محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

مرحباً، اسمي جريج ماكليود. يدرس مختبري تنظيم الكالسيوم في النهايات العصبية وتأثير ذلك على النقل العصبي. نقوم بإجراء هذه الدراسات على ذبابة *Drosophila melanogaster*.

تعد ذبابة الفاكهة نموذجاً جذاباً لعلماء الأعصاب بسبب قابليتها للتعديل الوراثي وبساطة جهازها العصبي وسهولة الوصول إليه. وفي هذا الجهاز العصبي، تتوفر مؤشرات فلورية مشفرة وراثياً للكشف عن تغيرات الكالسيوم في النهايات العصبية. ومع ذلك، فإن هذه المؤشرات تتسم بحساسية محدودة تجاه الكالسيوم وغالباً ما تظهر استجابة غير خطية.

تعتبر المؤشرات الاصطناعية أكثر ملاءمة لقياس تغيرات الكالسيوم السريعة المرتبطة بالنشاط العصبي. سنقوم باستعراض تقنية لتحميل مؤشرات الكالسيوم الاصطناعية المقترنة بالديكسترين داخل النهايات العصبية الحية في oph lava. ويساعد الاقتران بالديكسترين في منع احتجاز مؤشرات الكالسيوم داخل العضيات مثل الميتوكوندريا.

يمكن تطبيق تقنية التحميل بالتساوي على اليرقات والأجنة والبالغين. سنقوم بتشريح يرقة في حمام سيجار صغير على شريحة زجاجية. وسيعمل شمع الأسنان الأزرق على دعم سرير التحميل الزجاجي.

خذ يرقات من نوع star lava من جانب قارورة غير مزدحمة. ضع اليرقة في عدة قطرات من محلول Schneider المبرد وثبتها بدبوس عبر الرأس والذيل مع جعل الخط الناصف الظهري في الأعلى. استخدم مقصًا دقيقًا وحادًا لإجراء شق صغير.

إجراء شق صغير بين الـ tra هنا، بحيث يكون كبيراً بما يكفي للسماح للشفرة السفلية للمقص بالاختراق. يتم القص عبر الكيوتيكل على طول الخط الناصفي الظهري بين الـ traia وصولاً إلى الرأس. تُدار اليرقة بمقدار 180 درجة ويُمد الشق وصولاً إلى الذيل.

من المهم عدم السماح للشفرة السفلية باختراق الأحشاء بعمق شديد، بل يجب أن تخترق اليرقة فقط، لأن ذلك سيؤدي إلى تلف العضلات والأعصاب المراد فحصها. ستندفع معظم الأحشاء للأعلى عبر الشق، قم بقص المسار هنا بالقرب من الذيل في مسار واحد، ثم قص القصبات الهوائية الكامنة أسفلها وصولاً إلى الرأس. كرر العملية على الجانب الآخر.

قم بإزالة معظم الأحشاء عن طريق قصها وإخراجها من الحمام. توقف لحظة لوضع المقص جانبًا والتقاط زوج ثانٍ من الملاقط. أمسك بالحافة المقطوعة من القشيرة وثبتها بدبوس نحو أحد الجوانب.

كرر العملية على الجانب الآخر. انتقل أربع قطع باتجاه الرأس لتكرار الإجراء. قم بتشذيب أي أحشاء متبقية في هذه المرحلة، مع التأكد من عدم حدوث أي ضرر للعضلات 7، أو 6، أو 13، أو 12 في أي من القطع.

في حال تعرض أي منها للتلف، قم بتشريح يرقة أخرى، حيث يؤدي هذا التلف حتماً إلى انكماشات جينية تجعل أي تصوير لاحق أمراً إشكالياً. تصبح نصفي كرة الدماغ والعقدة البطنية وأعصاب القطع واضحة الآن في الخطوات التالية. سنقوم بسحب طرف القطع المضغوط في عصب القطعة إلى سرير FOP زجاجي، واستخدام خيط ملء بلاستيكي لوضع مؤشر كالسيوم على الطرف المكشوف من العصب.

ولكن أولاً، سنوضح كيفية تحضير خيط التعبئة وتأثير التعبئة لصنع خيط التعبئة. سيتم تطبيق تقنية السحب على مرحلتين على قطعة صفراء معيبة، حيث تُسخن ببطء على طول نصف طولها حتى يصبح البلاستيك ناعماً وشفافاً. توقف عن التسخين عند هذه النقطة واسحب الطرف للأعلى فوراً لسحبه على شكل خيط رفيع.

يبلغ قطر ذلك حوالي نصف مليمتر. قص الخيط بطول 50 millimeters. الآن ضع الخيط تحت مجهر تشريحي وثبت الطرف المقطوع.

استخدم ظفر الإبهام للضغط على طرف واحد، ثم اسحب الطرف الآخر لسحب خيط دقيق بطول 1 cm. يجب قطع هذا الخيط باستخدام شفرة حلاقة جديدة فوق ورق مناديل لتجنب سحقه، وذلك لضمان جعل الحشوة مُعدة بدقة. ابدأ باستخدام أنبوب شعري رقيق الجدران بدون أي خيط.

اسحبها لتكوين نقطة مستدقة دقيقة باستخدام سحابة أنابيب (pet puller). انقل هذه القطعة المجهزة إلى مجهر تشريحي وقم بخدش الجزء المستدق باستخدام قطعة من ورق الصنفرة. ادفع الطرف البعيد عن مكان الخدش بعيداً عن جهة الخدش بحيث ينكسر الطرف بشكل مستوٍ.

يجب أن يكون القطر الداخلي للكسر أكبر من القطر الخارجي. عند نهاية خيط الملء، استخدم مشعلاً دقيقاً لتقليص الكسر حرارياً داخل الزجاج حتى يصل القطر الداخلي إلى حوالي 12 microns. استخدم موقد بنزن لصقل الطرف الثلم للقطعة.

يمكن تطبيق ضغط سلبي على الطرف غير المدبب من التأثير باستخدام أنبوب "سلتيك" (Celtic tube) محكم الربط متصل بأنبوب بولي لاين صلب ومحقنة. وسيتم استخدام الأنبوب والمحقنة ذاتهما لسحب وطرد مؤشر الكالسيوم من الخيط. يجب إذابة مؤشر الكالسيوم في ماء مقطر بتركيز خمسة ملي.

قسّم هذا المحلول إلى حصص مقدار كل منها 5 µL. احفظ هذه الحصص في درجة حرارة 4 °C. لا تقم بتجميد هذه الحصص للحفاظ عليها في حالة غير مجمدة حتى وقت الحاجة إليها.

الآن، اسحب من واحد إلى اثنين سنتيمتر من كاشف الكالسيوم إلى داخل الفتيلة، وبذلك تكون مستعداً للانتقال إلى الخطوة الأكثر أهمية في تقنية التحميل هذه. استخدم المقص والملقط لقطع أعصاب القطعة الأكثر أمامية بشكل فردي وبالقرب من العقد البطنية. كتلة أعصاب القطعة الأكثر AOR من البطن البطني.

قم بقص أي بقايا عالقة. ضع خيط الملء على منحدر شمع الأسنان بحيث تكون النهاية في مركز اليرقة. قم بتوصيل الأنبوب الدراسي والمحقنة.

اسحب كمية من محلول Schneider باستخدام طرف ماصة (perfect tip). الآن، اسحب نهاية العصب داخل الطرف. يجب أن يكون التثبيت محكماً ولكن دون ضغط شديد على الطرف.

يجب منع دخول المزيد من الـ Schneiders إلى المنطقة المحمية. بشكل عام، قم بإزالة الأنبوب المختبري والمحقنة وقم بتوصيلهما بالفتيل F. المس جانب الفتيل بالـ Schneiders الموجودة في الحمام لتفريغ أي كهرباء ساكنة، ثم أدخل فوراً تأثير صمغ الفتيل على مسافة 50 microns من قطع العصب دون لمسه فعلياً.

يتم ببطء حقن مؤشر الكالسيوم لزيادة حجم محلول Schneider فعلياً بنحو الثلث. سيؤدي ذلك إلى وصول التركيز النهائي لمؤشر الكالسيوم إلى أقل من 2 mM بقليل، ثم يُحفظ التحضير في مكان مظلم ورطب وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة تقريباً. وأود هنا الإشارة إلى نقطتين مهمتين.

أولاً، يجب أن يتوفر محلول فيزيولوجي في الطرف لتخفيف مؤشر الكالسيوم، نظراً لأن مؤشر الكالسيوم قد تم إذابته في الماء وحده. كما يجب أن يحتوي المحلول الفيزيولوجي على الكالسيوم بتركيز عدة millimolar لأن سد المحور العصبي (axon sealing) عملية تعتمد على الكالسيوم، ويعد سد المحور العصبي ضرورياً للحفاظ على صحة النهايات العصبية.

النقطة الثانية هي أنه يجب ألا يمر أكثر من خمس دقائق بين قطع الأعصاب وتطبيق الصبغة على الطرف المقطوع من العصب. فبعد مرور خمس دقائق، ستمنع النهايات السقفية للمحاور العصبية دخول مؤشرات الكالسيوم المقترنة بالدكسترين ذات الأوزان الجزيئية التي تبلغ 10,000. وسيتطلب الالتزام بهذا الحد الزمني بعض التدريب.

لا تحاول تثبيط نمو سقف المحور العصبي عن طريق خفض مستويات الكالسيوم، لأن ذلك سيؤدي فقط إلى تضرر الوظيفة الفسيولوجية المستقبلية للعصب المتضرر. بعد فترة تحضين مدتها 40 دقيقة، والتحضير في محلول Schneiders، قم بلمس جانب الفتيل المملوء بحمام المحلول ثم أعد إدخاله لإزالة معظم محلول مؤشر الكالسيوم من الطرف والبادئ. مرة أخرى، استخدم الفتيل لسحب محلول Schneiders طازج من الحمام وملء السرير بالكامل بمحلول Schneiders.

يجب ألا تكون هناك فقاعات في الوسط لأن محلول Schneider سيعمل كأحد الموصلات المعزولة عن الحمام بينما يتم تحفيز العصب بالزجاج الحيوي، ومرة أخرى ضع التحضير في مكان مظلم لمدة 60 دقيقة على الأقل، ولكن لا تزيد عن أربع ساعات، مع الشطف بمحلول Schneiders طازج كل 30 دقيقة أثناء الحضانة، يتم نقل مؤشر الكالسيوم للأسفل. تتركز المحاور العصبية في النهاية العصبية قبل 20 دقيقة من الرغبة في فحص التحضير. اشطفه بمحلول HL six.

يجب أن يحتوي المحلول على المستوى المطلوب من الكالسيوم عندما يكون مستوى الكالسيوم أعلى من 0.4 millimolar تقريبًا، مع إضافة glutamate أو L glutamic acid إلى HL six بتركيز 7 millimolar لوقف انقباض العضلات الناجم عن التحفيز العصبي. لا يُعد محلول Schneider مناسبًا لتصوير الكالسيوم لأنه يحتوي بالفعل على مستويات عالية من كل من glutamate والكالسيوم، وهي مستويات ستحتاج إلى تعديلها.

كما يتواجد Tate مما يجعل التحميل بالتألق الذاتي والـ imaging الخاص بـ Schneider ممكنين في HL six طالما كان الكالسيوم موجوداً بتركيز 2 million على الأقل أثناء التحميل. وعند تجهيز العينة على مجهر مركب من أجل الـ imaging، تأكد مرة أخرى من تفريغ جميع الشحنات الكهربائية الساكنة من نفسك. ثم المس كلًا من المحلول في الحوض والعدسة الشيئية باستخدام ملقط.

إذا كانت العدسة الشيئية هي عدسة غمر، قم بخفضها حتى تلامس الحوض، ثم قم بتأريض القاعدة لفترة وجيزة، أو ضع أحد الأقطاب في الحوض وأدخل الآخر لملء الفراغ. إن نبضات التيار المستمر (DC pulses) التي تقل عن 3 volts ومدتها 300 microseconds ستؤدي بشكل موثوق إلى استثارة جهد الفعل في العصب. نرى هنا مجموعتين من النهايات العصبية في الشق بين العضلتين السادسة والسابعة، واللتين أصبحتا مرئيتين من خلال تحفيز التعبير السيتوسولي لبروتين GFP. كما تم ملؤهما أمامياً بمؤشر الكالسيوم Rod Dextran، الذي يمتلك أطياف إثارة وانبعاث مختلفة عن بروتين GFP.

لا يزال مجال الرؤية هذا يحتوي على النهايات العصبية، ولكن صبغة Rod Rin تمتلك ألفة منخفضة للكالسيوم وتكاد تكون غير مرئية عندما يكون العصب في حالة سكون. ومع ذلك، فهي تستجيب بقوة للكالسيوم الذي يدخل إلى النهايات أثناء جهود الفعل المنفردة أو سلاسل التحفيز القصيرة التي تستغرق ثانيتين. وكما هو موضح هنا في تحليل الفلورية لسلاسل 80 hertz المتقاربة التي عرضت للتو، فإن الاستجابات في نهايات type one S عادة ما تكون أكبر من تلك الموجودة في نهايات type one B.

مؤشرات الكالسيوم ذات الألفة المنخفضة مثل رود ديكسترين (Rod Dextrin) وفلو (Flu). أظهر رود ديكسترين استجابة خطية تقريباً لترددات تحفيز العصب في هذه النهايات العصبية ضمن نطاق يتراوح من 10 إلى 80 hertz. المثال الموضح هنا مأخوذ من نهاية عصبية على العضلة رقم أربعة، محملة برود ديكسترين (Rod Dextrin).