والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

يصف هذا البروتوكول مقايسة شريحة عضوي النمط الأمثل للدماغ بعد الولادة وعالية الدقة الوقت الفاصل بين التصوير الهجرة neuroblast في تيار الهجرة منقاري.

أنا تروي غاساي. سنتحدث عن مقايسة شريحة عضوية تم إتقانها في مختبري على مدى السنوات القليلة الماضية. ستوضح لك سترة بن في مختبري كيفية إجراء هذا الفحص.

يعد اختبار الشريحة العضوية لدماغ ما بعد الولادة طريقة قوية لاختبار العوامل المختلفة والدور في هجرة الخلايا العصبية في دماغ ما بعد الولادة وتيار الهجرة TRO. مرحبا ، أنا بن جاكاي. أنا زميل ما بعد الدكتوراه في مختبر Dr.Troy gge في كلية الطب البيطري بجامعة ولاية كارولينا الشمالية ، وأنا هنا اليوم لأوضح لكم كيف نقوم بإجراء عملية زرع الأنسجة بين شرائح دماغ الفأر العضوية من أجل تصور الخلايا العصبية المهاجرة في دماغ ما بعد الولادة.

يجب تنفيذ جميع التقنيات الموضحة في هذا الفيديو في بيئة معقمة ، ويفضل أن يكون غطاء التدفق الرقائقي باستخدام أدوات معقمة. يتم وضع قطرة 150 ميكرولتر من وسط الشريحة في وسط الزجاج ، الجزء السفلي من الطبق مع حقنة يمكن التخلص منها ومجهزة بإبرة قياس 23. يتم وضع العديد من بقع الغراء خارج زلة الغطاء السفلي الزجاجي الدائري مع ترك جانب واحد غير لاصق لتبادل السوائل ، ثم يتم وضع غشاء المسام النووية برفق فوق الوسط باستخدام ملقط صغير مع ضمان عدم احتجاز فقاعات الهواء تحت الغشاء.

ثم يتم استخدام الملقط المنحني لتسطيح بقع الغراء وتثبيت الغشاء في مكانه. يضاف مليلتر واحد من وسط الشريحة فوق الغشاء ، وأخيرا ، توضع الأطباق في حاضنة حتى تصبح جاهزة للاستخدام. يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم تحضير شرائح من الفئران الصغيرة بعد الولادة ، P واحد إلى P عشرة أولا ، يتم تثبيت الرأس عن طريق إمساك الخطم بالملقط الدقيق.

يتم استئصال الجلد طوليا من الرقبة إلى الخطم. يتم تقشير فروة الرأس لكشف العظم ويتم قطع الجمجمة طوليا وأمام بدءا من عظمة القص عن طريق عمل قطع وسطية واحدة وقطعتين جانبيتين ، واحدة على كل جانب. يجب توخي الحذر لتقليل ملامسة الأنسجة القشرية الأساسية.

حيث تتم إزالة اللوحات القحفية بعيدا عن الدماغ لتحسين استقرار الأنسجة. أثناء تقسيم الاهتزاز ، تتم إزالة معظم الجوانب الجانبية والجوانب المرمزة من الدماغ بشفرة حلاقة. يتم إخراج نصفي الكرة الأرضية بعناية من الجمجمة ووضعهما على السطح الإنسي لأسفل في قالب مدمج.

يتم تغطيتها على الفور بهلام الورود AGA المذاب بنسبة 3٪ من الحمض النووي المذاب في مخزن مؤقت لتحضير الأنسجة يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية. بعد دقيقتين من الاستقرار على سطح أفقي مستو. لضمان تصلب الورود الآغا بشكل متساو ، يتم وضع القوالب على الجليد لإكمال الإعداد.

بمجرد ضبط الجل الذي يحتوي على نصفي الكرة الأرضية ، يتم إزالته من القالب وقصه حول أنسجة المخ. ثم يتم تثبيت الأنسجة المضمنة في الجل على قرص العينة من النغمة الاهتزازية مع سطح وسطي لأعلى وتثبيته بمادة لاصقة سيانواكريلات. ثم يتم تثبيت القرص في صينية عينات الاهتزاز المملوءة بوسط تحضير الأنسجة المثلجة ، ويتم تقسيم الدماغ بسمك 150 ميكرومتر.

بمجرد تحرير شرائح RMS التي تحتوي على الشفرة ، يتم إخراجها بعناية باستخدام ملعقة صغيرة مسطحة الرأس ووضعها بشكل مسطح في وسط أطباق الاستزراع. من الأهمية بمكان أن يتم تقليل التعامل مع الشرائح إلى الحد الأدنى لأن الأنسجة هشة للغاية. يتم ضبط كمية الوسيط في أطباق الثقافة إلى المستوى الكافي لتغطية أقسام الدماغ مع منعها من الحركة.

يتم وضع ملصقات على الأطباق ونقلها إلى حاضنة. يتم تحضير أدمغة المتبرعين بطريقة مشابهة لأدمغة المتلقي ، باستثناء أن الأقسام مقطوعة عند 250. يتم جمع سمك الميكرومتر والشرائح في الجليد.

تحضير الأنسجة الباردة. يتم وضع الشرائح العازلة على الفور تحت مجهر تشريح مع قدرة مضان epi. يمكن رؤية RMS كهيكل رمادي على شكل حرف U يمتد من المنطقة تحت البطانة إلى البصلة الشمية.

RMS دقيق بلطف باستخدام ملقط صغير. يتم استخدام ملقط واحد لتثبيت الشريحة بينما يستخدم الآخر لعمل قطع صغيرة حول RMS حتى يتم تحريرها من الشريحة. ثم يتم تقطيع RMS المستأصل إلى تخطيط صغير يبلغ قطره حوالي 200 إلى 500 ميكرومتر.

في هذا المثال ، يتم تحضير الباذنجان من الفئران التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأحمر ، زجاج الطماطم TD. تتم إزالة الأطباق السفلية التي تحتوي على شرائح المضيف من الحاضنة ووضعها تحت مجهر التشريح باستخدام الضوء المرئي. يتم إجراء شق صغير في الجزء الأولي من RMS وباستخدام ماصة مجهزة بطرف 20 ميكرولتر ، يتم نقل RMS Explan لمتبرع واحد إلى الموقع المحفور في RMS المضيف.

يتم دفع الخطة برفق في الشق لإقامة اتصال بين الأنسجتين. لضمان استقرار هذا الاتصال ، يتم دفع المخطط قليلا بين الشريحة والغشاء النووي الضعيف. ثم يتم إرجاع الأطباق إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للأقسام بالاستقرار على الغشاء.

يجب أن تبدأ الخلايا العصبية في الهجرة من explan إلى RMS المضيف بعد حوالي ساعة إلى ساعتين. من الأفضل تصور هجرة الخلايا باستخدام مسافة عمل طويلة جدا 20 هدفا للطاقة. يتم نقل مشكلات الأنسجة المزروعة من الحاضنة إلى غرفة محتضنة على المجهر.

يمكن تصوير الخلايا العصبية الفلورية على فترات تتراوح من صفر إلى 10 دقائق حسب نوع التحليل المطلوب. تم اختبار بروتوكول ثقافة الشرائح النموذجية العضوية الخاص بنا وتحسينه بدقة على مدار السنوات القليلة الماضية من أجل الاتساق في نمط الهجرة والتوجه في RMS. في هذا المثال ، يكشف تحليل الخلايا المهاجرة من explan ، الذي تم الحصول عليه من الفئران التي يتم فيها التعبير عن طماطم TD تحت العش في المروج عن هجرة سريعة للغاية وموجهة إلى RMS المضيف.

تكبير عالي. يظهر تحليل الفاصل الزمني دقة ممتازة لكامل طول الأرومة العصبية المهاجرة خلال جلسة تصوير مدتها 20 دقيقة. بمجرد اكتمال التصوير ، يتم تثبيت شرائح الجلد بالثلج ، والبارد والطازج ، و 4٪ paraform ، والألدهيد ، والبقع المناعية لمكونات مختلفة من تيار الهجرة.

في هذه الحالة ، يتم الكشف عن الخلايا النجمية الإيجابية GFAP باللون الأزرق و CD 31 الأوعية الدموية الإيجابية باللون الأخضر باستخدام الكيمياء المناعية الفلورية ، وتحليل التكبير العالي للشرائح الملطخة ببروتينات الهيكل الخلوي أكتين باللون الأزرق ، والتوبولين باللون الأخضر يكشف عن تعبير غير منتظم لهذه المكونات بواسطة الخلية. في خضم الهجرة. يقدم بروتوكولنا بعض التحديات التي تتطلب الصبر والممارسة والوقت المخصص لإعداد وتحليل نتائجك.

إذن ، إليك بعض الاقتراحات المفيدة التي ستساعدك في الحصول على أفضل النتائج من تجاربك. في تجربتنا ، تقدم الفئران في الفئة العمرية من P واحد إلى P 10 أفضل النتائج. كما أن مطابقة العمر بين أدمغة المتبرع والمتلقي تحسن قابلية تكرار التجارب.

نظرا لأن معظم الكواشف وأطباق الثقافة يجب أن تكون طازجة ، فإن مقايسة الشرائح الخاصة بنا تتطلب عدة ساعات من التحضير والتصوير دون انقطاع في يوم واحد. بمجرد حصاد الأدمغة ، يجب إنجاز خطوات النتيجة في أسرع وقت ممكن. بين قطع الرأس وتحضير الشرائح ، يجب تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الثلج والكواشف الباردة ومعالجة الأنسجة إلى الحد الأدنى لتجنب الاضطرابات التشريحية.

يجب أن تكون الأدوات المستخدمة في هذه التشريح معقمة ومخصصة لمعالجة الأنسجة الحية فقط. لا تستخدم أبدا الأدوات التي كانت على اتصال بالمثبتات مثل الفورمالديهايد. تكون الشرائح قابلة للحياة بشكل عام لمدة تصل إلى 36 ساعة مع انخفاض واضح في الهجرة والسرعة والاتجاه بين 24 و 36 ساعة.

احذر من هذا القيد عند التخطيط لتجاربك وتحليلاتك.