مغلق الثقافة خلية بروتوكول النظام باستخدام السفن HYPERStack مع تقنية الغاز مادة نافذ

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الاستخدام الصحيح للنظام المغلق لأوعية Corning Hypers stack. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تلقيح الأوعية وملئها بالوسط الغذائي عبر طريقة التغذية بالجاذبية. بعد ذلك، يتم عزل معلق الخلايا في كل طبقة من الطبقات ثم تُحضن الخلايا.

بعد انتهاء فترة التحضين، يتم إزالة الوسط المستهلك. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في حصاد الخلايا من أوعية hypers stack. وفي النهاية، يتم الحصول على نتائج انتشار الغاز لإظهار قدرة الخلايا على الوصول إلى الأكسجين أثناء النمو وصولاً إلى حالة التلاقي (confluency) عند استخدام النظام المغلق hypers stack.

تتمثل الميزة الرئيسية لوحدة hypers stack ذات المادة المنفذة للغاز في توفير مساحة سطح أكبر لنمو الخلايا. ومن خلال التخلص من الحيز الرأسي في الوعاء، سيقوم زميلي p pardo الآن بشرح بروتوكول للنظام المغلق لاستخدام وعاء hypers stack. يتكون وعاء hypers stack من stat، وهو مقصورة زراعة الخلايا الفردية المكونة من اللوح العلوي والغشاء المنفذ للغاز.

تُستنبت الخلايا داخل هذه الحجرة. ويربط المجمع السائل كل طبقة من طبقات ette معاً داخل الوحدة. وتتصل الوحدات بأنابيب لتشكيل أوعية تتكون من مضاعفات لـ 12 طبقة.

يتيح الموزع للمستخدم إجراء عملية معالجة سائلة واحدة للوعاء بأكمله. كما يربط موزع الهواء طبقات الحالة الساكنة ببعضها البعض، ولكنه يُستخدم لإزاحة الهواء من الوعاء عند إضافة السوائل، ويحتوي على خط تعبئة للاستخدام أثناء التعبئة بين كل طبقة وأخرى. طبقة الحالة الساكنة هي مساحة هوائية مفتوحة تسمى الحيز الرغامي، مما يسمح بحدوث التبادل الغازي من خلال الغشاء النفاذ للغازات الموجود في كل طبقة.

يتم توصيل أنابيب مناولة السوائل بمجمع السوائل، وهي مكون قابلة للتخصيص تُستخدم لإجراء جميع عمليات مناولة السوائل في النظام المغلق لتفريغ الهواء الزائد مع الحفاظ على التعقيم. كما تُستخدم أنابيب التهوية، حيث يتم توصيل أنابيب التهوية بمجمع الهواء وتحتوي على مرشح هواء.

يتصل بأنبوب مناولة السوائل أنبوب طرد ومرشح، ويتم استخدامهما لإخلاء السائل من أنبوب مناولة السوائل بعد ملء الوعاء. كما يُستخدم في هذا البروتوكول جهاز مناولة Corning Stack أو CSM، وهو جهاز مناولة يساعد في وضع الأوعية في المواضع الصحيحة أثناء الاستخدام. وفي هذا العرض التوضيحي، يتم استعراض زراعة الخلايا في نظام مغلق لوعاء مكون من 36 طبقة ونفاذ للغازات.

ومع ذلك، عند استخدام CSM، يمكن العثور على تفاصيل تنفيذ هذا الإجراء في وعاء مكون من 12 طبقة باستخدام إسفين ملء في البروتوكول المكتوب المرفق. ابدأ بتحضير 3.9 لتر من الوسط الغذائي المعبأ في أكياس قبل تلقيح أنبوبة الوسط الغذائي. قم بتوصيل كيس المصل بكيس الوسط الغذائي واخلطهما جيداً للوصول إلى تركيز المصل المطلوب.

قم بإغلاق حوالي 300 ملليلتر من الوسط الغذائي في الكيس باستخدام مشابك أكياس كبيرة. سيضمن ذلك استخدام جميع الخلايا الملقحة أثناء عملية التعبئة، وعدم بقاء أي منها في كيس الوسط الغذائي. ضع الوسط الغذائي على حامل أكياس لتلقيح الوسط الغذائي.

املأ محقنة متصلة بأنبوب بمُعلق خلوي. قم بتوصيل المحقنة التي تحتوي على المُعلق الخلوي بكيس الوسط عن طريق لحام الأنابيب. استخدم أنبوباً بطول 3/16 بوصة من المحقنة إلى الكيس.

احقن معلق الخلايا في كيس الوسط وامزجه جيداً. يمكن توصيل كيس الوسط الملقح بأنبوب مناولة السوائل الخاص بالوعاء، والذي يبلغ قطره ثلاثة أثمان البوصة، عن طريق لحام الأنابيب أو باستخدام موصلات متعددة الأغراض. سنستخدم اليوم طريقة لحام الأنابيب.

أغلق المشابك الموجودة على أنابيب مناولة السوائل وأنابيب الطرد في الوعاء. ضع الوعاء المكون من 36 طبقة في جهاز A CSM في وضع التحميل. قم بتعليق أنبوب مرشح التهوية في مشبك التثبيت الموجود في جهاز CSM.

أحكم إغلاق الغطاء وانقل وحدة CSM إلى وضعية التعبئة لوضع مرشح الهواء في أعلى موضع لمنع ترطيبه أثناء عملية التعبئة. كما تسمح الزاوية البالغة 10 درجات بموازنة السائل مع الطبقات أثناء التعبئة لطرد الهواء من خط التعبئة. وذلك عبر وضع كيس الوسط الغذائي في نفس مستوى الوعاء مع إبقاء مشبك أنبوب الملاحقة مغلقاً.

افتح مشبك أنبوب مناولة السوائل ومشبك كيس الوسط الغذائي للسماح للسائل بالدخول إلى الوعاء. وباستخدام حامل الكيس، ارفع كيس الوسط الغذائي للمساعدة في تدفق معلق الخلايا إلى الوعاء. املأ الوعاء حتى يدخل كل الوسط الغذائي الملقح إليه.

يجب أن يظل الجزء العلوي من كيس الوسط يحتوي على 300 milliliters من الوسط. قم بإزالة المشبك من كيس الوسط لمواصلة ملء الوعاء مع اقتراب السائل من مجمع الهواء العلوي. قم بتقليل معدل الملء عن طريق خفض كيس الوسط لمنع الملء الزائد.

ارفع مستوى السائل ببطء حتى يصل إلى خط التعبئة ثم أغلق أنابيب مناولة السوائل. حرك الوعاء الموجود في CSM إلى وضع العزل مع وضع كلا مجموعتي المجمعات في أعلى موضع. اخفض كيس الوسط الغذائي إلى مستوى أدنى من ارتفاع الوعاء.

مع إبقاء مرشح الطرد في وضع عمودي، افتح مشبك أنبوب الطرد. سيؤدي ذلك إلى تفريغ أو طرد الوسط الموجود في أنبوب مناولة السوائل وإعادته إلى كيس الوسط. وبمجرد إفراغ الأنابيب، أغلق المشبك الموجود على أنبوب كيس الوسط.

حافظ على فلتر أنبوب المطاردة في وضع عمودي. افتح المشبك الموجود على أنبوب مناولة السوائل للوعاء للسماح لأي سائل متبقٍ بالدخول والاتزان داخل الوعاء. انتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يحدث ذلك.

بعد ذلك، قم بتدوير الوعاء في وحدة CSM بحيث تكون المجمعات على اليسار. اخفض الوعاء إلى موضع التحميل في وحدة CSM. أغلق المشابك الموجودة على كل من أنابيب التتبع وأنابيب مناولة السوائل.

يمكن الآن إزالة كيس الوسط من الوعاء، أو يمكن تركه متصلاً لاستخدامه لاحقاً في إجراءات الحصاد. ولتخزين كيس الوسط المتصل، قم بلف كيس الوسط ووضعه تحت أحزمة التثبيت في صينية التخزين الخاصة بالوعاء. وأخيراً، انقل الوعاء إلى الحاضنة. وعند حمل الوعاء، احرص على منع دخول أي سائل إلى مرشح فتحة التهوية.

يتم تحقيق ذلك عن طريق إمالة طرف الموزع قليلاً إلى الأعلى. لبدء إجراء الحصاد، قم بلحم أنبوب محلول ربط الخلايا وأكياس الإخماد معاً لتكوين مجموعة كيس الحصاد، مع التأكد من إغلاق جميع مشابك الأنابيب. أخرج الوعاء من الحاضنة وضعه في نظام التحكم في المزارع (CSM) في وضع التحميل.

قم بتحرير كيس الوسط الغذائي من تحت أحزمة التثبيت وعلقه على الحامل. قف بجانبه، ثم أحكم غلق الغطاء لتأمين الوعاء. قم بتعليق أنبوب التهوية في مشبك التثبيت وحرك وحدة CSM إلى وضعية الملء.

تأكد من أن كيس الوسط الغذائي على حامل الأكياس يتدلى في مستوى أدنى من الوعاء. افتح المشبك الموجود في أنبوب كيس الوسط الغذائي وأنبوب مناولة السوائل الخاص بالوعاء للسماح للوسط بالتدفق إلى الكيس المتصل. بمجرد أن يفرغ الوعاء بنسبة ثلاثة أرباع تقريباً، قم بتغيير إعدادات CSM إلى وضع الإفراغ النهائي.

عندما تصبح الوعاء وأنابيب مناولة السوائل فارغة، ارفع الأنابيب لدفع الوسط الغذائي متجاوزاً المشبك الموجود في أنبوب كيس الوسط المستنفد. بعد ذلك، أغلق كل من المشبك الموجود في أنبوب مناولة السوائل والمشبك الموجود في أنبوب كيس الوسط المستنفد. استبدل كيس الوسط المستنفد بمجموعة كيس الحصاد عن طريق لحام الأنابيب.

ارفع مجموعة كيس تفكيك الخلايا فوق مستوى الوعاء باستخدام حامل الكيس. ضع نظام إدارة الخلايا (CSM) في وضع التعبئة. افتح مشبك أنبوب محلول تفكيك الخلايا ومشبك مجموعة كيس الحصاد، ثم انقل المحلول إلى الوعاء.

عند اكتمال عملية النقل، أغلق المشابك الموجودة على أنابيب مناولة السوائل وأنابيب محلول تفكيك الخلايا. بعد ذلك، انقل وحدة CSM إلى وضع التحميل مع إبقاء رافعة تحديد الموضع الأفقي مفتوحة. قم بهز الوعاء بلطف من جانب إلى آخر باستخدام العجلة، لتوزيع المحلول فوق طبقات الخلايا.

يمكن إعادة الوعاء أحيانًا إلى وضع التعبئة أثناء الهز للحفاظ على التوزيع المتساوي للمحلول. وبمجرد توزيع المحلول بشكل كافٍ، حرر الرافعة في جهاز CSM للتثبيت في وضع التعبئة. اترك الوعاء في هذا الوضع طوال فترة التفكك المطلوبة للخلايا.

استخدم العكارة كدليل لتحديد انفصال الخلايا. وبمجرد انفصالها، انقل الـ CSM إلى موضع التحميل. افتح مشبك كيس الإخماد ومشبك أنبوب مناولة السوائل للسماح لوسط الإخماد بالدخول إلى الوعاء.

أغلق المشبك الموجود على أنبوب مناولة السوائل. بمجرد اكتمال عملية النقل، أعد CSM إلى وضع التحميل وامسك بذراع تحديد الموضع الأفقي لهز الوعاء من جانب إلى آخر. وباستخدام حامل الكيس، اخفض وضع مجموعة كيس الحصاد إلى مستوى أدنى من مستوى الوعاء.

اضبط وحدة إدارة الخلايا (CSM) على الوضع الفارغ. افتح مشبك أنبوب مناولة السوائل في الوعاء وانقل محلول الخلايا مرة أخرى إلى حقيبة الإخماد. أعد وحدة إدارة الخلايا (CSM) إلى وضع التحميل وافصل مجموعة حقيبة الحصاد عن الوعاء باستخدام جهاز ختم الأنابيب.

أصبح الآن محلول الخلايا جاهزاً للمعالجة في أنظمة نمو الخلايا التقليدية. باستخدام تقنية الفراغ الرأسي (Headspace)، يُستنزف الأكسجين في الوسط بمعدل 50% على مدار ثلاثة أيام. وفي المزرعة، يوضح هذا الشكل انخفاض ملجم/لتر من الأكسجين على مستوى الخلايا بمرور الوقت في نظام النمو نفسه، حيث يكون تدرج الأكسجين عبر ارتفاع وسط يبلغ 3 mm أكبر بنسبة 50% تقريباً عند نقطة التقاء الوسط بالفراغ الرأسي مما هو عليه عند طبقة الخلايا.

يظهر في الشكل النسبة المئوية للأكسجين في الحيز الرغامي لمجموعة الـ hypers أثناء نمو الخلايا. ويوضح الشكل أنه على مدار 96 ساعة، تظل النسبة المئوية للأكسجين بين الطبقات، والتي تمد كل قاعدة فيلم نفاذة للغازات، ثابتة. وهذا يثبت قدرة الخلايا على الوصول إلى الأكسجين أثناء النمو حتى الوصول إلى حالة التلاقي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ملء وحصاد وعاء Corning Hypers stack في النظام المغلق.