Name: تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: اكتشف تصوير إزفاء PKC في الخلايا الحية باستخدام مجهر المسح بالليزر لدراسة ديناميكيات البروتين في الوقت الفعلي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات الإشارة الخلوية في الخلايا العصبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لمنح الصحة (CIHR) بحوث لاين S. Sossin. كارول ألف فرح وهو حاصل على زمالة ما بعد الدكتوراه من فون بحوث دي لا سانتي ان كيبيك (FRSQ) وزمالة هارينجتون كونراد. فإن الكتاب أود أن أشكر جوانا بوجي ، مارغريت هاستينغز واللبان مارغريت للمساعدة في تبادل لاطلاق النار الفيديو ومادلين ريتشموند حمام سباحة للحصول على مساعدة مع نظرة عامة على الرسم.

1. إعداد وصيانة Sf9 الثقافات المونولاير الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ Sf9 خلية ثقافة والصيانة في نسيج الثقافة هود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستمد Sf9 خلايا من خلايا المبيض Spodoptera frugiperda (Sf21 الخلايا) ويمكن شراؤها على شكل خلايا مجمدة في وسائل الإعلام من Invitrogen غريس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8 مل من مكان المتوسطة غريس الحشرات ، على أن تستكمل (1X) ، والتي 30 ٪ الجنين مصل الأبقار (FBS) وقد أضيف في 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة مع رقبة ميال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد أنبوب المجمدة للSf9 الخلايا بسرعة في حمام مائي 37 ° C بتحريك الأنبوب ذهابا وإيابا (حوالي 1-2 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 نقل الخلايا إلى 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة والصفيحة الصخرية بلطف باليد لتوزيع الخلايا بالتساوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 1-2 ساعات حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا قد المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة القديمة واستبدالها مع 10 مل من الحشرات والمتوسطة freshGrace FBS مع 30 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحفاظ على الثقافات أحادي الطبقة ، وإزالة المتوسطة من العمر القارورة متموجة من Sf9 الخلايا وإضافة 5 مل من المتوسط ​​غريس الحشرات مع FBS 10 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بخفة على جانب القارورة عدة مرات لفصل Sf9 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة 10 مل وpipettor أ ، ماصة وسائل الإعلام بلطف صعودا وهبوطا مرة واحدة ، في حين الرش جدار القارورة pipetting أسفل. نقل الخلايا إلى أنبوب العقيمة Polysterene 15 مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من تعليق خلية Sf9 إلى 8 مل من المتوسط ​​غريس الحشرات مع FBS 10 ٪ (1:5 تخفيف للحفاظ على سجل النمو المرحلة) في 75 سم 2 جديدة الخلية قارورة الثقافة والصفيحة الصخرية بلطف باليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا متموجة. </li></ol> 2. التعبير عن الكلمات الدلالية PKCS Fluorescently في خلايا Sf9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليعيش تجربة التصوير ، والثقافة Sf9 الخلايا على الزجاج 35 ملم ماتيك disheswith ثقافة أسفل سطح الزجاج من 14 ملم وسماكة ساترة من 0،16-0،19 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأعرب PKCS المفتاحية مع البروتينات الفلورية في Sf9 الخلايا باستخدام كاشف Cellfectin ترنسفكأيشن الثاني التوصية التالية من الشركة المصنعة مع التعديلات المفصلة أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 1 : قبل طلاء الخلايا ، وعلاج كل طبق ماتيك المتوسطة مع غريس الحشرات مع FBS 10 ٪ على الأقل 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد Sf9 الخلايا من الخطوة 11 (أعلاه) باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 0.05 × 10 6 خلايا في كل ساترة ماتيك الزجاج في حجم ما مجموعه 150 ميكرولتر. السماح للخلايا تعلق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من وتستكمل مع غريس FBS 10 ٪ لكل 1 مل طبق في وقت ببطء لتجنب فصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حتى 27 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من هذه النقطة ، واستخدام توصية الشركة المصنعة لترنسفكأيشن Sf9 من خلايا الحمض النووي مع البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 : Transfect Sf9 الخلايا مع PKCS الموسومة fluorescently باستخدام كاشف Cellfectin ترنسفكأيشن الثاني. نحن غالبا ما يكون التعاون وأعرب في هذا النظام PKCS المفتاحية البروتين المعزز نيون الخضراء (eGFP) والبروتين موحودي نيون الأحمر (mRFP) (التفاصيل لبناء البلازميد وقد وصفت سابقا 2،5). التعبير عن بروتين واحد في وقت واحد الفلورسنت غلة حوالي 70-80 ٪ معربا عن خلايا في مرحلة ما بعد 72 ساعة ترنسفكأيشن. شارك في التعبير عن اثنين من البروتينات الفلورية انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن إلى حوالي 30 ٪ شارك في التعبير عن الخلايا. عندما شاركت في التعبير عن eGFP الموسومة PKC وmRFP الموسومة PKC ، استخدم 2X DNA البلازميد لمزيد من البروتين mRFP الموسومة للتعبير البروتين الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء حية التصوير 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الأمثل للتعبير البروتين ، والانتظار 72 ساعة). </li></ol> 3. التعبير عن الكلمات الدلالية PKCS Fluorescently في الخلايا العصبية الحسية Aplysia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد وصفت إعداد الثقافات Aplysia الخلية العصبية في مادة الفيديو و 4 تشاو الزملاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأعرب PKCS المفتاحية مع البروتينات الفلورية في الخلايا العصبية الحسية Aplysia باستخدام الإجراء microinjection المفصلة أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل سريع الأسهم الخضراء 1 ٪ (FCF) في الماء المقطر ، والتصفية باستخدام حقنة وحقنة 28 ملم تصفية (0.20 ميكرون). قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يمكن أن يؤديها Microinjection من الخلايا العصبية الحسية في يوم 1 أو 2 بعد يوم وعزل الخلايا العصبية لكننا نجد أن الانتظار 2 أيام يسمح للانضمام إلى خلية أفضل ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 بعد عزل الخلايا العصبية الحسية ، وأذاب an قسامة الخضراء سريعة وتصفية مرة أخرى باستخدام حقنة وحقنة تصفية 28 ملم (0.20 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل DNA البلازميد في الماء المقطر الخضراء التي تحتوي على السريع 0.5 ٪. ويمكن استخدام تركيزات DNA البلازميد تصل إلى 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر ولكن ليس من المستحسن أن يذهب فوق هذه القيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية DNA البلازميد / حل سريع الخضراء باستخدام حقنة 1 مل 4 مم والمحاقن تصفية (0.20 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ال DNA البلازميد / حل سريع الخضراء في XG 16110 لمدة 15 دقيقة باستخدام الميكروفونrocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأقطاب حادة لmicroinjection من الخلايا العصبية باستخدام مجتذب microelectrode (سوتر يلهب / براون Micropipette بولير ، الموديل P - 97). باستخدام خيوط مربع ، وسحب microelectrodes الزجاج مع القطر الخارجي 1 مم ، 0.75 مم داخل القطر وطول 100 مم باستخدام رقيقة الجدار الزجاجي الشعيرات الدموية مع خيوط داخل (البنك الآلات الدقيقة TW100F - 4). لمزيد من المعلومات حول سحب أقطاب microinjection يرجى الرجوع إلى كتاب طبخ كهربائي سوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل قطب كهربائي مع 2 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد / حل سريع الخضراء باستخدام ماصة microloader غيض (إيبندورف CA32950 - 050). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أسفل الزجاج ماتيك صحن يحتوي على ثقافة الثقافات Aplysia العصبية إلى محطة microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محطة microinjection يتكون من التالي : منزل من صنع الزجاج كبيرة المرحلة لعقد الأطباق الثقافة على طاولة الاهتزاز العزلة (الحركية العزلة اهتزاز نظم محطة العمل) ، وستيريو النطاق مع إضاءة الهالوجين الخارجية ، micromanipulator ألف (سوتر نوع ستريت هكسلي Micromanipulator والذي يسمح لتحديد المواقع على حد سواء الخشنة وفائق النعومة في المحور الثالث) ، حامل microelectrode متصلة مضخة هوائية (الآلات الدقيقة العالم PV820 - مضخة هوائية بيكو). توصيل الإدخال ضغط المضخة الهوائية إلى خزان نيتروجين مضغوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج microelectrode في حامل microelectrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض تحت المجهر ستيريو ، إدراج غيض من micropipette في نواة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل نبضات قصيرة من ضغط النيتروجين (10 إلى 100 ​​مللي ثانية في المدة ، و 20 رطل / في 2) حتى تصبح نواة uniformely الخضراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. لإزفاء PKC الأمثل ، وتنفيذ التجربة الحية التصوير 20-24 ساعة بعد الحقن. </li></ol> 4. تصور الحياة في إزفاء PKC Sf9 الخلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير ، ونستخدم LSM510 زايس مجهر مقلوب مبائر مع 200 Axiovert. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير البروتوكول هو نفسه لSf9 الخلايا العصبية والحسية Aplysia باستثناء ما يلي : يتم تصوير Sf9 الخلايا مع هدف النفط الغمر x63 بينما تصوير الخلايا العصبية الحسية Aplysia مع الغمر X40 الهدف النفط. يتم تصوير Sf9 الخلايا في غرفة التحكم في درجة حرارته درجة مئوية في الحفاظ على 26-27 في حين أن تصوير الخلايا العصبية الحسية Aplysia المحافظة على درجة حرارة الغرفة حوالي 18-20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستخدم 30 ميغاواط الأرجون ليزر (الإثارة في 488nm) مع انتاج 50 ٪ ليزر PKC صورة المفتاحية مع بروتين eGFP والليزر HeNe (الإثارة في 543nm) لPKC صورة المفتاحية mRFP البروتين. والأرجون وخطوط HeNe الليزر هي الموهن إلى 4 ٪ ، ويتم ضبط 50 ٪ على التوالي قبل الانتقال الإخراج إلى التصوير والثقب وإلى واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المهم أن يكون الطبق الثقافة استقرت على المسرح والتصوير وتجنب الحركة أو اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة من صحن به برفق ماصة 10 مل ترك 1 مل حجم الكلي في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور في الجزء الأوسط من الخلايا التي يمكن أن ينظر إلى النواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة زمنية من 10-20 مبائر الصور التقاط صورة كل 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ السلسلة الزمنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أخذ الصور 2 (بعد الساعة 30 نقطة ثانية) ، إضافة 1 مل من المخدرات (2X تركيز) بلطف الانقطاع عن الإفلات من قبل في أعلى الخلايا باستخدام ماصة P1000. يضاف الدواء باستمرار لمدة 30 ثانية تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعض الأدوية إحداث إزفاء السريعة التي يمكن أن تكون مرئية مباشرة بعد العلاج من تعاطي المخدرات (60 نقطة في الوقت ثانية) في حين أن آخرين إحداث إزفاء البطيء ، والذي يبعد دقائق فقط 50-10 بعد العلاج الأمثل (1 و الفيلم السينمائي 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هذا الدواء يجب أن جرفت ، واستخدام 2 × 10 مل pipets للقيام يغسل ، pipetting المخزن يغسل برفق مع أحد ماصة على جانب واحد من صحن وpipeting حتى وسائل الإعلام على الجانب الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان قد تم غسل فعالة وإذا كان تأثير الدواء هو عكسها ، PKC يعود إلى العصارة الخلوية داخل 30-60 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الفيلم كملف LSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرمجيات NIH J صورة لفتح ملفات LSM وتحديد الصور قبل وبعد العلاج من تعاطي المخدرات. وقد وصفت في مكان آخر الكمي 1. </li></ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد وصفت لدينا التقنية لإزفاء صورة PKCS fluorescently المفتاحية في الوقت الحقيقي في Sf9 الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية. Sf9 الخلايا توفير نظام بسيط لإزفاء صورة PKC منذ زراعة وtransfecting لهم هي جميلة على التوالي إلى الأمام. في المقابل ، microinjection من الخلايا العصبية الحسية Aplysia يستغرق بعض الوقت لاتقان ؛ تصل إلى بضعة أشهر. صعوبات تتعلق هذه التقنية تشمل انسداد الكهربائي. تصفية الحل الحقن والطرد المركزي ولكن عادة أنها تساعد فقاعات الهواء في بعض ا...

<table><tbody><tr><td>خلايا Sf9 المجمدة</td><td>&lt;تعبير مجهري إلكتروني (EM)&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; خلايا المبيض</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>جريس&amp;rsquo;وسط زراعة الحشرات، مُدعّم (1X)، سائل</td><td>كاشف</td><td>GIBCO، من إنتاج Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>تُستخدم لاستزراع خلايا Sf9</td></tr><tr><td>Corning 75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; دورق زراعة خلايا بفتحة مائلة</td><td>أداة</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>تُستخدم لاستزراع خلايا Sf9</td></tr><tr><td>مصل جنين البقر</td><td>كاشف</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>ملحق جريس&amp;rsquo;أوساط زراعية مع مصل جنيني بقري (FBS) قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>حقنة</td><td>أداة</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>تُستخدم لترشيح محلول Fast Green</td></tr><tr><td>محقنة</td><td>أداة</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>يُستخدم لترشيح محلول الحمض النووي البلازميدي / Fast Green</td></tr><tr><td>مرشح</td><td>أداة</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>تُستخدم لترشيح محلول Fast Green</td></tr><tr><td>مرشح</td><td>أداة</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>تُستخدم لترشيح محلول الحمض النووي البلازميدي / Fast Green</td></tr><tr><td>طبق ذو قاعدة زجاجية</td><td>أداة</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>تُستخدم لاستنبات خلايا Sf9 قبل عملية عفن الخلية (transfection) والتصوير.</td></tr><tr><td>كاشف Cellfectin II</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>تُستخدم للتعبير عن بروتينات PKC الموسومة فلورياً في خلايا Sf9</td></tr><tr><td>صبغة Fast Green FCF</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>تُستخدم لتصوير عملية الحقن المجهري لمحلول الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين البلازميدي (plasmid DNA) في &lt;مجهر إلكتروني (EM)&gt;أبليسيا (Aplysia)&lt;/em&gt; العصبونات الحسية</td></tr><tr><td>أنابيب شعرية زجاجية رقيقة الجدران</td><td>أداة</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>تُستخدم لصناعة الميكرو...&amp;#8211;أقطاب كهربائية للحقن المجهري</td></tr><tr><td>رأس ماصة التحميل الدقيق</td><td>أداة</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>عقّم جهاز الأوتوكلاف قبل استخدامه لملء الميكرو...&amp;#8211;أقطاب كهربائية للحقن المجهري</td></tr><tr><td>مضخة بيكو الهوائية PV820 </td><td>أداة</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>جزء من محطة الحقن المجهري</td></tr><tr><td>مجهري&amp;#8211;حامل القطب الكهربائي</td><td>أداة</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>تُستخدم للإمساك بالأنابيب الدقيقة&amp;#8211;قطب كهربائي </td></tr><tr><td>المتلاعب الدقيق</td><td>أداة</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>يُستخدم لضبط موضع المجهر&amp;#8211;القطب الكهربائي في المحور الثلاثي</td></tr></tbody></table>

تصوير الحية إزفاء pkc في sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية aplysia

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

بروتين كيناز جيم (PKCS) هي السيرين ثريونين كاينيسات التي تلعب دورا مركزيا في تنظيم مجموعة واسعة من العمليات الخلوية مثل نمو الخلايا والتعلم والذاكرة. هناك أربع عائلات معروفة من الأشكال الإسوية PKC في الفقاريات : PKCS الكلاسيكية (α ، βI ، وβII γ) ، اكتب رواية أنا PKCS (ε η و) ، رواية من النوع الثاني PKCS (δ وθ) ، وPKCS شاذة (وι ζ ). يتم تنشيط PKCS الكلاسيكية كا 2 + وdiacylclycerol (DAG) ، في حين يتم تنشيط PKCS رواية همرشولد ، ولكن كا 2 + مستقلة. يتم تنشيط PKCS شاذة التي لا كا 2 + ولا همرشولد. في californica Aplysia ، لدينا نظام نموذجي لدراسة تكوين الذاكرة ، وهناك ثلاثة نظام محدد العصبي الأشكال الإسوية PKC واحد من كل فئة رئيسية ، هي التقليدية PKC APL انا ، انا اكتب رواية PKC APL الثاني والثالث شاذة PKC الألغام المضادة للأفراد. PKCS والدهون تنشيط كاينيسات ، وبالتالي فقد تم تفعيل PKCS الرواية الكلاسيكية واستجابة لإشارات خارج الخلية مرتبطة بشكل متكرر مع إزفاء PKC من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما. ولذلك ، تصور إزفاء PKC في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية قد أصبحت أداة لا تقدر بثمن لتوضيح مسارات نقل الإشارة التي تؤدي إلى تفعيل PKC. على سبيل المثال ، سمحت هذه التقنية بالنسبة لنا لإثبات أن الأشكال الإسوية المختلفة من PKC نقل من مكان لآخر في ظل ظروف مختلفة للتوسط أنواع متميزة من اللدونة متشابك وأن السيروتونين (5HT) تفعيل PKC APL الثاني يتطلب إنتاج كل من حمض الفسفاتيديك همرشولد و(السلطة الفلسطينية) من أجل إزفاء 1-2. الأهم ، والقدرة على تصور الخلية العصبية نفسها مرارا وتكرارا وقد سمح لنا ، على سبيل المثال ، لقياس الحساسية للاستجابة PKC بالتفصيل رائعة 3. في هذا الفيديو ، ونظهر كل خطوة من إعداد الثقافات الخلية Sf9 ، وقد وصفت الثقافات من الخلايا العصبية الحسية Aplysia في مقال آخر فيديو 4 ، معربا عن PKCS الموسومة fluorescently Sf9 في الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية والعيش التصوير من إزفاء PKC ردا على تفعيل مختلفة باستخدام الليزر المجهر.

في هذا الفيديو ، ونظهر تصور إزفاء PKC في الخلايا الحية باستخدام PKCS الموسومة fluorescently.

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

تعد بروتينات كيناز سي (PKCs) من كينازات السيرين والثريونين التي تلعب دوراً مركزياً في تنظيم مجموعة واسعة من العمليات الخلوية مثل نمو الخلايا و...

الهدف من هذا الإجراء هو تصور انتقال PKC المسمى بفلوريسين في الخلايا الحية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير مستنبتات خلايا SF nine أو مستنبتات عصبونات حسية من Plegia California. والخطوة الثانية هي التعبير عن pkcs المسمى بفلوريسين في الخلايا.تتمثل الخطوة النهائية في تصوير انتقال PKC استجابةً لمحفزات مختلفة باستخدام المجهر المسحي الليزري. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر التنظيم التفاضلي للأشكال الإيزوميرية المختلفة لـ PKC بواسطة الرسل الثانوية مثل diol glycerol من خلال تصوير انتقال PKC في الوقت الفعلي باستخدام خلايا حية. مرحباً، اسمي كارول فيرا.أنا باحث مشارك في مختبر الدكتور Wayne Sawn في معهد مونتريال لعلوم الأعصاب. سأقوم اليوم باستعراض التصوير الحي لانتقال PKC في العصبونات الحسية لـ Aplysia. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال اللدونة التشابكية، مثل كيفية تنشيط الأشكال المتعددة المختلفة لـ PKC أثناء تكوين الذاكرة.لتحضير مزارع الطبقة الأحادية من خلايا SF nine في غطاء زراعة الأنسجة، أضف 8 mL من وسط Grace's insect medium مع 30% fetal bovine serum إلى دورق زراعة خلايا بمساحة 75 cm²، ثم قم بإذابة الأنبوب المجمد من خلايا SF nine بسرعة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C عن طريق تحريك الأنبوب ذهاباً وإياباً لمدة دقيقة إلى دقيقتين تقريباً. بعد ذلك، انقل خلايا SF nine إلى دورق زراعة الخلايا وهز الدورق بلطف يدوياً لتوزيع الخلايا بالتساوي. قم بحضن الخلايا لمدة ساعة إلى ساعتين عند درجة حرارة 27 °C حتى تلتصق.بعد ذلك، قم بإزالة الوسط القديم من القارورة واستبدله بـ 10 milliliters أخرى من وسط "جريس" للحشرات الطازج مع 30%FBS، ثم حضن الخلايا عند 27 درجة مئوية حتى تصبح متلاحمة. وللحفاظ على المزارع أحادية الطبقة، قم بإزالة الوسط القديم من القارورة المتلاحمة لخلايا SF nine وأضف خمسة milliliters من وسط "جريس" للحشرات مع 10%FBS، ثم انقر بخفة على جانب القارورة عدة مرات لفصل خلايا SF nine. بعد ذلك، وباستخدام ماصة 10 milliliter، قم بسحب الوسط وإطلاقه بلطف للأعلى والأسفل.بمجرد رش الخلايا على جدار الدورق أثناء السحب بالماصة، انقل الخلايا إلى أنبوب بوليسترين معقم سعة 15 milliliter. أضف 2 milliliters من معلق خلايا SF nine إلى 8 milliliters من وسط grace's الحشري مع 10%FBS في دورق زراعة خلايا جديد بمساحة 75 centimeter squared وبنسبة تخفيف قدرها 1:5. وللحفاظ على نمو الخلايا في طور النمو اللوغاريتمي، قم بهز الدورق برفق يدويًا.بعد ذلك، قم بحضن الخلايا مرة أخرى عند 27 درجة مئوية حتى تصبح متجانسة. وبعد انتهاء فترة الحضن، تكون خلايا SF nine جاهزة للاستخدام للتعبير عن pkcs الموسومة فلورياً كما هو موضح في الإجراء المكتوب قبل التعبير عن pkcs الموسومة فلورياً. يتم تحضير مستنبتات الخلايا العصبية Plegia في أطباق استنبات ذات قاع زجاجي من شركة matech كما تم وصفه سابقاً. وبعد يومين من عزل العصبونات الحسية، قم بترشيح كمية مُحضرة مسبقاً من fast green باستخدام حقنة ومرشح حقنة بحجم 20 مليمتر وبحجم مسام 0.2 ميكرون.قم بتحضير محلول من DNA البلازميدي الذي يشفر لـ E-G-F-P-P KC API two في ماء مقطر يحتوي على 0.5% fast green بتركيز لا يتجاوز 0.4 micrograms per microliter. قم بترشيح محلول DNA البلازميدي وfast green باستخدام حقنة سعة one milliliter ومرشح حقنة مقاس four millimeter بقطر مسام 0.2 micron. بعد ذلك، قم بطرد محلول DNA البلازميدي وfast green مركزياً عند 16, 110 Gs لمدة 15 minutes باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق (micro centrifuge).بعد ذلك، قم بتحضير أقطاب كهربائية حادة للحقن المجهري في العصبونات باستخدام جهاز سحب الأقطاب المجهرية. اسحب الأقطاب المجهرية الزجاجية باستخدام شعيرات زجاجية رقيقة الجدران تحتوي على خيوط في داخلها. املأ كل قطب بـ 2 µL من محلول plasmid DNA fast green.يتم إجراء الحقن المجهري في محطة الحقن المجهري باستخدام رأس ماصة تحميل مجهري. تتكون محطة الحقن المجهري من منصة زجاجية كبيرة مصنعة يدويًا لتثبيت أطباق الزراعة على طاولة عزل للاهتزازات، ومجهر ستيريو مع إضاءة هالوجين خارجية، وجهاز تحكم مجهري، وحامل أقطاب مجهرية متصل بمضخة هوائية.يتم توصيل مدخل الضغط للمضخة الهوائية بخزان نيتروجين مضغوط. انقل طبق زراعة الخلايا ذو القاعدة الزجاجية من شركة matech والذي يحتوي على مستنبتات عصبونات plegia إلى محطة الحقن المجهري، ثم أدخل قطباً كهربائياً مجهرياً في حامل الأقطاب المجهرية. افحص العصبونات تحت مجهر ستيريو وأدخل طرف الماصة المجهرية في نواة الخلية.قم بتسليط نبضات ضغط قصيرة من النيتروجين بمدة تتراوح من 10 إلى 100 milliseconds وبضغط 20 pounds per square inch حتى تصبح النواة خضراء بشكل متجانس. احضن الخلايا لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة واحفظها عند درجة حرارة أربع degrees Celsius حتى الاستخدام. يُستخدم مجهر Zeiss LSM five 10 confocal inverted مع عدسة axia avert. 200 لتصوير كل من خلايا SF nine والعصبونات الحسية من plegia.يتم عرض تصوير العصبونات الحسية في هذه الفيديو. يمكن العثور على تفاصيل تصوير خلايا SF nine في البروتوكول المكتوب. استخدم ليزر argon بقدرة 30 milliwatts مع مخرج ليزر بنسبة 50% لتصوير PKC المسمى ببروتين EGFP.بعد ذلك، قم بتخفيف خط ليزر Argonne إلى مخرج نفاذية بنسبة 4%. ثم اضبط الثقب الدبوسي (pinhole) على القيمة واحد، وثبّت طبق المزرعة على منصة التصوير وتجنب الحركة أو الاهتزاز. قم بإزالة 1 mL من وسط المزرعة من الطبق بلطف باستخدام ماصة سعة 10 mL واترك حجماً إجمالياً قدره 1 mL.في الطبق، حدد القسم الأوسط من الخلايا حيث يمكن رؤية النواة. قم بإعداد سلسلة زمنية تتكون من 10 إلى 20 صورة مجهرية بؤرية (confocal images) بفواصل زمنية قدرها 30 ثانية.ابدأ تشغيل الفيديو، وبعد التقاط الصورة الثانية، حفز عملية الانتقال عن طريق إضافة 1 mL من الدواء بتركيز مضاعف بلطف. أضف الدواء قطرة تلو الأخرى فوق الخلايا بشكل مستمر لمدة 30 ثانية تقريبًا. يُستخدم هنا السيروتونين لتحفيز انتقال سريع، والذي يمكن رؤيته مباشرة بعد المعالجة بالدواء.تحدث بعض الأدوية انتقالاً بطيئاً يكون في ذروته فقط بعد 5 إلى 10 دقائق من المعالجة، لذا يتم غسل الدواء باستخدام ماصتين سعتُهما 10 milliliter، وذلك عن طريق سحب محلول الغسيل بلطف باستخدام ماصة واحدة على أحد جانبي الطبق وسحب الوسط من الجانب الآخر. إذا كانت عملية الغسل فعالة وكان تأثير الدواء عكوساً، فسيعود PKC إلى السيتوسول خلال 30 إلى 60 ثانية. احفظ المقطع كملف LSM كما هو موضح.فيما يلي النتائج التمثيلية للتصوير الحي لانتقال PKC في العصبونات الحسية لـ plegia. تم التعبير عن E-G-F-P-P KC APL two في عصبون حسي، وتم تسجيل سلسلة من 10 صور بؤرية في فواصل زمنية قدرها 30 ثانية. في هذا المثال، تمت إضافة السيروتونين إلى الطبق بعد 30 ثانية من التسجيل.في هذا المثال، يتم عرض التصوير الحي لانتقال PKC في خلايا SF nine. تم التعبير المشترك عن E-G-F-P-P KC APL one و M-R-F-P-P KC APL two في خلايا SF nine، وتم تسجيل سلسلة من 10 صور بؤرية في فواصل زمنية قدرها 30 ثانية. One two DIOCTYL SN glycerol.تمت إضافة نظير لنفاذية الخلايا من DYL glycerol إلى الطبق بعد 30 ثانية من التسجيل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن pkcs الموسومة بفلوريسنت في عصبونات الحس في aplasia، وكيفية تصوير انتقال PKC في الخلايا الحية.

live-imaging-pkc-translocation-sf9-cells-aplysia-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

في هذا الفيديو ، ونحن تصف طريقة لتصوير الخلايا الحية لتقسيم الخلايا الاصلية غير متماثلة الحسية والجهاز سليمة في خلايا...

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

نبين كيف يمكن تغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة وفعالية متشابك رصد في وقت واحد في إعداد...

رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وفعالية متشابك في الرخويات<em&gt; Aplysia</em

المصدر: Jongbloets, B. C., . تصور بروتين كيناز نشاط في الفئران التي تتصرف برأس ثابت باستخدام الفحص المجهري للتصوير المضان ثنائي الفوتون في الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2019) } يوضح هذا الفيديو إجراء فحص مجهري للتصوير مدى الحياة المضان ثنائي الفوتون لتصور نشاط بروتين كيناز A في الفئران التي تتصرف برأس ثابتة أثناء الحركة القسرية.

تصور بروتين كيناز نشاط في الفأر باستخدام الفحص المجهري للتصوير الفلوري ثنائي الفوتون مدى الحياة 

هنا نقدم الرواية كا 2+ -imaging النهج باستخدام مراسل إضاءة الحيوية. يستخدم هذا النهج تنصهر بناء GFP-aequorin الذي يربط الكالسيوم 2+ وتنبعث الضوء، مما يلغي الحاجة لالإثارة الخفيفة. كبير يسمح هذا الأسلوب التصوير المستمر الطويل، والوصول إلى هياكل الدماغ العميقة وقرار زمنية عالية.

في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin

ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وداخل الخلايا. وهنا أصف على بروتوكول في فيفو تسجيل وتحليل للنقل محواري وإينترافلاجيلار في C. ايليجانس.

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

يتم تقديم إجراء لتصور أنشطة البروتين كيناز A في الفئران الثابتة الرأس، وتتصرف. يتم التعبير عن مراسل نشاط A-kinase محسنة، tAKARα، في الخلايا العصبية القشرية وجعلها في متناول للتصوير من خلال نافذة الجمجمة. يتم استخدام اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية لتصور أنشطة PKA في الجسم الحي أثناء الحركة القسرية.

تصور البروتين كيناز نشاط في الفئران يتصرف الرأس ثابتة باستخدام في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتصوير النشاط السكاني للخلايا العصبية بدقة خلية واحدة في الأنواع غير اللافقارية غير المعدلة وراثيا باستخدام الأصباغ الحساسة لجهد الامتصاص ومجموعة الصمام الثنائي الضوئي. ويتيح هذا النهج سير عمل سريع، حيث يمكن متابعة التصوير والتحليل على مدار يوم واحد.

التصوير البصري المستند إلى الصمامات الثنائية الضوئية لتسجيل ديناميكيات الشبكة بدقة أحادية الخلايا العصبية في اللافقاريات غير المعدلة وراثيا

يصف هذا البروتوكول تطبيقات تعطيل العينة باستخدام جلطات الفيبرين، والحد من الانجراف، والسماح بإضافة الكواشف وغسلها أثناء التصوير الحي. يتم نقل العينات إلى قطرة من الفيبرينوجين تحتوي على وسيطة الثقافة على سطح غطاء، وبعد ذلك يتم تحريض البلمرة عن طريق إضافة الثرومبين.

تطبيقات شل حركة أنسجة الدروزوفيلا مع جلطات فيبرين للتصوير الحي

يتم وصف طريقتين مرتبطتين لتصور الأحداث تحت الخلوية المطلوبة للانتقال المشبكي. تمكن هذه البروتوكولات من المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات تدفق الكالسيوم قبل المشبكي واندماج غشاء الحويصلة المشبكية باستخدام تصوير الخلايا الحية للخلايا العصبية المستزرعة في المختبر .

قياس الفلورسنت في الوقت الحقيقي للوظائف المشبكية في نماذج التصلب الجانبي الضموري

تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا تدريجيا حول كيفية استخدام نظام متكامل متعدد الوظائف وقابل للبرمجة من قبل المستخدم يمكن التصوير التلقائي متعدد القنوات والتحليل الميكانيكي البيولوجي لتوضيح الحساسية الميكانيكية للبروتين المرتبط ب Yes (YAP).

استجواب علم الأحياء الميكانيكي البصري الشامل للبروتين المرتبط ب Yes في السرطان البشري والخلايا الطبيعية باستخدام نظام متعدد الوظائف

نوضح هنا كيفية الجمع بين نقل الخلايا العصبية للقوارض الحصين الأولية مع التصوير البؤري للخلايا الحية لتحليل التأثيرات المرضية التي يسببها البروتين على النقل المحوري وتحديد المسارات الميكانيكية التي تتوسط هذه الآثار.

استخدام تصوير الخلايا الحية لقياس آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري في الخلايا العصبية الحصينية الأولية

اكتشف تصوير إزفاء PKC في الخلايا الحية باستخدام مجهر المسح بالليزر لدراسة ديناميكيات البروتين في الوقت الفعلي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات الإشارة الخلوية في الخلايا العصبية.

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

استكشف المزيد من الفيديوهات