قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس مدى حياة ديدان الـ Elgan البحرية التي عولجت بالعقاقير محل الدراسة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير OP 50، وهي سلالة بكتيرية تُستخدم لتغذية الديدان. بعد ذلك، يتم إنتاج مجموعة من الديدان متزامنة العمر وزرعها في أطباق ذات 96 بئراً مع بكتيريا التغذية OP 50.

على مدار اليومين التاليين، تنمو الديدان إلى المرحلة اليرقية الرابعة L4، ويُضاف عقار FUDR لمنع التكاثر. وفي اليوم التالي، تصل الديدان إلى مرحلة البلوغ وتُضاف الأدوية المراد دراستها إلى الآبار الفردية. ومن هذه النقطة فصاعداً، يتم تحديد عدد الديدان الحية والميتة كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الديدان.

تتم الملاحظة باستخدام مجهر مقلوب، ويتم تسجيل عدد الديدان الميتة والحية في كل جلسة. مرحباً، أنا غريغ سوليس. أنا في مختبر بترو بقسم الفسيولوجيا الكيميائية في معهد سكريپس للأبحاث.

سأعرض لكم اليوم كيفية مزامنة الديدان وتوزيعها في أطباق معايرة دقيقة ذات 96 بئراً. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقكم الحالية هي أنها تسمح بالتحديد السريع للجزيئات التي تزيد من طول عمر C. elegans. لذا، فلنبدأ.

لتحضير البكتيريا المغذية لـ C elegance، ابدأ في اليوم السابع قبل التجربة عن طريق تلقيح 5 mL من وسط TB الذي يحتوي على 100 µg/mL من الأمبيسيلين و0.1 µg/mL من النيومايسين B بمستعمرة واحدة من OP 50، ثم حضنها طوال الليل عند 37 °C في هزاز بكتيري. في صباح اليوم التالي، قم بتخفيف المزرعة الليلية من OP 51 في 300 mL من وسط TB الذي يحتوي على 50 µg/mL من الأمبيسيلين. حضن المزرعة في هزاز بكتيري لمدة تتراوح بين 8 إلى 12 ساعة عند 37 °C حتى تصل إلى مرحلة التشبع. لا تسمح للمزرعة بالنمو لأكثر من 14 ساعة.

انقل سلالة OP 50 إلى أنبوب طرد مركزي معقم وموزون مسبقاً. قم بترسيب OP 50 عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق بسرعة 3,500 RPM أو بقوة 2,200 ×g في جهاز طرد مركزي مكتبي. تخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق رابية OP 50 في ماء مقطر وأعد الترسيب بواسطة الطرد المركزي. كرر هذه العملية، واغسل المادة مرتين بعد المرة الثانية.

اغسل بعناية وأزل جميع المياه المتبقية تمامًا. زِن أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على الراسب واطرح منه وزن أنبوب الطرد المركزي الفارغ لتحديد وزن الراسب. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب تمامًا في S Complete حتىما يصل التركيز إلى 100 mg/mL.

يجب ألا تتبقى أي تكتلات. يجب أن تعادل تركيز 100 milligrams per milliliter من OP 50 حوالي 2 × 10¹⁰ bacteria per milliliter. استخدم المقياس الطيفي الضوئي لتحديد عدد bacteria per milliliter إذا كانت العلاقة بين الكثافة الضوئية وعدد bacteria per milliliter معروفة.

إذا لزم الأمر، اضبط تركيز محلول تغذية OP 50 ليصل إلى 2 × 10¹⁰ بكتيريا لكل مليلتر. وأخيراً، احفظ محلول OP 50 عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم استخدامه في استزراع الديدان لإنتاج مجموعة من الديدان متزامنة العمر. ابدأ في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم السادس قبل التجربة (day -6) باستخدام طبق NGM يتراوح عمره من 5 إلى 10 أيام، بحيث يتكون مجتمع الديدان فيه بشكل أساسي من يرقات L1 الجائعة.

عقم ملعقة معدنية بتسخينها لفترة وجيزة فوق موقد بنزن. اتركها لتبرد، ثم استخدم الملعقة المبردة لقطع قطع من الآجار من الطبق الذي يحتوي على الديدان الجائعة.

انقل عدة قطع من هذه القطع إلى طبق NGM جديد بقطر 10 سنتيمتر تم استزراعه ببكتيريا OP 50. قم بتحضين الديدان لمدة 65 ساعة تقريبًا عند درجة حرارة 20 degrees Celsius حتى يتكون غالبية مجتمع الديدان من بالغين في مرحلة grave adults. قد يختلف الوقت الذي تستغرقه حيوانات L one الجائعة للنمو لتصبح بالغين في مرحلة grave adults من سلالة إلى أخرى.

بعد فترة الحضن، يتم جمع الديدان من الطبق الذي قطره 10 سنتيمتر عن طريق غسلها من الطبق باستخدام خمسة إلى 10 ملليلتر من الماء المعقم. يتم نقل محلول الديدان والماء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. تُغسل الديدان عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين في جهاز طرد مركزي مكتبي بسرعة 1,200 RPM أو 280 ×g. يتم التخلص من السائل الطافي وإضافة 10 ملليلتر من الماء.

كرر خطوة الغسل، ثم تخلص من السائل الطافي في الأنبوب المركز (SUP) وأضف خمسة ملليلترات من المبيض المُحضّر حديثاً. يتم تحضين محلول هيدروكسيد الصوديوم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تتفكك أجسام الديدان. تأكد من استخدام جهاز المزج الدوامي (vortex) بلطف كل دقيقة.

راقب تقدم التفاعل تحت مجهر التشريح بمجرد تحلل جميع البالغين. أضف خمسة ملليلتر من منظم M nine لمعادلة التفاعل. اغسل البيض ثلاث مرات بـ 10 ملليلتر من منظم M nine عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين بسرعة 2,500 RPM أو 1,100 times G. ثم اغسل البيض مرة واحدة بـ 10 ملليلتر من S complete عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين بسرعة 2,500 RPM أو 1,100 times G. قم بإزالة الرائق.

أضف 10 milliliters من S complete وانقل المحلول إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. أضف 30 milliliters من S complete ليصل الحجم النهائي إلى 40 milliliters. رج الأنبوب برفق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز mutator أو جهاز مماثل، وذلك لتحضير أطباق الحيوانات في اليوم التالي حوالي منتصف النهار.

باستخدام مجهر تشريحي، تحقق مما إذا كانت الديدان قد فقست خلال الليل. حدد تركيز الديدان في محلول S الكامل عن طريق عد عدد الديدان في قطرات بحجم 10 µL. وباستخدام المجهر التشريحي، قم بعدّ 10 قطرات على الأقل لكل عينة.Resus.

علّق الديدان بتركيز يتراوح من 80 إلى 100 دودة لكل milliliter. وفي الوسط الكامل S، أضف carbenicillin بتركيز نهائي قدره 50 micrograms لكل milliliter وamphotericin B بتركيز نهائي قدره 0.1 micrograms لكل milliliter. رجّ المزيج باستخدام جهاز mutator.

في حال تحضير كميات أكبر من الديدان، استخدم دورقاً غير مخروطي سعة 600 milliliter بغطاء مرشح. في تمام الساعة 2:30 مساءً، أضف OP 50 المحضر في الجزء الأول لتصل إلى تركيز نهائي قدره 6 mg/mL. أعد OP 50 إلى درجة حرارة 4 °C. انقل 120 µL من محلول الديدان OP 50 إلى كل بئر في طبق 96 بئراً ذي قاع شفاف.

تأكد من إبقاء الديدان والمعلق أثناء السحب بالماصة، ثم أحكم إغلاق الطبق باستخدام شريط لاصق لتجنب التلوث والتبخر. رج الطبق على هزاز أطباق معايرة دقيقة لمدة دقيقتين، ثم قم بالتحضين لمدة يومين عند 20 °C حتى تصل الحيوانات إلى مرحلة L4. ولتعقيم الحيوانات بعد ذلك، أضف 30 µL من محلول FUDR المخزون بتركيز 0.6 mM إلى كل بئر.

تؤدي هذه الخطوة إلى جعل الحجم النهائي في كل بئر 150 microliters وتخفض التركيز النهائي لـ OP 50 من ستة mg/mL إلى خمسة mg/mL. قم بإغلاق الطبق باستخدام أشرطة الإغلاق ورجه لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق على هزاز أطباق الميكروترون. إذا تمت إضافة OP 50 في الساعة 2:30 في اليوم (ناقص 2)، فمن المهم إضافة FUDR قبل الظهر، ثم أعد الأطباق إلى الحضانة عند 20 °C بحلول الساعة 9:00 صباحاً في اليوم التالي.

يجب أن تكون معظم الحيوانات في مرحلة البلوغ وتحتوي على عدة بيضات. يتم إضافة العقاقير المراد اختبار تأثيرها على طول العمر بالتركيز المطلوب. وفي حال إذابة العقاقير في DMSO، يجب ألا تتجاوز التركيزات النهائية لـ DMSO نسبة 0.6%، حيث أن تركيزات DMSO الأعلى من 0.6% تؤدي إلى تقصير عمر الـ elgan بعد إضافة العقار.

أغلق الأطباق باستخدام شريط لاصق ورجها لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق على جهاز رج الأطباق ذات المعايرة الدقيقة (microtiter plate shaker)، ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة عند درجة حرارة 20 درجة Celsius. قد تؤدي إضافة العقاقير في بعض الأحيان إلى موت عدد قليل من الحيوانات في كل طبق، خاصة عند استخدام مذيب غير الماء.

استخدم مجهراً مقلوباً للتحقق من وجود حيوانات ميتة. وبوجه عام، يجب أن يكون عدد الحيوانات الميتة أقل من 10 حيوانات لكل لوحة 96 بئراً. أعد اللوحات إلى الحاضنة عند درجة حرارة 20 degrees Celsius لمدة يومين للسماح للأكسجين النقي بالدخول إلى المزرعة. قم بإزالة سدادة الإغلاق.

انتظر لمدة دقيقة واحدة ثم أعد إغلاق الطبق. قم برج الطبق لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق باستخدام هزاز أطباق دقيق (microplate shaker)، وكرر هذه العملية مرة واحدة كل أسبوع في اليوم الخامس من عمر البالغين، ثم أضف 5 µL من محلول OP 50 بتركيز 100 mg/mL الذي تم تحضيره مسبقاً إلى كل بئر من الآبار الـ 96 لمنع المجاعة. يتم تقييم عمر الديدان من خلال حركتها ثلاث مرات أسبوعياً منذ بداية التجربة وحتى موتها.

استخدم مجهراً مقلوباً بعدسة شيئية بقوة 2x أو 2.5x لفحص الديدان في أطباق ذات 96 بئراً في اليوم صفر عند بداية التجربة. قم بعدها للعدد الإجمالي للديدان في كل بئر.

آبار الاستشعار التي تحتوي على أكثر من 18 حيوانًا من التحليل، حيث لن تتوفر لهذه الحيوانات في هذه الآبار كمية كافية من OP 50، وستظهر عليها آثار التقييد الغذائي في كل جلسة عد. قم بتسجيل التاريخ وعدد الحيوانات التي تتحرك كحيوانات حية. تكون الحركة في السائل أسهل بكثير منها على الأوساط الصلبة، ويمكن تحفيزها بواسطة الأضواء القوية.

قد يساعد استخدام تكبير أعلى في رصد الحركات الدقيقة جداً مثل تلك التي تحدث عند طرف البلعوم. وغالباً ما تكون هذه الحركات الدقيقة هي الحركة الوحيدة التي تُلاحظ في الحيوانات المسنة جداً. أعِد الأطباق إلى الحاضنة عند درجة حرارة 20 degrees Celsius.

كرر جلسات العد كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الحيوانات. هذا نموذج لورقة Excel لتسجيل بيانات فترة الحياة لكل بئر؛ حيث يتم تدوين إحداثياته في الطبق، وسلالة الحيوان، وتركيز الدواء المستخدم، كما يتم تسجيل العدد الإجمالي للحيوانات الحية في اليوم صفر عند بداية التجربة.

سجّل التاريخ بالإضافة إلى عدد الحيوانات الحية والميتة ثلاث مرات في الأسبوع لمتابعة بقاء المجموعات المختلفة في كل بئر. يوضح هذا الشكل نتائج منحنيات طول العمر لـ sea elegance التي تم تسجيلها عند 20 °C و 25 °C. يعيد اختبار طول العمر القائم على الأطباق ذات الآبار الدقيقة إنتاج التغيرات المعتمدة على درجة الحرارة في طول العمر بدقة.

وبالمثل، كما هو موضح هنا، يعيد مقايسة طبق المعايرة الدقيقة (microtiter plate assay) إنتاج التغيرات في طول العمر لدى الطفرات التي أفيد بأن أعمارها تختلف عن حيوانات النوع البري N two. يوضح هذا الشكل كيف تؤثر الجرعات المتزايدة من الميرتازابين (mirtazapine) على متوسط طول العمر في sea elegance. وتعتبر البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة مقايسة طبق المعايرة الدقيقة كمية بما يكفي لتحديد علاقات الاستجابة للجرعة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لفحص مكتبات كيميائية كبيرة للبحث عن جزيئات تعمل على إطالة عمر see elegance.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.