القياسات الكهربية من نظام العثة الشم

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح سهولة تسجيل الاستجابات الشمية من الجهاز العصبي للحشرة. ويتم تحقيق ذلك من خلال تثبيت فراشة حية وتوصيل أقطاب كهربائية بقرن الاستشعار أو بعصبون فردي لتسجيل الاستجابات الناجمة عن المواد الشمية. كخطوة أولى، يتم غرس قطب زجاجي مملوء بمحلول ملحي في العين ليعمل كطرف أرضي، وفي الخطوة الثانية، يتم إدخال أي من الفراشات المثبتة في قطب زجاجي مملوء بمحلول ملحي، مما يسمح بتسجيل الاستجابات الكهربائية على شكل مخطط قرن استشعار (antenna gram) لتسجيل استجابات الوحدة الواحدة من عصبون مستقبل شمّي.

يتم إدخال قطب التسجيل عند قاعدة قرن الاستشعار. بعد ذلك، يتم تضخيم إشارة الهوائي وتغذيتها في محول تماثلي رقمي من أجل تسجيل الإشارات وحفظها. يتم الحصول على نتائج تظهر استجابات مستحثة بالروائح تعتمد على الجرعة، بناءً على الإشارة الكهربائية المسجلة في شكل إشارة EAG أو نبضة.

لقد طورنا طريقة جديدة لتسجيل المخطط العصبي (Enterogram) من عثة برتقال نافل الحية والمقيدة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن التحضير يستمر لفترة طويلة، مما يسمح باستخدام العثة نفسها عدة مرات لتسجيل استجابات متعددة، كما يمكن استخدام العثة ذاتها لتسجيل استجابات الوحدة المنفردة من مستشعر فردي في قرن الاستشعار. وقد ركزنا على عثة برتقال نافل لكونها ذات أهمية زراعية كبيرة في كاليفورنيا.

ومع ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لحشرات أخرى من رتبة Lepidoptera، ليس فقط لمعالجة الأسئلة الجوهرية حول وظيفة الشم، ولكن أيضاً لتطوير مواد جاذبة جديدة. وتستخدم هذه الدراسة للجهاز الشمي لدى العثات دودة البرتقال السري Navel orange worm. Ullo Ella.

يتم الحفاظ على مستعمرة الحشرات على نظام غذائي من نخالة القمح في غرف بيئية عند درجة حرارة 28 °C تقريباً، ورطوبة نسبية تبلغ 75% تقريباً، وتحت نظام إضاءة يتراوح بين 16 إلى 8 ساعات من الضوء والظلام؛ قم بتجهيز حاويات للعث حديث البزوغ عن طريق وضع ما يصل إلى 10 طبقات من المناشف الورقية المبللة بالماء في صندوق بلاستيكي. اجمع العث البازغ وحدد جنسه يومياً، ثم انقلها إلى الصندوق البلاستيكي. غطِ الصندوق بغطاء مثقوب للسماح بتدوير الهواء تحضيراً للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية.

أولاً، قم بصنع حامل للعثة عن طريق قص طرف ماصة سعة 200 µL بحيث يبلغ قطر الطرف حوالي 2 mm. بالنسبة لاختبار EAG أو SSR، اختر عثة مرّ على خروجها من الشرنقة من يومين إلى أربعة أيام. أدخل العثة في الماصة من الطرف المقابل للرأس باستخدام قطعة صغيرة من ورق مناديل مبلل، وادفع العثة بلطف باتجاه رأس الماصة.

استمر في دفع العثة حتى تبرز قرون الاستشعار وجزء من الرأس من الطرف، ثم قم بتثبيت الرأس المكشوف عن طريق تغطيته بطين غير جاف، مع ترك جزء صغير من إحدى العينين وقرني استشعار مكشوفين. ضع تحضيرة العثة على منصة الميكرو-مناور الخاص بمخطط الكهرباء بين حاملَي القطبين باستخدام أقطاب زجاجية يقل قطر طرفها عن 1 micron. املأ الأقطاب من الخلف بمحلول centum limb ringer.

أثناء النظر عبر المجهر، قم بغرز أحد الأقطاب الكهربائية في المنطقة المكشوفة من العين؛ حيث سيعمل هذا كقطب مرجعي. والخطوة التالية هي وضع أقطاب التسجيل على قرون الاستشعار.

تتكون قرصة ذكر فراشة دودة البرتقال البحرية من قطع متعددة، وتزدان كل قطعة بعدد كبير من الهياكل الشبيهة بالشعيرات. تظهر الصورة المصغرة مجهرًا إلكترونيًا ماسحًا يوضح تفاصيل الـ illa لتسهيل التسجيل من قرون الاستشعار. قم بقطع قطعة أو قطعتين من القطع الطرفية لقرن الاستشعار.

بعد ذلك، يتم إدخال كلتا قرني الاستشعار في قطب التسجيل. بدلاً من ذلك، ولتسجيلات قرن استشعار واحد، يتم إدخال قطب التسجيل عند قاعدة قرن الاستشعار. يتم تضخيم جهود الفعل الناتجة عن قرون الاستشعار بواسطة مضخم أولي عالي المقاومة، ثم تُنقل إلى محول رقمي تماثلي ذكي يعمل بمنفذ USB لتحليلها لاحقاً باستخدام برنامج autos spike.

تتمثل الخطوة التالية في تحضير المحفز الكيميائي باستخدام ZZ 1113 HEXA deca Now، وهو مكون رئيسي في مزيج الفيرومونات الأنثوية لديدان البرتقال البحرية؛ يتم تخفيف المادة الكيميائية باستخدام الهكسان لإجراء تخفيفات DIC. يتم وضع 10 µL من محلول المحفز على ورقة ترشيح watman. يُبخر المذيب عن طريق رج الورقة بلطف لمدة 10 ثوانٍ.

تحت غطاء سحب الأدخنة، ضع الشريط في حقنة بولي بروبيلين سعة 5 mL، مع استخدام الهكسان وحده، وحقنة فارغة لضبط ضوابط التحضير. يتم وضع EAG أو SSR في تيار هوائي مرطب يتم توفيره بواسطة وحدة التحكم في المحفزات بمعدل 20 mL/s. قم بتوصيل الحقنة التي تحتوي على المحفز الكيميائي بوحدة التحكم في تدفق الهواء.

سجل إشارات كهربائية أساسية لمدة ثانيتين. ثم أضف نبضة تحفيز بمعدل 4 ml/s إلى تيار الهواء لمدة 500 ms. استمر في تسجيل الإشارات الكهربائية لمدة ثماني ثوانٍ إضافية.

اترك دقيقة واحدة على الأقل بين عمليات التحفيز. يوضح هذا الشكل استجابة قوية تعتمد على الجرعة من قرون استشعار عثة ذكر مقيد. تم التحفيز باستخدام مكون الفيرومون الأنثوي، CZ 1113 hexaco.

الاستجابة للهكسان. يظهر خط التحكم في الناقل باللون الأزرق بالتتابع. وتؤدي الجرعات الأكبر من الفيرومون إلى توليد تسجيلات كهربية أكبر بالتتابع.

يوضح هذا الشكل تسجيلات الوحدة المنفردة خارج الخلية من trichordium استجابةً للتحفيز من مكون الفيرومون الأنثوي. وتظهر هذه التسجيلات استجابة استثارة تعتمد على الجرعة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند استخدام هذه الطريقة، تأكد من تجنب التلوث واستخدام مواد كيميائية بأعلى درجة ممكنة من النقاء.