متغايرة النوى وتقنيات لتحليل نوع من الترجمة الخاصة الخليوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع حركة البروتين عن طريق التعبير عن بروتين واحد يحمل فلوروفورين (Fluor fours) مختلفين في خطين خلويين منفصلين، ثم دمج هذين الخطين الخلويين معاً. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق نقل بلازميدات تحمل الجين محل الاهتمام مدمجاً مع أحد جيني بروتينات الفلوروفور المختلفة إلى نوعين منفصلين من الخلايا. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في خلط الخلايا معاً والسماح لكل نوع من الخلايا بتجميع البروتين.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تثبيط تخليق البروتين، ثم دمج الخلايا باستخدام polyethylene glycol. والخطوة النهائية من الإجراء هي تصور تموضع البروتين عبر المجهر الفلوري. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر تغيراً في تموضع البروتين أو سلوك انتقاله من خلال المجهر الفلوري.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا السرطان، مثل كيفية تغير وظائف وسلوكيات البروتينات المنفصلة عندما تتحول الخلايا. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول التغيرات الخاصة بالخلايا المتحولة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في دراسات أخرى مثل تمايز الخلايا، والبيولوجيا التنموية، وتأشير الخلايا.

بشكل عام، سيواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبات لأن تحسين ظروف عفن الخلايا (transfection) وظروف الاندماج سيكون مطلوباً لكل نوع مختلف من الخلايا. الطريقة الأولى الموضحة في هذا البروتوكول لإدخال DNA البلازميد إلى الخلايا هي طريقة NU Nuclear Affection، والتي تستخدم محلول lonza nuclear effector؛ ابدأ بغسل الخلايا التي تم تمريرها حديثاً وهي في طور النمو اللوغاريتمي باستخدام phosphate buffered saline PBS واجمعها عن طريق الإنزيمات. بمجرد أن تفقد الخلايا قدرتها على الالتصاق، قم بتحييد التربسين بإضافة أوساط تحتوي على المصل واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1500 G لمدة خمس دقائق بينما يتم إجراء الطرد المركزي للخلايا.

أضف شرائح غطاء معقمة إلى طبق سداسي الفجوات داخل غطاء زراعة الأنسجة، ثم انقل بواسطة الماصة 1.5 milliliters من وسط الزراعة الكامل إلى كل فجوة. غطِّ الطبق وانقله إلى حاضنة زراعة الخلايا للوصول إلى حالة التوازن.

بعد عملية الطرد المركزي، انقل الأنابيب إلى خزانة التدفق الصفحي، واشفط السائل الطافي، ثم أعد تعليق كتل الخلايا في أقل حجم ممكن من PBS. بعد ذلك، قم بعد الخلايا وتوزيع حجم معلق الخلايا على أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة. سيوفر ذلك ما يقرب من 5×10⁵ خلية لكل عينة، ثم أجرِ عملية طرد مركزي مرة أخرى عند 1500 G لمدة خمس دقائق.

بمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، ضع الأنابيب في غطاء زراعة الخلايا، ثم اسحب محلول SNA وقم بإعادة التعليق بعناية. علّق الخلايا في كل أنبوب باستخدام 100 µL من محلول المؤثر النووي في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 5 µg من DNA البلازميد إلى كل عينة وانقل العينة إلى وعاء المؤثر النووي وقم بتغطيته.

احرص على تجنب تكون فقاعات الهواء. أدخل العينة qve في حامل Q vet. اختر برنامج المؤثر النووي المناسب ثم ابدأ تشغيله.

قد يتطلب اختيار البرنامج الأكثر ملاءمة إجراء اختبارات مسبقة لتحديد كفاءة ترانسفكشن (transfection) المثلى مع تقليل نسبة النفوق إلى أدنى حد. بعد ذلك، يتم توزيع الخلايا في طبق سداسي الفجوات (six Well plate) إما كمجموعات مختلطة أو بشكل منفصل كعناصر تحكم. أعد الطبق إلى الحاضنة واترك الخلايا للتعافي لمدة 12 hours.

الطريقة الثانية الموضحة للتعبير العابر للبلازميدات هي عفن التحول باستخدام كاشف kagen. للبدء، أضف 0.8 micrograms من كل عينة DNA للبلازميد إلى 200 microliters من محلول EC buffer في أنبوب طرد مركزي معقم. ثم أضف 6.4 microliters من كاشف التعزيز (enhancer reagent) إلى كل عينة.

امزج المكونات لفترة وجيزة عن طريق نقر الأنبوب، ثم حضنها لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد هذه الحضنة القصيرة، أضف 20 microliters من الكاشف المؤثر إلى كل عينة. امزج كل أنبوب عن طريق النقر، ثم حضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

أثناء فترة الحضن، قم بتحضير خطي الخلايا اللذين سيتم استخدامهما في التجربة. ولأغراض ترنسفكشن (transfection)، يجب أن تكون الخلايا قد خضعت لعملية تمرير حديثة وفي مرحلة النمو اللوغاريتمي عند نسبة تلاقي تصل إلى 80% تقريباً. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ثم أضف 1.5 milliliters من وسط DMEM الطازج مع 10%FBS.

بعد تحضين كواشف ترانسفكشن الـ DNA لمدة 15 دقيقة، أضف 1.2 milliliters من وسط DMEM مع 10%FBS إلى كل عينة مع الخلط بواسطة الماصة، ثم انقل فوراً وبشكل قطرات حوالي 700 microliters من المعقدات إلى كل بئر من البئرين في طبق الست بئرات، مع خلط المحتويات عن طريق تدوير الطبق. اترك الخلايا لتخضع لعملية الترانسفكشن لمدة ثلاث ساعات على الأقل في الحاضنة داخل غطاء زراعة الخلايا، ويمكن وضع شريحة غطاء sterilized واحدة لكل بئر في طبق الست بئرات إذا لزم الأمر.

يمكن استخدام الشرائح الغطائية المطلية لتعزيز التصاق الخلايا. بعد ذلك، تُغسل الخلايا المنقولة جينياً مرتين في PBS وتُجمع الخلايا باستخدام الحد الأدنى من عملية التريبسين. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة 100 microliters من محلول التريبسين إلى كل بئر مع رج الطبق لضمان التغطية الكاملة.

ثم يتم سحب التريبسين المتبقي فوراً. يتم تحييد التريبسين المتبقي عن طريق إعادة تعليق الخلايا في 1.5 milliliters من وسط DMEM طازج يحتوي على 10%FBS، ثم تُزرع الخلايا إما كمجموعات مختلطة أو بشكل منفصل كمجموعات ضابطة. وفي طبق الستة آبار الذي يحتوي على شرائح تغطية، تُترك الخلايا للتعافي لمدة 12 hours في حاضنة زراعة الخلايا.

بغض النظر عن طريقة عفن الخلايا (transfection)، فإن إجراء توليد تسربات حاملة متباينة هو نفسه. بعد عفن الخلايا، قم بإزالة أوساط الزراعة من الآبار واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك، يوصى بمعالجة الخلايا باستخدام cyclo heide لتثبيط المزيد من تخليق البروتين.

أضف cyclo heximide بتركيز 100 µg/mL في أوساط الزراعة لتغطية الخلايا، ثم حضنها لمدة ساعتين في حاضنة زراعة الخلايا. وبعد مرور الساعتين، أخرج الخلايا من الحاضنة واغسلها مرتين باستخدام PBS. لبدء عملية الاندماج، غطِّ الخلايا بمحلول يتكون من 50% polyethylene glycol 1000 في وسط DMEM خالٍ من المصل، ثم حضنها لمدة 125 ثانية.

في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة محلول PEG واغسل الخلايا باستخدام PBS لإزالة بقايا الـ peg. بعد ذلك، أضف 2 mL من DMEM بالإضافة إلى 10% FBS مُدفأة إلى 37 °C. قم بتحضين الخلايا لمدة تتراوح من 18 إلى 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا.

بعد فترة الحضانة التي تتراوح من 18 إلى 24 ساعة، أخرج الطبق من الحاضنة واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك، ضع مليلتر واحد من paraform aldehyde بتركيز 4% في PBS في كل بئر، وقم بالرج بلطف لمدة 15 دقيقة.

أثناء فترة الحضن، قم بتجهيز شرائح المجهر المراد استخدامها بإضافة قطرة واحدة من وسط التثبيت الذي يحتوي على dpi. بعد ذلك، اغسل الخلايا المثبتة مرتين باستخدام PBS وقم بإزالة كل غطاء شريحة بعناية باستخدام ملقط صغير. قم بتجفيف بقايا PBS باستخدام قطعة من المناديل الورقية قبل وضع الشريحة بحيث يكون جانب الخلايا لأسفل على شريحة مجهر تحتوي على وسط التثبيت بالإضافة إلى tappi.

قم بإزالة وسط التثبيت الزائد من الشريحة باستخدام مناديل ورقية، ثم قم بسد حواف أغطية الشرائح. باستخدام طلاء الأظافر، يمكن الآن معاينة الخلايا بواسطة المجهر البؤري أو المجهر الفلوري فوق البؤري (epi fluorescence microscopy). يوضح هذا المخطط الانسيابي الطريقة المغايرة (hetero method) لتحليل التموضع المحدد لأنواع الخلايا للبروتينات في ثلاث خطوات أساسية.

عملية عفن البلازميد الذي يعبر عن بروتين مُوسوم بفلورة لدمج الخلايا باستخدام البولي إيثيلين جليكول 1000 والتصوير بالمجهر الفلوري، كما يظهر في صور الفلورة فوق الرأسية هذه؛ حيث تُظهر ضوابط الدمج الذاتي لألياف الجلد القبلية الأولية التي تعبر عن بروتين VP three لفيروس أنيميا الدجاج المووسوم بـ GFP تموضعاً سيتوبلازمياً أساسياً للبروتين في سلالة سرطان الرئة غير صغير الخلايا H 1299. بينما تُظهر ضوابط الدمج الذاتي لنفس بروتين VP three المووسوم بـ DS.RED تموضعاً نووياً أساسياً. ويؤدي الدمج غير المتجانس بين ألياف الجلد القبلية الأولية وخلايا H 1299 إلى إدخال مواد خلوية محولة إلى ألياف الجلد القبلية الأولية، مما يسبب تغيراً في تموضع بروتين VP three المشتق من الخلايا الأولية والمووسوم بـ GFP لينتقل إلى النواة.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن النجاح سيعتمد بشكل كبير على كفاءات عفن التحويل (transfection) في أنواع الخلايا المحددة المستخدمة، بالإضافة إلى تحسين ظروف الاندماج لهذه الخلايا تحديداً. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل flip و frap من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتضمن تحليل ديناميكيات التموضع في الوقت الفعلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم تموضع البروتينات النوعي لكل نوع من الخلايا عن طريق إدخال بروتينات موسومة فلوروسنتياً وتوليد اندماجات خلوية.