Name: قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: تعلم قياس عمر Caenorhabditis elegans في أطباق 96 بئر باستخدام تقنية المزامنة العمرية والفحص عالي الإنتاجية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد المركبات المؤثرة على طول العمر.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وضعت أصلا من هذا البروتوكول في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل ويي Xiaolan Petrascheck مايكل في مختبر ليندا باك. وقد أعد هذا الإصدار المفصلة أعلاه إلى اتخاذ جميع الإجراءات المتاحة للالمجتمع الأوسع. نشكر كارول تايلور ، LeBoeuf سارة وTomacelli اندي لقراءة نقدية للبروتوكول. هذا المخطوط # 2866 من معهد سكريبس للأبحاث. ويتم تمويل مختبر Petrascheck بواسطة برنامج ADI نوفارتيس.

<ol><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li>
<li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li>
<li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li>
<li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li>
<li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li>
<li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li>
<li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li>
<li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li>
<li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li>
<li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK%2C+LKB1%2C+and+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li>
<li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li>
<li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li>
<li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase%2Fcatalase+mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li>
<li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li>
<li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+MPP%2B+model+of+Parkinson%27s+disease+for+high-throughput+drug+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegener+Dis%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li>
<li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدمت بروتوكول يسمح بقياس عمر C.elegans في 96 لوحات microtiter جيدا. كما هو مبين في نتائج ممثل القسم أن يعيد موثوق النتائج السابقة ، ويوفر معلومات كمية. باستخدام هذا الاختبار وفحص أكثر من 89000 نجحنا جزيئات من حيث تأثيرها على عمر C.elegans. لغرض فحص المخدرات ، وقياس عمر في 96 لوحة تنسيق جيد microtiter ديها العديد من المزايا خلال فحص وسائل الاعلام الصلبة الكلاسيكية. أنه يقلل من العمالة المطلوبة لإعداد وسائل الإعلام ، مقدار المساحة الحضانة ، وكمية المخدرات المطلوبة. شكل 96 - جيدا والإعداد المجهري تسمح أتمتة فحص كامل للعروض إنتاجية عالية. خلال تطوير فحص قيم متعددة لكل متغير وخليط منها واختبارها لآثارها على عمر C.elegans. وشملت هذه الاختبارات OP50 تركيز مختلفة تتراوح من 3 إلى 10 ملغ / مل (3 ، 4 ، 6 ، 8 ، 10 ملغ / مل) ، عدد من الديدان المختلفة لكل بئر تتراوح بين 7 إلى 45 (7 ، 10 ، 15 ، 22 ، 45 الديدان / جيد) ، وأحجام مختلفة تتراوح الثقافة 40-150 ميكرولتر لكل بئر (40 ، 60 ، 80 ، 100 ، 120 ، 150 ميكرولتر) ، والتغيرات في تركيبة العازلة. إذا تم العثور على تغذية مع OP50 كربنيسيلين المقاوم ، لا كربنيسيلين ولا باء الامفوتريسين في تركيزات اشارت الى تؤثر C.elegans العمر. تم العثور على الهز المستمر لطيف من لوحات ، على النحو الموصى به في كثير من الأحيان في الثقافة C.elegans السائل ، والاستغناء عن وحدات التخزين الصغيرة المستخدمة في هذا الاختبار. تهتز لطيف ولكن إذا كان هناك حاجة لوحات microtiter مع أكبر الآبار لاستخدامها. وأشار القيم في هذا البروتوكول قد تم اختيارها بعناية على أساس المقارنة الإحصائية لظروف مختلفة اختبارها. الميزة الأكثر إثارة للدهشة من هذا الاختبار هو على الأرجح أنه يمكن الاحتفاظ C.elegans في 96 لوحات جيدا أن ومختومة بالشمع. لم جنبا إلى جنب مقارنات لم تكشف عن أي اختلاف في عمر الحيوانات المستزرعة في لوحات تفض ، في لوحات مختومة مع السداده البلاستيك ، أو في لوحات مختومة مع السدادات التي تتيح تبادل الهواء. في جميع الحالات الثلاث ، وضعت الحيوانات متجانس جدا من L1 حامل للبالغين في غضون 65 ساعة وأظهرت أعمار مماثلة للغاية. وضعت الحيوانات نمت بالتوازي على NGM أسرع قليلا ، ولكن هذا الاختلاف كان مستقلا من غياب أو وجود السداده. ويستند البروتوكول عرضت على البكتيريا الحية ، ولكن يمكن تكييفها للبكتيريا ميتة. ومع ذلك ، في فحص السائل يمكن لبكتيريا واحدة على قيد الحياة تتكاثر بسرعة وإعادة ملء الثقافة. في أيدينا ، والطريقة الوحيدة التي يعول عليها لقتل البكتيريا إلى حد أنه يمكن استخدامها للثقافة السائل هو عن طريق العلاج لفترات طويلة من البكتيريا مع أشعة غاما. نقطة واحدة من المهم النظر في التخطيط لتجربة عمر هي قوة الكشف. اعتمادا على حجم التأثير ، لا بد من اختبار تأثير المخدرات من اهتمام في آبار متعددة. في مقايسة 4 نموذجية للأدوية المعالجة ومراقبة الآبار 4 ، الموافق 40-50 تقريبا كل الحيوانات ، يجب أن يكون كافيا للكشف عن زيادة بنسبة 30 ٪ في عمر في أكثر من 95 ٪ من التجارب. يتم الكشف عنها إلا زيادة قدرها 14 ٪ في 60 ٪ من الحالات ، وبالتالي تتطلب المزيد من الآبار تكرار. ويمكن استخدام ثروة من البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة عمر هذا الاختبار لتطوير تجربة أو سلالة معينة من النماذج إن السفارة parametrical 1. هذه النماذج إن السفارة هي مفيدة لتحديد قوة الكشف وتقدير عدد من ايجابيات وسلبيات كاذبة على نطاق واسع الشاشات. علينا التحقق من التوقعات من هذه النماذج في التجارب الأعمى واستخدموه لتقدير أعداد من السلبيات كاذبة في شاشات كبيرة (نتائج غير منشورة). باختصار ، نحن نتوقع أن يقدم مقايسة سيكون ذات فائدة كبيرة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تمتد من عمر C.elegans ودراسة الآليات الكامنة.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>يسمى أيضاً Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>يتعطل FUDR بالحرارة، لذا يتم إذابته في ماء بارد</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>يستخدم كضابط موجب بتركيز نهائي 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>ضابط موجب بديل بتركيز نهائي 10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>شريط إحكام</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>بوليستر، غير معقم</td></tr><tr><td>صفيحة 96 بئراً</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>غير معالجة، شفافة، معقمة ومغلفة فردياً، بوليسترين</td></tr><tr><td>دورق Nunclon</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>يستخدم للأحجام الكبيرة</td></tr></tbody></table>

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات microtiter حسنا

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

عمر هو عملية بيولوجية التي تنظمها عدة مسارات الوراثية. استراتيجية واحدة للتحقيق في بيولوجيا الشيخوخة في دراسة الحيوانات أن الطفرات في مكونات الميناء من هم في سن التنظيمية المسارات. إذا كانت هذه الطفرات التشويش وظيفة مسار العمر التنظيمية وبالتالي يغير عمر الكائن الحي بأكمله ، لأنها توفر رؤى الآلية الهامة 1-3. استراتيجية أخرى للتحقيق في تنظيم عمر هو استخدام جزيئات صغيرة لمسارات العمر التنظيمية التشويش. حتى الآن ، وتعرف على عدد من الجزيئات لتمديد عمر الكائنات الحية في نموذج مختلف ، وتستخدم كأدوات لدراسة بيولوجيا الشيخوخة 16/04. عدد من الجزيئات التي تم تحديدها حتى الآن هو صغير مقارنة مع &quot;مجموعة أدوات&quot; الجينية التي تتوفر لدراسة بيولوجيا الشيخوخة. ايليجانس انواع معينة هي واحدة من حيث المبدأ النماذج المستخدمة لدراسة الشيخوخة بسبب الوراثة الممتازة والعمر قصير من ثلاثة أسابيع. في الآونة الأخيرة ، برز بوصفه الكائن C.elegans نموذجا للشاشات النمط الظاهري يستند 5،7،16-20 المخدرات بسبب صغر حجمها وقدرتها على النمو في لوحات microtiter. نحن هنا تقديم مقايسة لقياس عمر C.elegans في 96 لوحات microtiter جيدا. كانت تجربة البلدان المتقدمة النمو واستخدمت بنجاح على شاشة كبيرة للمكتبات الجزيئات التي تمتد C.elegans عمر 7. وقد تم تقييم مدى موثوقية مقايسة في اختبارات متعددة : أولا ، عن طريق قياس عمر الحيوانات البرية نوع نمت في درجات حرارة مختلفة ، وثانيا ، من خلال قياس عمر المسوخ مع أعمار تغيير ، وثالثا ، من خلال قياس التغيرات في عمر ردا على تركيزات مختلفة من Mirtazepine المضادة للاكتئاب. Mirtazepine سبق ثبت لتمديد عمر في C.elegans 7. نتائج هذه الاختبارات تبين أن مقايسة غير قادرة على تكرار النتائج السابقة من فحوصات أخرى والكمي. تنسيق microtiter أيضا يجعل هذا الاختبار عمر الآلي متوافقة مع نظم مناولة السائل ، ويتيح الاندماج منصات الآلي.

في هذا البروتوكول نقدم طريقة لقياس<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; عمر في 96 لوحات microtiter جيدا.

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

تُعد فترة الحياة عملية بيولوجية تنظمها عدة مسارات جينية. وتتمثل إحدى استراتيجيات استقصاء بيولوجيا الشيخوخة في دراسة الحيوانات التي تحمل...

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس مدى حياة ديدان الـ Elgan البحرية التي عولجت بالعقاقير محل الدراسة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير OP 50، وهي سلالة بكتيرية تُستخدم لتغذية الديدان. بعد ذلك، يتم إنتاج مجموعة من الديدان متزامنة العمر وزرعها في أطباق ذات 96 بئراً مع بكتيريا التغذية OP 50.على مدار اليومين التاليين، تنمو الديدان إلى المرحلة اليرقية الرابعة L4، ويُضاف عقار FUDR لمنع التكاثر. وفي اليوم التالي، تصل الديدان إلى مرحلة البلوغ وتُضاف الأدوية المراد دراستها إلى الآبار الفردية. ومن هذه النقطة فصاعداً، يتم تحديد عدد الديدان الحية والميتة كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الديدان.تتم الملاحظة باستخدام مجهر مقلوب، ويتم تسجيل عدد الديدان الميتة والحية في كل جلسة. مرحباً، أنا غريغ سوليس. أنا في مختبر بترو بقسم الفسيولوجيا الكيميائية في معهد سكريپس للأبحاث.سأعرض لكم اليوم كيفية مزامنة الديدان وتوزيعها في أطباق معايرة دقيقة ذات 96 بئراً. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقكم الحالية هي أنها تسمح بالتحديد السريع للجزيئات التي تزيد من طول عمر C. elegans. لذا، فلنبدأ.لتحضير البكتيريا المغذية لـ C elegance، ابدأ في اليوم السابع قبل التجربة عن طريق تلقيح 5 mL من وسط TB الذي يحتوي على 100 µg/mL من الأمبيسيلين و0.1 µg/mL من النيومايسين B بمستعمرة واحدة من OP 50، ثم حضنها طوال الليل عند 37 °C في هزاز بكتيري. في صباح اليوم التالي، قم بتخفيف المزرعة الليلية من OP 51 في 300 mL من وسط TB الذي يحتوي على 50 µg/mL من الأمبيسيلين. حضن المزرعة في هزاز بكتيري لمدة تتراوح بين 8 إلى 12 ساعة عند 37 °C حتى تصل إلى مرحلة التشبع. لا تسمح للمزرعة بالنمو لأكثر من 14 ساعة.انقل سلالة OP 50 إلى أنبوب طرد مركزي معقم وموزون مسبقاً. قم بترسيب OP 50 عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق بسرعة 3,500 RPM أو بقوة 2,200 ×g في جهاز طرد مركزي مكتبي. تخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق رابية OP 50 في ماء مقطر وأعد الترسيب بواسطة الطرد المركزي. كرر هذه العملية، واغسل المادة مرتين بعد المرة الثانية.اغسل بعناية وأزل جميع المياه المتبقية تمامًا. زِن أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على الراسب واطرح منه وزن أنبوب الطرد المركزي الفارغ لتحديد وزن الراسب. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب تمامًا في S Complete حتىما يصل التركيز إلى 100 mg/mL.يجب ألا تتبقى أي تكتلات. يجب أن تعادل تركيز 100 milligrams per milliliter من OP 50 حوالي 2 × 10¹⁰ bacteria per milliliter. استخدم المقياس الطيفي الضوئي لتحديد عدد bacteria per milliliter إذا كانت العلاقة بين الكثافة الضوئية وعدد bacteria per milliliter معروفة.إذا لزم الأمر، اضبط تركيز محلول تغذية OP 50 ليصل إلى 2 × 10¹⁰ بكتيريا لكل مليلتر. وأخيراً، احفظ محلول OP 50 عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم استخدامه في استزراع الديدان لإنتاج مجموعة من الديدان متزامنة العمر. ابدأ في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم السادس قبل التجربة (day -6) باستخدام طبق NGM يتراوح عمره من 5 إلى 10 أيام، بحيث يتكون مجتمع الديدان فيه بشكل أساسي من يرقات L1 الجائعة.عقم ملعقة معدنية بتسخينها لفترة وجيزة فوق موقد بنزن. اتركها لتبرد، ثم استخدم الملعقة المبردة لقطع قطع من الآجار من الطبق الذي يحتوي على الديدان الجائعة.انقل عدة قطع من هذه القطع إلى طبق NGM جديد بقطر 10 سنتيمتر تم استزراعه ببكتيريا OP 50. قم بتحضين الديدان لمدة 65 ساعة تقريبًا عند درجة حرارة 20 degrees Celsius حتى يتكون غالبية مجتمع الديدان من بالغين في مرحلة grave adults. قد يختلف الوقت الذي تستغرقه حيوانات L one الجائعة للنمو لتصبح بالغين في مرحلة grave adults من سلالة إلى أخرى.بعد فترة الحضن، يتم جمع الديدان من الطبق الذي قطره 10 سنتيمتر عن طريق غسلها من الطبق باستخدام خمسة إلى 10 ملليلتر من الماء المعقم. يتم نقل محلول الديدان والماء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. تُغسل الديدان عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين في جهاز طرد مركزي مكتبي بسرعة 1,200 RPM أو 280 ×g. يتم التخلص من السائل الطافي وإضافة 10 ملليلتر من الماء.كرر خطوة الغسل، ثم تخلص من السائل الطافي في الأنبوب المركز (SUP) وأضف خمسة ملليلترات من المبيض المُحضّر حديثاً. يتم تحضين محلول هيدروكسيد الصوديوم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تتفكك أجسام الديدان. تأكد من استخدام جهاز المزج الدوامي (vortex) بلطف كل دقيقة.راقب تقدم التفاعل تحت مجهر التشريح بمجرد تحلل جميع البالغين. أضف خمسة ملليلتر من منظم M nine لمعادلة التفاعل. اغسل البيض ثلاث مرات بـ 10 ملليلتر من منظم M nine عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين بسرعة 2,500 RPM أو 1,100 times G. ثم اغسل البيض مرة واحدة بـ 10 ملليلتر من S complete عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين بسرعة 2,500 RPM أو 1,100 times G. قم بإزالة الرائق.أضف 10 milliliters من S complete وانقل المحلول إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. أضف 30 milliliters من S complete ليصل الحجم النهائي إلى 40 milliliters. رج الأنبوب برفق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز mutator أو جهاز مماثل، وذلك لتحضير أطباق الحيوانات في اليوم التالي حوالي منتصف النهار.باستخدام مجهر تشريحي، تحقق مما إذا كانت الديدان قد فقست خلال الليل. حدد تركيز الديدان في محلول S الكامل عن طريق عد عدد الديدان في قطرات بحجم 10 µL. وباستخدام المجهر التشريحي، قم بعدّ 10 قطرات على الأقل لكل عينة.Resus.علّق الديدان بتركيز يتراوح من 80 إلى 100 دودة لكل milliliter. وفي الوسط الكامل S، أضف carbenicillin بتركيز نهائي قدره 50 micrograms لكل milliliter وamphotericin B بتركيز نهائي قدره 0.1 micrograms لكل milliliter. رجّ المزيج باستخدام جهاز mutator.في حال تحضير كميات أكبر من الديدان، استخدم دورقاً غير مخروطي سعة 600 milliliter بغطاء مرشح. في تمام الساعة 2:30 مساءً، أضف OP 50 المحضر في الجزء الأول لتصل إلى تركيز نهائي قدره 6 mg/mL. أعد OP 50 إلى درجة حرارة 4 °C. انقل 120 µL من محلول الديدان OP 50 إلى كل بئر في طبق 96 بئراً ذي قاع شفاف.تأكد من إبقاء الديدان والمعلق أثناء السحب بالماصة، ثم أحكم إغلاق الطبق باستخدام شريط لاصق لتجنب التلوث والتبخر. رج الطبق على هزاز أطباق معايرة دقيقة لمدة دقيقتين، ثم قم بالتحضين لمدة يومين عند 20 °C حتى تصل الحيوانات إلى مرحلة L4. ولتعقيم الحيوانات بعد ذلك، أضف 30 µL من محلول FUDR المخزون بتركيز 0.6 mM إلى كل بئر.تؤدي هذه الخطوة إلى جعل الحجم النهائي في كل بئر 150 microliters وتخفض التركيز النهائي لـ OP 50 من ستة mg/mL إلى خمسة mg/mL. قم بإغلاق الطبق باستخدام أشرطة الإغلاق ورجه لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق على هزاز أطباق الميكروترون. إذا تمت إضافة OP 50 في الساعة 2:30 في اليوم (ناقص 2)، فمن المهم إضافة FUDR قبل الظهر، ثم أعد الأطباق إلى الحضانة عند 20 °C بحلول الساعة 9:00 صباحاً في اليوم التالي.يجب أن تكون معظم الحيوانات في مرحلة البلوغ وتحتوي على عدة بيضات. يتم إضافة العقاقير المراد اختبار تأثيرها على طول العمر بالتركيز المطلوب. وفي حال إذابة العقاقير في DMSO، يجب ألا تتجاوز التركيزات النهائية لـ DMSO نسبة 0.6%، حيث أن تركيزات DMSO الأعلى من 0.6% تؤدي إلى تقصير عمر الـ elgan بعد إضافة العقار.أغلق الأطباق باستخدام شريط لاصق ورجها لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق على جهاز رج الأطباق ذات المعايرة الدقيقة (microtiter plate shaker)، ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة عند درجة حرارة 20 درجة Celsius. قد تؤدي إضافة العقاقير في بعض الأحيان إلى موت عدد قليل من الحيوانات في كل طبق، خاصة عند استخدام مذيب غير الماء.استخدم مجهراً مقلوباً للتحقق من وجود حيوانات ميتة. وبوجه عام، يجب أن يكون عدد الحيوانات الميتة أقل من 10 حيوانات لكل لوحة 96 بئراً. أعد اللوحات إلى الحاضنة عند درجة حرارة 20 degrees Celsius لمدة يومين للسماح للأكسجين النقي بالدخول إلى المزرعة. قم بإزالة سدادة الإغلاق.انتظر لمدة دقيقة واحدة ثم أعد إغلاق الطبق. قم برج الطبق لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق باستخدام هزاز أطباق دقيق (microplate shaker)، وكرر هذه العملية مرة واحدة كل أسبوع في اليوم الخامس من عمر البالغين، ثم أضف 5 µL من محلول OP 50 بتركيز 100 mg/mL الذي تم تحضيره مسبقاً إلى كل بئر من الآبار الـ 96 لمنع المجاعة. يتم تقييم عمر الديدان من خلال حركتها ثلاث مرات أسبوعياً منذ بداية التجربة وحتى موتها.استخدم مجهراً مقلوباً بعدسة شيئية بقوة 2x أو 2.5x لفحص الديدان في أطباق ذات 96 بئراً في اليوم صفر عند بداية التجربة. قم بعدها للعدد الإجمالي للديدان في كل بئر.آبار الاستشعار التي تحتوي على أكثر من 18 حيوانًا من التحليل، حيث لن تتوفر لهذه الحيوانات في هذه الآبار كمية كافية من OP 50، وستظهر عليها آثار التقييد الغذائي في كل جلسة عد. قم بتسجيل التاريخ وعدد الحيوانات التي تتحرك كحيوانات حية. تكون الحركة في السائل أسهل بكثير منها على الأوساط الصلبة، ويمكن تحفيزها بواسطة الأضواء القوية.قد يساعد استخدام تكبير أعلى في رصد الحركات الدقيقة جداً مثل تلك التي تحدث عند طرف البلعوم. وغالباً ما تكون هذه الحركات الدقيقة هي الحركة الوحيدة التي تُلاحظ في الحيوانات المسنة جداً. أعِد الأطباق إلى الحاضنة عند درجة حرارة 20 degrees Celsius.كرر جلسات العد كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الحيوانات. هذا نموذج لورقة Excel لتسجيل بيانات فترة الحياة لكل بئر؛ حيث يتم تدوين إحداثياته في الطبق، وسلالة الحيوان، وتركيز الدواء المستخدم، كما يتم تسجيل العدد الإجمالي للحيوانات الحية في اليوم صفر عند بداية التجربة.سجّل التاريخ بالإضافة إلى عدد الحيوانات الحية والميتة ثلاث مرات في الأسبوع لمتابعة بقاء المجموعات المختلفة في كل بئر. يوضح هذا الشكل نتائج منحنيات طول العمر لـ sea elegance التي تم تسجيلها عند 20 °C و 25 °C. يعيد اختبار طول العمر القائم على الأطباق ذات الآبار الدقيقة إنتاج التغيرات المعتمدة على درجة الحرارة في طول العمر بدقة.وبالمثل، كما هو موضح هنا، يعيد مقايسة طبق المعايرة الدقيقة (microtiter plate assay) إنتاج التغيرات في طول العمر لدى الطفرات التي أفيد بأن أعمارها تختلف عن حيوانات النوع البري N two. يوضح هذا الشكل كيف تؤثر الجرعات المتزايدة من الميرتازابين (mirtazapine) على متوسط طول العمر في sea elegance. وتعتبر البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة مقايسة طبق المعايرة الدقيقة كمية بما يكفي لتحديد علاقات الاستجابة للجرعة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لفحص مكتبات كيميائية كبيرة للبحث عن جزيئات تعمل على إطالة عمر see elegance.شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة من الديدان الخيطية حافظت على وسائل الإعلام متينة مع الأشعة فوق البنفسجية قتل الغذائي الجرثومي.

قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

يصف هذا الفيديو طريقة تقليدية قائمة على الألواح لقياس عمر C. ايليجانس. يقيس بروتوكول المثال عمر الديدان المعالجة بالحمض النووي الريبي.

تحليل العمر: قياس C. ايليجانس طول العمر

بيضة في ودودة (EIW) الاختبار هو طريقة مفيدة لتحديد وضع البيض السلوك. يمكن إجراء تعديلات في وضع البيض يكون ردا السلوكية للكائن...

قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

C. elegans هو كائن حي نموذجي جذاب لدراسة مسارات نقل الإشارة المشاركة في مقاومة الإجهاد التأكسدي. نقدم هنا بروتوكولا لقياس مقاومة الإجهاد التأكسدي ل C. ايليجانس في الطور السائل ، باستخدام العديد من العوامل المؤكسدة في 96 لوحة بئر.

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

ويرد وصف بروتوكول أساسية لتقييم سمية المواد الكيميائية في حيوان نموذج، ايليجانس كاينورهابديتيس،. الطريقة مريحة ومفيدة لتطوير المستحضرات الصيدلانية، وكذلك فيما يتعلق بتقييم المخاطر من الملوثات البيئية المختلفة.

قياس "تأثير المواد الكيميائية" على النمو والتكاثر من ايليجانس كاينورهابديتيس

هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط لسرعة إنتاج مئات من وسائط النمو السلكية أجار، لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة من ايليجانس كاينورهابديتيس لكل بئر. هذه الثقافات مفيدة لفحص الكائنات كله المظهرية. نحن نركز هنا على استخدام هذه الثقافات إلى شاشة المواد الكيميائية للآثار المؤيدة طول العمر.

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

هنا يصف لنا طريقة "مجموعة النسخ المتماثلة"، ونهج لقياس كمي C. ايليجانس عمر/البقاء وهيلثسبان بطريقة الفائق وقوية، مما يتيح فحص ظروف كثيرة دون التضحية بجودة البيانات. هذا البروتوكول تفاصيل الاستراتيجية ويوفر أداة حاسوبية لتحليل البيانات "مجموعة النسخ المتماثلة".

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

يصف البروتوكول التالي تطوير وتحسين سير عمل عالي الإنتاجية لزراعة الديدان والتصوير الفلوري ومعالجة الصور الآلية لتحديد كمام البولي جلوتامين كميا كتقييم للتغيرات في البروتيوستاسيس.

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans بمثابة نظام نموذجي ممتاز مع أساليب قوية ومنخفضة التكلفة لمسح الصحة والعمر والمرونة في مواجهة الإجهاد.

طرق المسح منخفضة التكلفة لقياس العمر الافتراضي والمدى الصحي في Caenorhabditis elegans

هنا ، نقدم طريقة عامة لتحديد الصلاحية الجنينية والعدد الإجمالي للأجنة المنتجة (الحضنة) باستخدام الكائن الحي النموذجي C. elegans.

قياس الصلاحية الجنينية وحجم الحضنة في Caenorhabditis elegans

يصف هذا البروتوكول مقايسة لتحديد معدل تغذية Caenorhabditis elegans بناء على قياس إزالة البكتيريا في الثقافة السائلة.

قياس كمية الطعام في Caenorhabditis elegans عن طريق قياس التخليص البكتيري

تعلم قياس عمر Caenorhabditis elegans في أطباق 96 بئر باستخدام تقنية المزامنة العمرية والفحص عالي الإنتاجية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد المركبات المؤثرة على طول العمر.

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

استكشف المزيد من الفيديوهات