبدال الفوري (in instant replacement options) من تبويب الجسيمات في القائمة الرئيسية.

في مربع كائنات النماذج (instance objects)، يجب أن تكون جميع الخلايا العشر مدرجة بالترتيب. اختر اسم شكل الجسيم الصحيح من القائمة المنسدلة في علامة تبويب كائن الجسيم المراد نموذجه (particle object to instance). انقر على إنشاء (create). بشكل افتراضي، ستقوم الخلية الأولى التي تم تحديدها فقط باستبدال الجسيمات على طول المنحنى؛ ولإظهار جميع الخلايا العشر وجعلها تتبدل عشوائياً بين الجسيمات، يلزم استخدام تعبير (expression).

سيضمن التعبير الثاني أن تصدر الخلايا بشكل عشوائي بنفس الطريقة في كل مرة. يتم إعادة تحديد موضع شريط التمرير للنطاق مع تحديد الباعث. افتح محرر السمات في علامة تبويب شكل الجسيمات ضمن إضافة سمة ديناميكية.

انقر فوق المربع العام الموجود أسفل الاسم الطويل. اكتب random underscore index في نوع السمة وقم بتغيير المفتاح من scaler إلى per particle array، ثم اضغط على add في علامة تبويب سمات per particle array. تم إضافة مربع random underscore index.

انقر بزر الماوس الأيمن فوق المساحة الفارغة، ثم اختر "create expression" من القائمة المنسدلة. اكتب النص التالي في مربع التعبير لإكمال التعبير. افتح علامة تبويب "instant search geometry replacement" في محرر السمات (attribute editor)، وفي الخيارات العامة (general options) اختر "object index".

اختر فهرس شرطة سفلية عشوائيًا من القائمة المنسدلة. حرك شريط تمرير الوقت إلى الإطار الأول ثم اضغط على تشغيل. ستكون أنواع الخلايا الآن موزعة عشوائيًا بين الجسيمات.

كرر هذه العملية لكل قسم من أقسام الكرة العصبية. تأكد من تمييز كل نسخة جديدة من الباعث (emitter) وكل فهرس عشوائي بالاسم، وتنظيمها بشكل مناسب في نافذة المخطط التفصيلي (outliner) في عملية الرندر. باستخدام قسم نافذة إعدادات الرندر، قم بتغيير وضع الرندر من Maya software إلى mental ray.

افتح تبويب الجودة (quality) ومن تحت تتبع الأشعة (ray tracing) قم بتغيير إعداد الانعكاس (reflection) إلى صفر. ثم افتح تبويب مخزن الإطارات المؤقت (frame buffer) وقم بتغيير قص اللون (color clip) من الخام (raw) إلى ألفا (alpha) وقم بإلغاء تحديد "الضرب المسبق" (Pre multiply).

افتح محرر طبقات صندوق القنوات (channel box layer editor) وقم بتغيير إعدادات محرر الطبقات من العرض (display) إلى الصيرورة (render). حدد الخلايا المستوردة من التصنيف النمطي، ثم انقر فوق أيقونة إنشاء طبقة جديدة وتعيين الكائنات المحددة. أعد تسمية الطبقة إلى الانسداد المحيطي (ambient occlusion).

عند النقر بزر الماوس الأيمن فوق الطبقة التي تم إنشاؤها حديثاً، اختر attributes من القائمة الموجودة على يمين مربع render layer. انقر فوق زر presets واختر occlusion من القائمة المنسدلة. حدد علامة التبويب MIB_AMB_occlusion1 وقم بتغيير samples من 16 إلى 256.

أعد فتح محرر طبقات صندوق القنوات (channel box layer editor)، ومن علامة تبويب الخيارات (options tab)، افتح مربع خيارات تصيير جميع الطبقات (render all layers)، ثم اختر "composite" وأبقِ طبقة الانسداد المحيطي (ambient occlusion layer) محددة. قم بتغيير الوضع من "normal" إلى "multiply" من القائمة المنسدلة الموجودة مباشرة فوق قائمة الطبقات، ثم قم بتصيير ممرين للكرة العصبية (neuros sphere)، مرة مع تفعيل طبقة الانسداد المحيطي ومرة مع تفعيل الطبقة الرئيسية (master layer). احفظ الصور كملفات IFF في مجلد الصور الخاص بالمشروع.

افتح كلتا الصورتين في برنامج Adobe Photoshop. ضع طبقة الانسداد المحيطي (ambient occlusion) فوق الطبقة الرئيسية واضبط وضع الدمج على "multiply". أنشئ خلفية ثم قم بتسطيح الصورة.

لقد قدمنا لكم للتو كيفية استزراع الخلايا العصبية المشتقة من الحصين على شكل كرات عصبية، وكيفية إجراء تقطيع تسلسلي لمستنبت الكرات العصبية باستخدام المبرد المقطعي (cryostat)، وكيفية إجراء صبغ مناعي لبروتين معين. كما أوضحنا لكم كيفية نمذجة الموقع المكاني للتعبير عن ذلك البروتين في ثلاثة أبعاد باستخدام مزيج من تسجيل استزراع الخلايا وبرمجيات النمذجة ثلاثية الأبعاد.

نأمل أن يكون هذا مفيداً لكم، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.