والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

أنا تروي جاساي. سنتحدث عن اختبار الشرائح النسيجية العضوية الذي تم تطويره وإتقانه في مختبري على مدار السنوات القليلة الماضية. وسيقوم بن جاكيت من مختبري بتوضيح كيفية إجراء هذا الاختبار.

يُعد اختبار الشرائح العضوية للدماغ في مرحلة ما بعد الولادة طريقة فعالة لاختبار العوامل المختلفة ودورها في الهجرة العصبية في دماغ ما بعد الولادة ومسار الهجرة في الـ TRO. مرحباً، أنا بن جاكاي، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور تروي جي في كلية الطب البيطري بجامعة ولاية كارولاينا الشمالية، وأنا هنا اليوم لأعرض لكم كيفية إجراء عملية نقل الأنسجة المتقاطعة بين شرائح دماغ الفأر العضوية من أجل تصور الخلايا العصبية المهاجرة في دماغ ما بعد الولادة.

يجب تنفيذ جميع التقنيات الموضحة في هذا الفيديو في بيئة معقمة، ويفضل أن يكون ذلك داخل غطاء تدفق رقائقي باستخدام أدوات معقمة. يتم وضع قطرة بحجم 150 µL من وسط الشرائح في مركز الجزء الزجاجي السفلي من الطبق باستخدام حقنة تستخدم لمرة واحدة ومزودة بإبرة قياس 23. يتم وضع عدة نقاط من الغراء خارج الغطاء الزجاجي الدائري السفلي، مع ترك جانب واحد غير ملصق للسماح بتبادل السوائل A.A. بعد ذلك، يتم وضع غشاء المسام النووية برفق فوق الوسط باستخدام ملاقط دقيقة، مع التأكد من عدم انحباس فقاعات الهواء تحت الغشاء.

تُستخدم بعدها الملاقط المنحنية لتسطيح بقع الغراء وتثبيت الغشاء في مكانه. يُضاف 1 mL من وسط الشرائح فوق الغشاء، وأخيراً، توضع الأطباق في حاضنة حتى يحين وقت استخدامها. يتم الحصول على أفضل النتائج عندما تُجهز الشرائح من فئران صغيرة بعد الولادة، من P1 إلى P10؛ أولاً، يتم تثبيت الرأس عن طريق إمساك الخطم باستخدام ملاقط دقيقة.

يتم استئصال الجلد طوليًا من الرقبة إلى الخطم. ثم يتم تقشير فروة الرأس لكشف العظم، ويُقطع الجمجمة طوليًا وأماميًا بدءًا من العظم القصي الكبير (sternum magna) عن طريق إجراء قطع إنسي واحد وقطعين جانبيين، واحد على كل جانب. يجب توخي الحذر لتقليل التلامس مع النسيج القشري الكامن تحته.

يتم إبعاد السدائل القحفية عن الدماغ لتحسين استقرار الأنسجة. وأثناء عملية التقطيع بجهاز الفايبراتوم (vibram sectioning)، تُزال الجوانب الأكثر جانبية وذيلية من الدماغ باستخدام شفرة حلاقة. ثم تُرفع نصفا الكرة المخية بعناية من الجمجمة وتوضع في قالب التضمين بحيث يكون السطح الإنسي متجهاً للأسفل.

تُغطى العينات فوراً بـ 3% agarose gel من درجة DNA المذاب في محلول تحضير الأنسجة (tissue preparation buffer) والمحافظ عليه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد دقيقتين من التثبيت على سطح أفقي مستوٍ، ولضمان تصلب الـ agarose بشكل متساوٍ، توضع القوالب على الثلج لإتمام عملية التصلب.

بمجرد تجمّد الهلام الذي يحتوي على نصفي الكرة المخية، يتم إخراجه من القالب وتقليمه حول أنسجة الدماغ. بعد ذلك، يتم تثبيت الأنسجة المغمورة في الهلام على قرص العينة الخاص بـ vibrate tone بحيث يكون السطح الإنسي للأعلى، ويُثبّت باستخدام لاصق السيانوأكريليت. ثم يُثبّت القرص في صينية عينات الاهتزاز المملوءة بوسط تحضير الأنسجة المبرد بالثلج، ويتم تقطيع الدماغ بسمك 150 micrometer.

بمجرد تحرر الشرائح التي تحتوي على RMS من الشفرة، يتم نقلها بعناية باستخدام ملعقة مسطحة صغيرة ووضعها بشكل مسطح في مركز أطباق الزرع. من الضروري تقليل التعامل مع الشرائح إلى أدنى حد لأن الأنسجة تكون هشة للغاية. يتم ضبط كمية الوسط في أطباق الزرع لتكون كافية لتغطية مقاطع الدماغ مع منعها من التحرك.

تُصنف الأطباق وتُنقل إلى الحاضنة. تُجهز أدمغة المانحين بطريقة مماثلة لتلك المستخدمة في أدمغة المستقبلين، باستثناء أن المقاطع تُقطع بسمك 250 Micrometer وتُجمع الشرائح في الثلج.

تحضير الأنسجة الباردة. توضع شرائح المحلول المنظم فوراً تحت مجهر تشريحي يتميز بخاصية الفلورة فوق المحورية. يظهر الـ RMS كبنية رمادية على شكل حرف U تمتد من المنطقة تحت البطانية إلى البصلة الشمية.

يتم تشريح الـ RMS بدقة وبحذر باستخدام ملاقط دقيقة. يُستخدم ملقط لتثبيت الشريحة بينما يُستخدم الملقط الآخر لإجراء قطوع صغيرة حول الـ RMS حتى يتم تحريرها من الشريحة. بعد ذلك، يتم تقطيع الـ RMS المستأصلة إلى قطع صغيرة يتراوح قطرها تقريبًا بين 200 إلى 500 micrometers.

في هذا المثال، يتم تحضير طعوم من فئران تعبر عن البروتين الفلوري الأحمر، TD tomato glass. تُخرج الأطباق السفلية التي تحتوي على شرائح المضيف من الحاضنة وتوضع تحت مجهر التشريح باستخدام الضوء المرئي. يتم إجراء شق صغير في الجزء الأولي من الـ RMS، وباستخدام ماصة مجهزة بطرف سعة 20 µL، يتم نقل قطعة زرع (Explan) واحدة من الـ RMS المانح إلى موقع الشق في الـ RMS المضيف.

يتم دفع العينة المستأصلة برفق داخل الشق لإقامة اتصال بين النسيجين. ولضمان استقرار هذا الاتصال، يتم دفع العينات المستأصلة قليلاً بين الشريحة والغشاء المسامي النووي. بعد ذلك، تُعاد الأطباق إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للمقاطع بالاستقرار على الغشاء.

يجب أن تبدأ الخلايا العصبية البدئية (Neuroblast) في الهجرة من المستنسخ إلى تيار الهجرة الشمية (RMS) المضيف بعد مرور ساعة إلى ساعتين تقريباً. ويمكن رؤية هجرة الخلايا بشكل أفضل باستخدام عدسات شيئية بقوة تكبير 20 وبمسافة عمل طويلة جداً. تُنقل الأنسجة المستزرعة من الحاضنة إلى حجرة تحضين مثبتة على المجهر.

يمكن تصوير الخلايا العصبية البدائية الفلورية بفواصل زمنية تتراوح من صفر إلى 10 دقائق اعتماداً على نوع التحليل المطلوب. لقد تم اختبار بروتوكول استنبات شرائح الدماغ العضوية الخاص بنا وتحسينه بدقة على مدار السنوات القليلة الماضية لضمان الاتساق في نمط الهجرة والتوجه داخل RMS. وفي هذا المثال، يكشف تحليل الخلايا المهاجرة من الطعم، والمستمدة من فئران يُعبَّر فيها عن TD tomato تحت محفز nestin، عن هجرة سريعة وموجهة للغاية نحو RMS المضيف.

تكبير عالٍ. يُظهر تحليل التصوير الزمني دقة ممتازة للطول الكامل لخلية عصبية مهاجرة خلال جلسة تصوير مدتها 20 دقيقة. وبمجرد اكتمال التصوير، يمكن تثبيت الشرائح باستخدام 4% paraformaldehyde مُعد حديثاً وبارد جداً (بدرجة حرارة الجليد)، ثم تُصبغ مناعياً للمكونات المختلفة لمسار الهجرة.

في هذه الحالة، تظهر الخلايا النجمية الإيجابية لبروتين GFAP باللون الأزرق والأوعية الدموية الإيجابية لبروتين CD 31 باللون الأخضر باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية، كما يكشف تحليل التكبير العالي لشرائح مصبوغة لبروتينات الهيكل الخلوي أكتين باللون الأزرق، وتوبولين باللون الأخضر، عن تعبير غير منتظم لهذه المكونات بواسطة خلية في منتصف عملية الهجرة. يتضمن بروتوكولنا بعض التحديات التي تتطلب الصبر والممارسة وتخصيص وقت كافٍ لكل من مرحلتي التحضير وتحليل النتائج.

إليك بعض الاقتراحات المفيدة التي ستساعدك في الحصول على أفضل النتائج من تجاربك. بناءً على خبرتنا، فإن الفئران في الفئة العمرية من P1 إلى P10 تعطي أفضل النتائج. كما أن مطابقة العمر بين أدمغة المانح والمستقبل تزيد من إمكانية تكرار التجارب.

بما أن معظم الكواشف وأطباق الزرع يجب تحضيرها حديثاً، فإن مقايسة الشرائح تتطلب عدة ساعات من التحضير والتصوير المتواصل في يوم واحد. وبمجرد استخلاص الأدمغة، يجب تنفيذ الخطوات اللاحقة بأسرع ما يمكن. وبين عملية قطع الرأس وتحضير الشرائح، يجب تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الثلج والكواشف المبردة، كما يجب تقليل التعامل مع الأنسجة إلى أدنى حد لتجنب حدوث تمزقات تشريحية.

يجب أن تكون الأدوات المستخدمة في عمليات التشريح هذه معقمة ومخصصة حصرياً للتعامل مع الأنسجة الحية. لا تستخدم أبداً أدوات سبق أن لامست مواد تثبيت مثل formaldehyde. وتكون الشرائح قابلة للحياة عموماً لمدة تصل إلى 36 ساعة، مع ملاحظة تراجع ملموس في الهجرة والسرعة والتوجه في الفترة ما بين 24 و36 ساعة.

يرجى الانتباه إلى هذا القيد عند تخطيط تجاربك وتحليلاتك.