أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تضمين مستعمرات الخميرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة مستعمرة وأجار أساسي أولا من صفيحة أجار ، ووضعها على عدة قطرات من الأجار المنصهر وتغطيتها بسرعة بمزيد من الصخور المنصهر. بعد ذلك ، يتم قطع AER الزائد من المستعمرة لجعلها صغيرة بما يكفي لتناسب القالب.

ثم يتم إصلاح مستعمرة AER المدمجة وتلطيخها وتجفيفها وأخيرا يتم اختراقها براتنج النتوءات. ثم يتم وضع الكتلة في قالب مع راتنج توتنهام إضافي محتضن حتى يتصلب ثم يتم تقسيمه. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح توزيع أنواع الخلايا داخل مستعمرة الخميرة من خلال المجهر الضوئي أو الإلكتروني.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري الإلكتروني الماسح ، هي أنها تسمح بتحديد الهيكل الداخلي للمستعمرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التطور الميكروبي ، مثل توزيع أنواع الخلايا داخل المستعمرات. قدمت هذه الطريقة نظرة ثاقبة لبنية مستعمرات الكروس CAC ، ولكن من المحتمل أيضا أن يتم تطبيقها على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث قد يكون من الصعب تعلم التعامل مع المستعمرات وتضمينها من بروتوكول مكتوب. كانت فكرة هذه الطريقة مستوحاة من بعض البيانات الجينية التي نشرناها في عام 2002 والتي أشارت إلى أن الجراثيم لم يتم توزيعها بالتساوي في المستعمرات. قمنا بتكييف طريقة لتقسيم المستعمرات التي طورها إنجلبرغ في مختبر الزعانف.

لذلك دعونا نبدأ. ابدأ باحتضان خميرة Wild S visi على ألواح المثقاب عند 30 درجة حتى يوجد ما يقرب من 300 مستعمرة. باستخدام ملعقة ضيقة ، قم بإزالة المستعمرات التي يبلغ قطرها من ملليمتر إلى ملليمترين ، واحدة تلو الأخرى من اللوحة.

ثم باستخدام طرف ماصة سعة مليلتر واحد ، ضع عدة قطرات من 2٪ أجار عند 42 درجة مئوية على شريحة مجهرية ، ثم ضع المستعمرة على الفور على أجار ووجهها لأعلى قبل أن تصلب AER. ضع عدة قطرات أخرى من أجار على المستعمرة واترك الأجار يتصلب ، وتأكد من أن المستعمرة بأكملها ، بما في ذلك الجزء العلوي من المستعمرة ، مغلفة بالأجار. في جميع خطوات البروتوكول اللاحقة بشفرة حلاقة.

قم بقص AER حول المستعمرة وضع كتلة AER التي تحتوي على المستعمرة. في قارورة غطاء لولبي بو سيليكات سعة 3.5 ملليلتر تحتوي على 2٪ ألدهيد بارافورم ، و 2٪ مستعمرات تثبيت جلوتارالديهايد ، واحدة تلو الأخرى لمنع الجفاف ، ولكن يمكن وضع ما يصل إلى 10 مستعمرات في نفس القارورة. اترك المستعمرات لمدة سبعة أيام عند أربع درجات مئوية.

بعد أسبوع واحد ، قم بإزالة المثبت وغسل المستعمرات الزراعية مرتين ، باستخدام ما يقرب من 1.5 مل من 0.15 مولي الصوديوم. كتيه عند درجة الحموضة 7.2 واحتضنه على الثلج بعد كل غسلة لمدة 15 دقيقة دون تحريض. بعد هذا الغسيل مرتين أخريين.

باستخدام 1.5 مل من مخزن مؤقت X OS ، يتكون من 100 مللي مولار أحادي فوسفات البوتاسيوم ، و 10 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم عند درجة الحموضة 6.0 ، ويحتضن على الثلج لمدة خمس دقائق بعد كل غسلة. بعد ذلك ، باستخدام نفس القارورة ، قم بإجراء معالجة الأوزميوم والغسيل المدرجة هنا وفي الجزء المكتوب من هذا البروتوكول. ثم مرة أخرى ، باستخدام نفس القارورة ، قم بإجراء الجفاف التدريجي المدرج هنا وفي البروتوكول المكتوب المصاحب في وقت مبكر من صباح اليوم التالي.

قم بإعداد كاشف النتوءات كما هو موضح هنا وفي البروتوكول المكتوب المصاحب. اغسل الكتل الزراعية على الفور خمس مرات لمدة 10 دقائق لكل منها 1.5 مل من الإيثانول بدرجة حرارة الغرفة بنسبة 100٪. بعد آخر غسل للإيثانول ، قم بإزالة ما يكفي من الإيثانول فقط بحيث تظل الكتلة الزراعية مغطاة.

باستخدام ماصة المراعي ، ضع ما يقرب من 0.5 مل من كاشف النتوءات في القارورة وقم بتدويرها على عجلة بسرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة بعد الدوران ، اترك القارورة تقف لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول تماما.

ثم أضف 1.5 مل من كاشف النتوءات لتغطية الكتلة الزراعية. مرة أخرى ، قم بتدوير القارورة على عجلة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واتركها لمدة 30 دقيقة. كرر هذا الغسيل.

خطوة ثلاث مرات أخرى. بعد آخر 30 دقيقة ، قم بإزالة كاشف النتوءات وأضف كاشف النتوءات الطازج لتغطية الكتل. اترك الكتل الزراعية تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات.

استبدل كاشف النتوءات وقم بتدويرها طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، استبدل كاشف النتوءات واترك القوارير تدور حتى اليوم التالي. في صباح اليوم التالي ، ضع كاشف النتوءات في قوالب سيليكون مرقمة لتغطية الجزء السفلي من القوالب فقط.

بعد ذلك ، ضع الكتل الزراعية في القوالب واحتضانها عند 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد أربع ساعات ، قم بإزالة القوالب بمزيد من النتوءات والكاشف واحتضانها عند 60 درجة مئوية طوال الليل. قم بإزالة الكتل من القالب للتقسيم.

هنا مثال على صورة مجهرية ضوئية لمقطع عبر مركز مستعمرة مستعمرة خميرة Wild S Visia. هذه الخميرة هي سلالة برية معزولة عن إفرازات الأشجار. تم احتضان المستعمرة لمدة ستة أيام على وسط YNA قبل التقسيم.

في هذه الصورة ، يمكن تمييز الأساي والخيمة الزائفة والخميرة البيضاوية بسهولة وتظهر أيضا منطقة المستعمرة التي تغزو الأجار الأساسي. تشير الأسهم المفتوحة إلى الأسهم المملوءة بالأساي التمثيلية ، وتشير إلى الخلايا النباتية المملوءة ببيضاوية الشكل ، وتشير إلى سلاسل الخلايا الممدودة و si. هذه الصورة هي مثال على صورة مجهرية إلكترونية من قسم رقيق من سلالة مختبرية من الخميرة SH 1 0 2 0 و W 3 0 3.

تم احتضان المستعمرة لمدة ستة أيام على وسط YNA قبل التقسيم. تظهر الصورة منطقة من المستعمرة تحتوي على تردد عال من الخلايا الأبواغ. يشير السهم إلى هيكل الطبقة الثنائية لجدار البوغ.

في الجزء أ ، نعرض قسما من مستعمرة مدتها أربعة أيام مع شبكة مكونة من 15 مستطيلا متراكبة على الصورة في الجزء ب ، يتم تطعيم تردد الخلايا ذات الصلة بالأبواغ في كل مستطيل مع 15 شريطا تتوافق مع 15 مستطيلا موضحا في الجزء أ ، والبيانات هي متوسط الخطأ والمعيار لأربع مستعمرات مستقلة لمدة أربعة أيام في الجزء ج ، يتم عرض الوسائل والأخطاء القياسية لأربع مستعمرات مستقلة من ثمانية أيام. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون أسبوعين مع يوم كامل وعدة ساعات إلى ثلاث ساعات يوميا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إضافة الحلول على الفور حتى لا تجف الكتل باتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل المجهر الإلكتروني المناعي لتحديد توزيع الخلايا التي تعبر عن بروتينات معينة بعد تطورها. سمحت لنا هذه التقنية بالنظر ليس فقط إلى زخرفة الخلايا البواغية ، ولكن أيضا في زخرفة الخلايا الخيطية الزائفة في مستعمرات Croce CCI. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تضمين مستعمرات الخميرة للتقسيم.

لا تنس أن العديد من الكواشف المجهرية المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن أن تكون خطيرة للغاية. يرجى تذكر استخدام غطاء الدخان وارتداء الملابس الواقية والتخلص من الكواشف بشكل صحيح. حسنا ، هذا كل شيء.

شكرا للمشاهدة. حظا سعيدا في تجاربك.