تحت الجلد من العدوى المكورات العنقودية المذهبة المقاومة للميثيسيلين (MRSA)

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص بقاء وانتشار المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين أو MA بالإضافة إلى مستويات الكيموكين والسيتوكين في مواقع الإصابة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الفراء من ظهور الفئران للسماح بمنطقة واضحة من المراقبة. كخطوة ثانية.

سيتم إعطاء MRSA في معلق للفئران تحت الجلد بعد ثلاثة أيام من الإصابة ، ويمكن تقييم أمراض العدوى ، ويمكن تقييم تعداد البكتيريا من خلال تحديد عدد وحدات تكوين المستعمرة من متجانسات الأنسجة على ألواح أجار. مرحبًا، كيف حالك؟ اسمي دي لوردون.

أنا باحث ما بعد. مرحبا ، اسمي مارييل سانشيز. أنا طالب دكتوراه وأنا أندريا هدى.

أنا باحث مشارك ، نحن جزء من مختبر جورج لي في قسم طب الأطفال في مركز سيدار سيناي الطبي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الطبي ، مثل نمذجة العدوى الشديدة ، بما في ذلك التهاب العضلات والتهاب العضلات المتعدد واللفافات الناخرة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للعدوى الطارئة الشديدة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على نظام آخر مثل المكورات العقدية من المجموعة أ والكائنات الحية الأخرى.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا دراسة وظيفة الكائنات الحية الأخرى التي تسبب التهاب العضلات والتهاب العضلات. بشكل عام ، قد يواجه الأفراد الجدد في هذا الإجراء صعوبة لأن أحد موظفي المنظم العالمي لمناطق التجمع الحزبي قابل للتغيير بدرجة كبيرة. إذا لم يتم توخي الحذر ، فقد يكون للبيانات التي تم جمعها تباين كبير مما سيؤدي إلى صعوبة تفسير البيانات في التاريخ.

هيا بنا نبدأ. في منشأة BSL two ، قم بإعداد صفيحة أجار دم الأغنام في قاعدة TSA وحلقة معقمة باستخدام كتلة مجمدة. انقل ثقافة Mercer للمخزون من تخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر.

ثم باستخدام الحلقة المعقمة ، اكسر شريحة صغيرة من الثلج من ثقافة المخزون على الطبق. بعد الحصول على شريحة صغيرة من ثقافة مخزون Mercer ، انقل ثقافة المخزون على الفور إلى الفريزر لتجنب الذوبان لأن التجميد والذوبان المتكرر سيضر بثقافة المخزون. استخدم الحلقة لرسم خط الأجار لتسهيل نمو مستعمرات ميرسر الفردية.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها بدون مكمل CO2. في اليوم التالي. قم بإعداد وتسمية كل من بيضة الدم الورقية الجديدة ، ولوحة TSA ، وأنبوب غطاء المفاجئ سعة 15 مليلتر مع ثلاثة ملليلتر من THB.

استرجع لوحة M SSA المستزرعة بين عشية وضحاها وافحص النمط الظاهري الانحلالي للمستعمرات. باستخدام حلقة معقمة ، اختر مستعمرة لها نمط ظاهري يتوافق مع المستعمرات التجريبية السابقة. قم بتلقيح THB بالمستعمرة المحددة باستخدام نفس خط الحلقة.

تحتضن اللوحة محلول THB عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع الاهتزاز بمعدل 220 دورة في الدقيقة. سيتم استخدام هذه البكتيريا لتلقيح المزرعة للعدوى تحت الجلد للفئران في خطوات لاحقة. ضع صفيحة أجار الدم في الحاضنة أيضا.

سيتم استخدام اللوحة في صباح اليوم التالي للتأكد من أن النمط الظاهري الانحلالي للبكتيريا في محلول THB يتطابق مع النمط الظاهري للبكتيريا المختارة في الأصل. إذا كان النمط الظاهري لانحلال الدم غير متوافق مع الاستنساخ الأصلي ، فلا تبدأ التجربة. انقل الماوس إلى منصة واحلق الفراء من ظهره.

إذا كان شديد العدوانية ، فقد يكون من الضروري التخدير باستخدام الفلور. ضعي ما يقرب من خمسة ملليمترات مكعبة من كريم مزيل الشعر مثل NA على المنطقة المحلوقة. يمكن شراء NA من الصيدلية المحلية.

تأكدي من شراء كريم إزالة الشعر الذي يحتوي على زيت الأطفال لأن المنتج الذي لا يحتوي على زيت الأطفال سيكون محفزا جدا للفئران. اتركي الكريم يحتضن على سطح الجلد لمدة دقيقة واحدة تقريبا بينما يحتضن كريم مزيل الشعر بلل بعض المناشف الورقية بالماء المقطر المزدوج بعد دقيقة. استخدم المناشف الورقية المبللة لمسح المنطقة المحلوقة نظيفة.

تأكد من خلو الجلد من كريم إزالة الشعر قم بتسخين 10 مل من THB في أنبوب غطاء لولبي سعة 50 مليلتر عند 37 درجة مئوية في حاضنة بكتيريا لمدة أربع إلى 10 ساعات. انقل 20 ميكرولترا من ثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها إلى THB الدافئ. سيؤدي ذلك إلى تخفيف المرتكز بين عشية وضحاها.

تعليق عند واحد إلى 500. ضع الأنبوب عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز بمعدل 220 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين ونصف إلى ثلاث ساعات تقريبا بعد فترة الحضانة. استخدم المزيد من THB لتخفيف التعليق البكتيري إلى واحد إلى 10 وقياس التعليق باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

مع امتصاص عند 514 نانومتر. استمر في إعادة احتضان التعليق عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز بمعدل 220 دورة في الدقيقة حتى يصل التعليق المخفف من واحد إلى 10 إلى 0.25. لجمع جهاز الطرد المركزي M er ، أنبوب 50 مليلتر عند 3 ، 225 ضعف الجاذبية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، تخلص من Resus.

قم بتعليق اللوحة البكتيرية في 10 ملليلتر من DPBS واغسل البكتيريا مرة أخرى عن طريق تكرار خطوة الطرد المركزي لنموذج العدوى الشديدة هذا. إعادة تعليق الحبيبات البكتيرية في ما يقرب من واحد مليلتر من DPBS مما ينتج عنه ما يقرب من واحد في 10 إلى 10 وحدات تشكيل مستعمرة لكل مليلتر. تجميع دم الأغنام لوحات A-R-T-S-A تمييع البكتيريا بشكل متسلسل من 10 إلى واحد إلى 10 إلى ثمانية أضعاف في لوحة DPBS.

10 قطرات ميكرولتر من المعلق البكتيري المخفف بشكل متسلسل على صفيحة أجار الدم في ثلاث نسخ. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد احتضان الألواح لمدة 16 إلى 18 ساعة ، راقب وسجل النمط الظاهري لانحلال الدم لللقاح.

عد وحدات تشكيل المستعمرة على اللوحات. سيتم حساب العدوى العينية بناء على وحدة تشكيل المستعمرة. الرقم على اللوحات.

تحضير حقنة بها 100 ميكرولتر من المعلق البكتيري في DPBS المحضرة مسبقا. قبل الحقن ، يجب تخدير الفئران بحيث يكون معدل تنفسها مرة واحدة في الثانية. لأغراض العرض التوضيحي ، يظهر فأر قتل رحيم في هذا الفيديو.

حقن M ser في جناح واحد بعد الحقن. انقل الماوس مرة أخرى إلى قفصه. راقب لمدة ثلاث إلى خمس ساعات بعد الحقن للتأكد من أن الفأر على قيد الحياة قبل نقله مرة أخرى إلى غرفة.

راقب الآفات الموجودة على ظهور يوميا بعد التضحية بالحيوانات. قياس وتسجيل حجم وحالة الآفات على الجلد. يتم قياس كل من مناطق آفة الجلد والعضلات بضرب طول وعرض الآفة بالمليمترات.

يجب تقسيم الآفات غير المنتظمة الشكل إلى قطع متناظرة أصغر وقياس كل قطعة بنفس الطريقة. قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من DPBS لجمع الأنسجة. قم بتقطيع الجلد بشفرة حلاقة معقمة واستئصال الآفة بمقص معقم.

عند استئصال الآفة ، تأكد أيضا من استئصال ما يقرب من ملليمترات إلى خمسة ملليمترات من الجلد السليم المحيط بالمنطقة. ضع الآفة في أنابيب تجميع الأنسجة لتحليل آفات العضلات. قشر الجلد بعناية لقياس الحجم وتسجيل حالة الآفة على الأنسجة العضلية.

اجمع الطحال والكلى. ضع هذه المناديل في أنابيب التجميع الفردية الخاصة بها. تجانس الأنسجة عن طريق التحريك باستخدام حقنة مليلتر واحد لمدة 30 ثانية تقريبا.

أضف 900 ميكرولتر من DPBS إلى كل أنبوب. قم بتجميع ألواح THA ، ودوامة عينات الأنسجة المتجانسة لمدة خمس دقائق. تمييع العينة بشكل متسلسل.

تميل التعليق إلى واحد إلى 10 إلى ستة أضعاف. في عام 96 ، توزع ألواح الآبار 10 ميكرولتر من كل تعليق مخفف بشكل متسلسل على الألواح. احتضان الصفائح في حاضنة بكتيريا 37 درجة مئوية طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، قم بحساب وحدات تشكيل المستعمرة من الصفائح واحسب عدد وحدات تشكيل المستعمرة بناء على عوامل التخفيف. إذا تم إجراء العدوى بشكل صحيح ، ملاحظة فقاعة على سطح الجلد مباشرة بعد الحقن تحت الجلد. إذا لم يلاحظ أي فقاعة ، فقد يكون الحقن عميقا جدا ، مما قد يؤثر على نتيجة العدوى.

يمكن تقييم حجم الآفة وبقاء البكتيريا في نقاط مختلفة بعد الإصابة ب MSA. تم فحص الآفات الجلدية التالية في اليوم الثالث بعد الإصابة وهي أمثلة على آفة على قرص مضغوط فأر واحد مصاب على جناح واحد مع واحد في 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة السبع. توجد آفات عضلية عادة في الأنسجة الموجودة أسفل الآفات الجلدية.

فيما يلي أمثلة على آفات سطح العضلات المتزامنة لصور الآفات الجلدية المعروضة سابقا. هذه هي الآفات العضلية التي لوحظت في اليوم الثالث بعد الإصابة في فأر مصاب بواحد في 10 إلى الوحدات السبع المكونة للمستعمرة. يتم تحديد منطقة الآفة على أنها طول الآفة مضروبة في عرض الآفة كما تم قياسها بالمليمترات ويمكن قياسها لتقييم تلف أنسجة الجلد.

يمكن قياس عدد الوحدة المكونة للمستعمرة من البكتيريا الموضعية في موقع العدوى على آفات المكسوة. يمكن أن يشير عدد وحدات تكوين المستعمرة إلى ما إذا كان عامل الفوعة يوفر ل MSA ميزة البقاء على قيد الحياة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام احتياطات السلامة القياسية بسبب استخدام الإبر والميكروبات شديدة الإمراض باتباع هذا الإجراء.

أخيرا ، يمكن استخدام نموذج الخراج الذي نستخدمه 1 ، 000 ضعف أقل من العين مقارنة بنموذجنا للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي عوامل S التي تعزز عدوى RSA المستمرة؟ لا تنس أن العمل مع محاقن مملوءة بالمريخ A يمكن أن يكون خطيرا للغاية والاحتياطات مثل التخلص من المحقنة مباشرة في الحاد ، من المهم تجنب الطعن العرضي بالإبرة. أيضا ، في هذه التجربة ، من المهم اتباع بروتوكولات BS O2 القياسية لضمان التطهير المناسب لمنطقة العمل.

هذا كل شيء. شكرا للمشاهدة. مرحبا ، وداعا.