مغلق الثقافة خلية بروتوكول النظام باستخدام السفن HYPERStack مع تقنية الغاز مادة نافذ
November 29th, 2010
مقدمة في البروتوكول ، والتكنولوجيا ، والتعامل مع السفن HYPERStack كورنينج والاكسسوارات المستخدمة لزراعة الخلايا عالية الغلة ملتصقة. فإن بروتوكول تظهر كيفية استخدام السفن نظام مغلق لحصاد الخلية الحالية على زيادة المنتجات المسطحة مكدسة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات الاستخدام الصحيح للنظام المغلق لأوعية مكدس Corning Hypers. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلقيح الأوعية أولا وتعبئتها بالوسائط عبر طريقة تغذية الجاذبية. بعد ذلك ، يتم عزل تعليق الخلية في كل طبقة من الطبقات ويتم تحضين الخلايا.
بعد الحضانة ، تتم إزالة الوسائط المستهلكة. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي حصاد الخلايا من أوعية المكدس المفرطة. في النهاية ، يتم الحصول على نتائج انتشار الغاز لإظهار قدرة الخلايا على الوصول إلى الأكسجين أثناء النمو للطلاقة المشتركة عند استخدام نظام المكدس المغلق للهيفرس.
الميزة الرئيسية لوعاء المكدس المفرط مع مادة نفاذة للغاز هي أنه يوفر مساحة سطح متزايدة لنمو الخلايا. من خلال التخلص من مساحة الرأس في السفينة ، سيظهر زميلي p pardo الآن بروتوكول نظام مغلق لاستخدام وعاء المكدس المفرط. يتكون وعاء المكدس المفرط من إحصائيات ، وهي حجرة زراعة الخلية الفردية التي تتكون من اللوحة العلوية والفيلم المنفذ للغاز.
يتم زراعة الخلايا داخل هذه المقصورة. يربط المشعب السائل كل طبقة من طبقات ette معا داخل وحدة. ترتبط الوحدات بأنابيب لتشكيل أوعية في مضاعفات 12 طبقة.
يسمح المشعب للمستخدم بإجراء تلاعب سائل واحد بالوعاء بأكمله. يربط مشعب الهواء أيضا طبقات الإحصائيات معا ، ولكنه يستخدم لإزاحة الهواء من الوعاء عند حدوث إضافات سائلة ويحتوي على خط تعبئة للاستخدام أثناء الملء بين كل منها. طبقة الإحصاء عبارة عن مساحة في الهواء الطلق تسمى مساحة القصبة الهوائية ، مما يسمح بحدوث تبادل الغاز من خلال الفيلم المنفذ للغاز في كل طبقة.
يتمتوصيل أنبوب مناولة السوائل بمشعب السائل وهو مكون قابل للتخصيص يستخدم لإجراء جميع عمليات معالجة سوائل النظام المغلق لإطلاق الهواء الزائد مع الحفاظ على العقم. يتم استخدام أنابيب التهوية. يتم توصيل أنبوب التهوية بمشعب الهواء ويحتوي على مرشح هواء.
يتم توصيل أنبوب المطاردة والفلتر بأنبوب مناولة السوائل ، والذي يستخدم لتفريغ السائل من أنبوب مناولة السوائل بعد ملء الوعاء. يستخدم أيضا في هذا البروتوكول مناور Corning Stack أو CSM ، وهو جهاز مناولة للمساعدة في وضع الأوعية في المواضع الصحيحة أثناء الاستخدام. في هذا العرض التوضيحي ، تم عرض ثقافة خلايا النظام المغلق لوعاء نفاذي للغاز مكون من 36 طبقة.
ومعذلك ، باستخدام CSM ، يمكن العثور على تفاصيل لتنفيذ هذا الإجراء على وعاء مكون من 12 طبقة باستخدام إسفين تعبئة في البروتوكول المكتوب المصاحب. ابدأ بتحضير 3.9 لتر من الوسائط المعبأة في أكياس قبل تلقيح أنبوب الوسائط. بلل كيس السيروم في كيس الوسائط واخلطه جيدا للحصول على تركيز المصل المطلوب.
قم بتثبيت ما يقرب من 300 مل من الوسائط في الكيس باستخدام مشابك أكياس كبيرة. سيضمن ذلك استخدام جميع الخلايا الملقحة أثناء الملء ، وعدم بقاء أي منها في كيس الوسائط. ضع الوسائط على حامل كيس لتلقيح الوسائط.
املأ حقنة متصلة بالأنبوب بتعليق الخلية. قم بتوصيل المحقنة التي تحتوي على تعليق الخلية بكيس الوسائط عن طريق لحام الأنبوب. ثلاثة أنابيب أكثر من 16 بوصة من المحقنة إلى الحقيبة.
قمبحقن تعليق الخلية في كيس الوسائط واخلطه جيدا. يمكن توصيل كيس الوسائط الملقح بأنابيب مناولة السوائل التي يزيد طولها عن ثمانية بوصات في السفينة عن طريق لحام الأنبوب أو باستخدام موصلات متعددة الأغراض. اليوم سوف نستخدم لحام الأنبوب.
أغلق المشابك الموجودة على مناولة السوائل وطارد أنابيب الوعاء. ضع الوعاء المكون من 36 طبقة في CSM في وضع التحميل. قم بربط أنبوب مرشح التهوية في المشبك المثبت على CSM.
شد الغطاء وحرك CSM إلى وضع التعبئة لوضع فلتر الهواء في أعلى موضع لمنع التبلل أثناء عملية التعبئة. تسمح زاوية 10 درجات أيضا بتوازن السائل مع الطبقات أثناء ملء الهواء الصافي من خط التعبئة. عن طريق وضع كيس الوسائط على نفس مستوى السفينة مع إبقاء مشبك أنبوب المطاردة مغلقا.
افتح مشبك أنبوب مناولة السوائل ومشبك كيس الوسائط للسماح للسائل بدخول الوعاء. باستخدام حامل الكيس ، ارفع كيس الوسائط للمساعدة في تدفق تعليق الخلية إلى الوعاء. املأ الوعاء حتى تدخل جميع الوسائط الملقحة إلى الوعاء.
يجب أن يظل الجزء العلوي من كيس الوسائط يحتوي على 300 مل من الوسائط. قم بإزالة المشبك من كيس الوسائط لمواصلة ملء الوعاء عندما يقترب السائل من مشعب الهواء العلوي. قم بإبطاء معدل التعبئة عن طريق خفض كيس الوسائط لمنع الإفراط في التعبئة.
قم بإحضار مستوى السائل ببطء إلى خط التعبئة وقم بتجميع أنبوب مناولة السائل. أحضر السفينة في CSM إلى وضع العزل مع وضع كلتا المجموعتين من المشعبات في أعلى موضع. اخفض كيس الوسائط إلى ما دون ارتفاع الوعاء.
مع تثبيت مرشح المطاردة في وضع رأسي ، افتح مشبك أنبوب المطاردة. سيؤدي ذلك إلى إفراغ أو مطاردة الوسائط الموجودة في أنبوب مناولة السوائل مرة أخرى في كيس الوسائط. بمجرد أن يصبح الأنبوب فارغا ، أغلق المشبك الموجود على أنبوب كيس الوسائط.
الحفاظ على مرشح أنبوب المطاردة في وضع رأسي. افتح المشبك الموجود على أنبوب مناولة السوائل في الوعاء للسماح لأي سائل متبقي بالدخول والتوازن في الوعاء. انتظر من دقيقة إلى دقيقتين حتى يحدث ذلك.
بعد ذلك ، أدر الوعاء في CSM بحيث تكون المشعبات على اليسار. اخفض السفينة إلى موضع التحميل على CSM. أغلق المشابك الموجودة على كل من المطاردة وأنابيب مناولة السوائل.
يمكن الآن إزالة كيس الوسائط من الوعاء ، أو قد يظل مرفقا للاستخدام لاحقا في إجراء الحصاد. لتخزين كيس الوسائط المرفق ، قم بلف كيس الوسائط وضعه تحت أشرطة التثبيت في درج التخزين الخاص بالوعاء. أخيرا ، انقل الوعاء إلى الحاضنة عند حمل الوعاء ، احرص على منع أي سائل من دخول مرشح تنفيس الهواء.
يتم تحقيق ذلك عن طريق قلب الطرف المشعب لأعلى قليلا. لبدء أنبوب إجراء الحصاد ، قم بلحام محلول الارتباط بالخلايا وإخماد الأكياس معا لتشكيل مجموعة كيس الحصاد ، تأكد من إغلاق جميع مشابك الأنابيب. قم بإزالة الوعاء من الحاضنة وضعه في CSM في وضع التحميل.
حرر حقيبة الوسائط من تحت أشرطة التثبيت وعلقها على الحقيبة. قف بعد ذلك ، وشد الغطاء لتأمين الوعاء. قم بتوصيل أنبوب التهوية في مشبك التثبيت وانقل CSM إلى موضع التعبئة.
تأكد من أن كيس الوسائط الموجود على حامل الحقيبة معلق أقل من الوعاء. افتح المشبك الموجود على أنبوب كيس الوسائط وأنبوب مناولة السوائل في الوعاء للسماح للوسائط بالتدفق إلى الكيس المرفق. بمجرد أن تصبح السفينة فارغة بحوالي ثلاثة أرباع ، قم بتغيير إعدادات CSM إلى الموضع الفارغ النهائي.
عندما يكون الوعاء وأنابيب مناولة السوائل فارغين ، ارفع الأنبوب لمطاردة الوسائط عبر المشبك الموجود على أنبوب كيس الوسائط المستهلكة. ثم أغلق كل من المشبك الموجود على أنبوب مناولة السوائل والمشبك الموجود على أنبوب كيس الوسائط المستهلك. استبدل كيس الوسائط المستهلكة بمجموعة كيس الحصاد عن طريق لحام الأنبوب.
ارفع ارتفاع مجموعة كيس فصل الخلية فوق ارتفاع الوعاء باستخدام حامل الكيس. ضع CSM في موضع التعبئة. افتح مشبك أنبوب محلول تفكك الخلية ومشبك تجميع كيس الحصاد وانقل المحلول إلى الوعاء.
عند اكتمال النقل ، أغلق المشابك الموجودة على أنبوب مناولة السوائل وأنبوب محلول تفكك الخلية. بعد ذلك ، قم بإحضار CSM إلى موضع التحميل مع إبقاء ذراع تحديد المواقع الأفقي مفتوحا. قم بهز الوعاء برفق من جانب إلى آخر باستخدام العجلة ، وتوزيع المحلول على طبقات الخلية.
قد يتم إرجاع الوعاء أحيانا إلى موضع التعبئة أثناء التأرجح للحفاظ على التوزيع المتساوي للمحلول. بمجرد توزيع المحلول بشكل مناسب، حرر الرافعة الموجودة على CSM لتأمين موضع التعبئة. اترك الوعاء في هذا الوضع خلال وقت التفكك المطلوب للخلايا.
استخدم التعكر كدليل لتحديد انفصال الخلايا. بمجرد فصله، انقل CSM إلى موضع التحميل. افتح مشبك كيس التبريد ومشبك أنبوب مناولة السوائل للسماح لوسائط التبريد بدخول الوعاء.
أغلق المشبك الموجود على أنبوب مناولة السائل. بمجرد اكتمال النقل ، أعد CSM إلى موضع التحميل وأمسك ذراع تحديد المواقع الأفقي لهز السفينة من جانب إلى آخر. باستخدام حامل الكيس ، قم بخفض موضع مجموعة كيس الحصاد أسفل مستوى السفينة.
اضبط CSM على الموضع الفارغ. افتح أنبوب مناولة السوائل للوعاء المشبك وانقل محلول الخلية مرة أخرى إلى كيس التبريد. أعد CSM إلى موضع التحميل وافصل مجموعة كيس الحصاد عن الوعاء باستخدام مانع تسرب الأنبوب.
الآن حل الخلية جاهز للمعالجة في أنظمة نمو الخلايا التقليدية. مع Headspace ، يتم استنفاد الأكسجين الموجود في الوسائط بمعدل 50٪ على مدار ثلاثة أيام. في الثقافة ، يوضح هذا الشكل الانخفاض في المليغرام لكل لتر من الأكسجين على مستوى الخلايا بمرور الوقت في نفس نظام النمو ، ويكون تدرج الأكسجين من خلال ارتفاع الوسائط البالغ ثلاثة ملليمترات أكبر بنسبة 50٪ تقريبا عند الوسائط إلى تقاطع Headspace مما هو عليه في طبقة الخلية.
يتم عرض النسبة المئوية للأكسجين في مساحة القصبة الهوائية لكومة الهايبس أثناء نمو الخلية. يوضح الشكل أنه على مدار 96 ساعة ، تظل نسبة الأكسجين بين الطبقات التي تزود كل قاع فيلم قابل للنفاذ بالغاز ثابتة. هذا يدل على قدرة الخلايا على الوصول إلى الأكسجين أثناء النمو إلى الطلاقة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ملء وحصاد وعاء مكدس Corning Hypers في النظام المغلق.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة أوعية Corning HYPERStack وملحقاتها، المصممة لزراعة الخلايا اللاصقة ذات العائد العالي. يوضح البروتوكول استخدام النظام المغلق لهذه الأوعية لتعزيز كفاءة حصاد الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- تكنولوجيا زراعة الخلايا
- حصاد الخلايا اللاصقة
- بروتوكولات النظام المغلق
الخلفية
- توفر أوعية Corning HYPERStack مساحة سطح متزايدة لنمو الخلايا.
- تسمح المواد قابلة للتنفس بالغاز بتبادل فعال للغازات أثناء زراعة الخلايا.
- يقلّل تصميم النظام المغلق من مخاطر التلوث.
- يسهل استخدام مشعب سائل عمليات التلاعب بالسوائل.
غرض الدراسة
- لتوضيح الاستخدام الصحيح لأوعية Corning HYPERStack.
- لعرض كيفية تلقيح الأوعية وملئها بشكل فعال.
- لتحديد خطوات حصاد الخلايا من الأوعية.
الطرق المستخدمة
- تلقيح الوسط بمعلِّقة الخلايا.
- طريقة التغذية بالجاذبيّة لملء الأوعية.
- استخدام معالج Corning Stack لتعامل مع الأوعية.
- لحام الأنبوب لتوصيل الوسط وتعامل مع الأنابيب.
النتائج الرئيسية
- ملء الأوعية HYPERStack وتلقيحها بنجاح.
- تم ملاحظة تبادل فعال للغازات أثناء نمو الخلايا.
- تم الكشف عن كفاءة حصاد الخلايا من خلال النظام المغلق.
- يسمح البروتوكول بالتعامل والمحافظة بسهولة على سلامة الوسط.
الاستنتاجات
- تعد أوعية Corning HYPERStack فعالة لزراعة الخلايا ذات العائد العالي.
- تحسن بروتوكولات النظام المغلق من كفاءة حصاد الخلايا بشكل كبير.
- تعتبر المواد قابلة للتنفس بالغاز مفيدة لنمو الخلايا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Closed system adherent cell culture using gas permeable vessels addresses scalability challenges in biologics manufacturing by increasing yield per footprint while maintaining sterility. This approach supports process intensification for cell therapy and vaccine production where closed systems are critical for regulatory compliance. The technology enables higher cell densities without expanding facility footprint, improving capital efficiency in upstream bioprocessing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables scalable adherent cell expansion for target validation assays requiring high cell numbers.
- Operational Value: Reduces media and reagent consumption per cell yield through minimized headspace and efficient gas exchange.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible adherent cell layers for consistent assay readouts in drug screening campaigns.
- Operational Value: Standardizes cell seeding density across layers via liquid manifold distribution, improving assay-to-assay variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports generation of clinical-grade adherent cells for preclinical efficacy and safety testing under closed conditions.
- Operational Value: Facilitates seamless transition from research-scale to GMP-compatible processes using identical vessel architecture.
Pipeline & Workflow Integration
The HYPERStack system integrates into adherent cell production workflows from expansion through harvest, supporting continuous processing in vaccine and therapeutic protein pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing in adherent cell models at scales relevant to target engagement studies.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cell outputs for assay standardization in hit-to-lead progression.
- Analytics: Supports oxygen and metabolite monitoring via gas permeable film to assess culture health and metabolic activity.
- Translational Research: Maintains phenotypic fidelity during scale-up, critical for translational consistency in cell-based therapies.
- Enterprise Reuse: Modular design allows reuse across multiple cell lines and processes, reducing capital expenditure per campaign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive culture performance through stable gas exchange and reduced gradient effects compared to traditional stacked plates.
- Operational Value: Closed fluid paths minimize operator intervention, lowering contamination risk and labor intensity.
- Strategic Value: Higher yield per run improves batch consistency and reduces cost of goods in biologics manufacturing.
- Portfolio Impact: Enables risk-advanced allocation of adherent cell resources across multiple projects from a single platform.
Implementation Considerations
- Training in aseptic tubing welding and manifold handling for closed system integrity.
- Integration with standard incubators and biosafety cabinets using Corning Stack Manipulator for vessel positioning.
- Validation of gas diffusion rates to match metabolic demands of specific adherent cell lines.
- Adaptation of harvesting protocols (enzymatic or mechanical) to vessel geometry and layer accessibility.
- Monitoring of liquid handling tubing pressure and flow rates to prevent shear stress during scale-up.
