يعاير الحركي ، والتعلم ، والذاكرة في العجز ذبابة الفاكهة نماذج من تنكس عصبي

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة التعلم والذاكرة في ذباب Esso Melan Gaster البالغ، وذلك بتحديد ما إذا كان الذباب يعاني من قصور في الحركة أولاً. حيث يتم اختبارهم في مقايسة الانتحاء الأرضي السلبي. بعد ذلك، يتم التحقق من سلوك الانتحاء الضوئي الإيجابي عن طريق وضع الذباب في متاهة على شكل T وتسجيل فترة الكمون للانتقال نحو الحجرة المضيئة المفضلة.

يتم بعد ذلك تكييف الذباب الذي يظهر انتحاءً ضوئياً موجباً لربط الغرفة المضاءة بالمذاق المر للكينين. وفي النهاية، يتم اختبار الذباب لمعرفة مدى قدرته على ربط المثير المنفر بالغرفة المضاءة، مما يوفر مقياساً للتعلم والذاكرة. أهلاً بكِ يا Ola في مختبر X.

سنقوم اليوم باستعراض اختبارين سلوكيين شائعين لدراسة التنكس العصبي في ذبابة الدروزوفيلا. أولاً، سنعرض لكم اختبار تثبيط الانتحاء الضوئي التنافري الذي سيقدمه ويل فريدو سالا، وهو طالب جامعي في مختبرنا، وبمشاركتي، يليه اختبار الانتحاء الأرضي السلبي الذي سيقدمه كايوان، وهو طالب دراسات عليا في مختبرنا. يتم تربية الذباب على وسط دقيق الذرة والآجار والدبس والخميرة القياسي عند درجة حرارة 25 °C ضمن دورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة.

في يوم إجراء الانسداد، تُصنف الذباب العذارى إلى مجموعات مكونة من 20 ذبابة. ويتم التعرف على الذباب العذارى من خلال لونها الفاتح وجود بقعة خضراء داكنة تقع على الجانب السفلي من بطنها. يجب نقل الذباب إلى قارورة جديدة كل ثلاثة أيام، كما ينبغي استخدام الذباب الشقيق لتقليل الاختلافات الناجمة عن الخلفيات الجينية.

يجب اختبار من 10 إلى 20 مجموعة لكل نمط جيني أو معاملة في دراسة الانتحاء الأرضي. للبدء، يتم فرز الذباب من الإناث والذكور في مجموعات مكونة من 10 أفراد، على أن يتم اختبار هذه المجموعات بشكل منفصل.

نظراً لأن السلوك يتأثر بشكل كبير بالجنس، انتظر لمدة ساعة واحدة على الأقل بعد التخدير قبل المتابعة لضمان عدم تضرر النشاط الحركي. وبمجرد تحضير الذباب بشكل مثالي، قم بمحاذاة فتحات قارورتين فارغتين من البوليسترين عن طريق وصلهما رأسياً فوق القارورة السفلية.

قم بقياس ثمانية سنتيمترات من الأسفل وارسم دائرة حول المحيط. والآن بعد تجميع الجهاز، انقل مجموعة مكونة من 10 ذباب إلى الأنبوب السفلي. قم بإعادة توصيل الأنابيب فوراً واترك الذباب يتأقلم لمدة دقيقة واحدة قبل البدء في الاختبار.

بعد استقرار الذباب، انقر برفق على القارورة لدفعه إلى الأسفل، ثم قم بقياس عدد الذباب الذي يتسلق فوق علامة 8 cm خلال 10 ثوانٍ. يُسجل عدد الذباب في كل مجموعة الذي تجاوز هذه العلامة كنسبة مئوية من إجمالي عدد الذباب. كرر هذه العملية 10 مرات لكل مجموعة، مع السماح للذباب بالراحة لمدة دقيقة واحدة بين التجارب.

قبل ست ساعات من إجراء مقايسة PS، يتم فرز الذباب الإناث في قوارير بوليسترين تحتوي على ورق ترشيح مبلل بالماء. تضمن هذه الخطوة تجويع الذباب وزيادة استجابته للمذاق المنفّر. وفي هذه المقايسة، يُستخدم محلول الكينين كمحفز منفّر.

قم بتحضير محلول عمل بتركيز 1 µM من محلول مخزون بتركيز 0.1 M. تتكون متاهة T من عمود مركزي مزود بباب سداسي وغرفتين جانبيتين، إحداهما غرفة مظلمة والأخرى غرفة مضاءة. عند علامة 2 mm، استخدم منشاراً يدويًا لقص الطرف المغلق لأنبوبي طرد مركزي بلاستيكيين سعة 15 mL، ثم قم بتركيب محولات توصيل عند كل طرف وأحكم إغلاق الوصلة باستخدام البارافورم.

قم بتغليف أنبوب واحد بورق الألومنيوم ليكون بمثابة الغرفة المظلمة. قم بتجميع أجهزة TMAs عن طريق ربط الغرفتين المضيئة والمظلمة على كل جانب من العمود المركزي. مع إغلاق الباب الخداعي في المنتصف، استكمل عملية الإعداد بتوصيل مصدر ضوئي بمحول الغرفة المضيئة مباشرة. قبل إجراء المقايسة، انقل كل ذبابة من مجموعة مكونة من 10 إلى أنبوب طرد مركزي فارغ سعة 15 milliliter وأغلقه بإحكام خفيف لمنع الهروب.

بعد ذلك، قم بفك الغرفة المظلمة من أنابيب TMAs. انقل ذبابة واحدة إلى الأنبوب وأعد إدخاله فوراً في المتاهة. أطفئ أضواء الغرفة وشغّل مصباحاً أحمر.

اترك الذبابة لتتأقلم في الغرفة المظلمة لمدة 30 ثانية، ثم قم بتشغيل مصدر الضوء الذي يضيء الغرفة المضاءة ببطء. وبمجرد الإضاءة، افتح الباب الفاصل بين الغرفتين. إذا انتقلت الذبابة إلى الغرفة المضاءة في غضون 10 ثوانٍ، فإنها تُعتبر ذات انجذاب ضوئي إيجابي وتكون جاهزة للتدريب.

يشير عدم الاستجابة بهذه الطريقة إلى وجود مشكلة في الجهاز البصري، مما يستوجب استبعاد الذبابة من المقايسة. وبمجرد تأكيد الانتحاء الضوئي الإيجابي، انقر على الذبابة لإعادتها إلى الغرفة المظلمة، ثم أغلق باب المصيدة وأطفئ الضوء خلال فترة راحة مدتها 32 ثانية. قم بتحضير المثير المنفر عن طريق وضع ورقة الترشيح في الغرفة المضيئة وإضافة 1 mL من محلول الكينين بواسطة الماصة فوق ورقة الترشيح.

التأكد من ترطيب ورق الترشيح بالكامل بالمثيرات المنفرة. لبدء عملية الإشراط، افتح باب المصيدة ببطء وشغل الضوء. اسمح للذبابة بالسير إلى الغرفة المضاءة والمعطرة بالـ quinine.

بعد مرور دقيقة واحدة، انقر على الذبابة لإعادتها إلى الغرفة المظلمة. كرر هذا الإجراء تسع مرات ليصبح المجموع 10 تجارب تكييف. وعادةً ما تتجنب الذباب من هذا النوع الغرفة المضيئة بعد ثلاث إلى خمس تجارب تدريبية مباشرة بعد انتهاء التدريب.

أجرِ خمس تجارب اختبارية. إذا لم تمشِ الذبابة المدربة نحو ضوء الغرفة خلال 10 seconds، يتم تسجيل ذلك كنجاح. ثم يتم تسجيل وتحديد معدل النجاح عبر خمس تجارب متتالية.

قيمة PC zero. بعد التدريب وتسجيلات PC zero الأولية، يتم وضع كل ذبابة مرة أخرى في ملف الغذاء المرقم الأصلي الخاص بها وتترك جانباً لمدة ست ساعات. بعد ست ساعات من التدريب، يتم إجراء خمس تجارب اختبار إضافية كما تم توضيحه سابقاً، ويمثل معدل النجاح هذا قيمة PC six وهو مقياس للذاكرة قصيرة المدى.

في مقايسة الجيوتكسيس السلبية، يتم تحويل عدد الذباب الذي يتجاوز علامة الثمانية سنتيمترات إلى نسبة مئوية ويتم عرضها كمعدل اجتياز التسلق. ومن خلال 10 تجارب كما هو موضح هنا على اليمين، يعاني الذباب من الذكور أو الإناث بعمر 10 أيام والذي يعبر عن بروتين tau البشري بشكل مفرط من قصور حركي ملحوظ مقارنة بالذباب الذي يعبر عن GFP بشكل مفرط والمماثل له في العمر على اليسار.

يتم تمثيل الأداء في اختبار تثبيط الانتحاء الضوئي النفوري من خلال متوسط معدل النجاح أو النسبة المئوية لمحاولات التجنب الناجحة. ومن بين إجمالي المحاولات، يظهر الذباب الذي يفرط في التعبير عن tau هنا على اليمين ضعفاً في ربط الضوء بالمذاق المر مقارنة بمجموعة التحكم على اليسار، سواء مباشرة بعد التدريب أو عند الاختبار بعد ست ساعات. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن أخذ عينات للتحليل الكيميائي النسيجي المناعي للإجابة على أسئلة إضافية حول الاختلافات المورفولوجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة التعلم والذاكرة في ذباب Drosophila.

وتذكر، أن الأمر كله يتمحور حولك.