تحت الجلد من العدوى المكورات العنقودية المذهبة المقاومة للميثيسيلين (MRSA)

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص بقاء وانتشار بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين أو MRSA، بالإضافة إلى مستويات الكيموكينات والسيتوكينات في مواقع العدوى. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الفراء من ظهور الفئران لإتاحة منطقة واضحة للملاحظة. وكخطوة ثانية.

سيتم إعطاء بكتيريا MRSA في معلق للفئران عن طريق الحقن تحت الجلد بعد ثلاثة أيام من العدوى، ويمكن تقييم الأمراض الناتجة عن العدوى والتعداد البكتيري عن طريق تحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات من متجانسات الأنسجة على أطباق الآجار. مرحباً، كيف حالك؟ اسمي دي لوردون.

أنا باحثة ما بعد الدكتوراه. مرحباً، اسمي مارييل سانشيز. أنا طالبة دكتوراه، وأنا أندريا هدى.

أنا باحث مشارك، ونحن جزء من مختبر جورج لي في قسم طب الأطفال في مركز سيدار سناي الطبي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجال الطبي، مثل نمذجة العدوى الشديدة، بما في ذلك التهاب العضلات، والتهاب العضلات المتعدد، والتهاب اللفافة الناخر. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول حالات العدوى الطارئة الشديدة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل العقديات من المجموعة A وكائنات أخرى.

بالإضافة إلى ذلك، يمكننا دراسة وظيفة وإمراضية الكائنات الأخرى التي تسبب التهاب العضلات والتهاب العضلات المتعدد. بشكل عام، قد يواجه الأفراد المبتدئون في هذا الإجراء صعوبة لأن أحد المنظمات العالمية لمناطق التجمع في الطاقم يتسم بقابلية عالية للطفرات. وإذا لم يتم اتخاذ الاحتياطات اللازمة، فقد تظهر البيانات التي تم جمعها تبايناً ملحوظاً، مما سيؤدي إلى صعوبة في تفسير هذه البيانات.

لنبدأ العمل. في مرفق من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL 2)، قم بتحضير طبق أغار دم الغنم بقاعدة TSA وعروة تعقيم باستخدام كتلة تجميد. انقل مزرعة Mercer المخزنة من وحدة التخزين عند درجة حرارة -80 °C.

بعد ذلك، وباستخدام الحلقة المعقمة، قم بفصل شظية صغيرة من الثلج من المزرعة الأصلية ووضعها على الطبق. وبمجرد الحصول على شظية صغيرة من المزرعة الأصلية لبكتيريا Mercer، انقل المزرعة الأصلية فوراً إلى المجمد لتجنب ذوبانها، لأن عمليات التجميد والإذابة المتكررة ستؤدي إلى تلف المزرعة الأصلية. استخدم الحلقة لتخطيط الآجار بما يحفز نمو مستعمرات Mercer فردية.

يتم تحضين الطبق عند 37 درجة Celsius طوال الليل دون إضافة CO2. وفي اليوم التالي، قم بتجهيز وتسمية كل من طبق blood egg جديد، وطبق TSA، وأنبوب snap cap سعة 15 milliliter يحتوي على ثلاثة milliliters من THB.

استرجع طبق M SSA الذي تم تحضينه طوال الليل وافحص النمط الظاهري لتحلل الدم للمستعمرات. وباستخدام عروة تعقيم، اختر مستعمرة ذات نمط ظاهري يتوافق مع المستعمرات التجريبية السابقة. قم بتلقيح وسط THB بالمستعمرة المختارة باستخدام نفس طريقة التخطيط بالعروة.

تُحضن صفيحة محلول THB عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع الرج بسرعة 220 دورة في الدقيقة. ستُستخدم هذه البكتيريا لتلقيح المزرعة لإحداث عدوى تحت الجلد في الفئران في الخطوات اللاحقة. ضع صفيحة أغار الدم في الحاضنة أيضاً.

سوف تُستخدم الطبقة في صباح اليوم التالي للتأكد من أن النمط المظهري لتحلل الدم للبكتيريا في محلول THB يتطابق مع النمط المظهري للمستعمرة المختارة في الأصل. إذا لم يكن النمط المظهري لتحلل الدم متسقاً مع المستنسخة الأصلية، فلا تبدأ التجربة. انقل الفأر إلى منصة وقم بحلاقة الفراء عن ظهره.

إذا كان الحيوان عدوانياً للغاية، فقد يكون من الضروري تخديره باستخدام isof fluorine. ضعي ما يقرب من خمسة مليمتر مكعب من كريم إزالة الشعر، مثل NA، على المنطقة المحلوقة. يمكن شراء NA من الصيدلية المحلية.

تأكد من شراء كريم إزالة الشعر الذي يحتوي على زيت الأطفال، لأن المنتج الخالي من زيت الأطفال سيكون محفزاً للغاية لبشرة الفئران. اترك الكريم ليتفاعل على سطح الجلد لمدة دقيقة واحدة تقريباً، وأثناء فترة تفاعل كريم إزالة الشعر، قم بترطيب بعض المناشف الورقية بالماء المقطر المزدوج بعد مرور دقيقة. استخدم المناشف الورقية المبللة لمسح المنطقة المحلوقة وتنظيفها.

تأكد من خلو الجلد من كريم إزالة الشعر، ثم قم بتدفئة مسبقة لـ 10 milliliters من THB في أنبوب سعة 50 milliliter بغطاء لولبي عند 37 degrees Celsius في حاضنة بكتيرية لمدة تتراوح من أربع إلى 10 ساعات. انقل 20 microliters من المزرعة البكتيرية التي نمت طوال الليل إلى THB الذي تمت تدفئته مسبقًا؛ حيث سيؤدي ذلك إلى تخفيف تركيز merc التي نمت طوال الليل.

معلق بنسبة 1 إلى 500. ضع الأنبوب عند درجة حرارة 37 °C في حضانة هزازة بسرعة 220 دورة في الدقيقة لمدة تتراوح تقريبًا بين ساعتين ونصف إلى ثلاث ساعات. بعد فترة التحضين، استخدم المزيد من وسط THB لتخفيف المعلق البكتيري بشكل أكبر إلى نسبة 1 إلى 10، ثم قم بقياس المعلق باستخدام جهاز spectrophotometer.

مع قياس الامتصاصية عند 514 نانومتر. استمر في تحضين المعلق عند 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 220 دورة في الدقيقة حتى يصل المعلق المخفف بنسبة 1 إلى 10 إلى 0.25. ولجمع M er، قم بإجراء عملية الطرد المركزي للأنبوب سعة 50 مليلتر عند 3,225 ×g لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية، ثم تخلص من الراسب العلوي وأعد تعليق المادة.

قم بتعليق الراسب البكتيري في 10 milliliters من DPBS واغسل البكتيريا مرة أخرى بتكرار خطوة الطرد المركزي لهذا النموذج من العدوى الشديدة. أعد تعليق الراسب البكتيري في ملليلتر واحد تقريبًا من DPBS، مما ينتج عنه ما يقرب من 1 × 10¹⁰ وحدة تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر. قم بتجهيز أطباق A-R-T-S-A بدم الأغنام وقم بتخفيف البكتيريا تسلسليًا من 10⁻¹ إلى 10⁻⁸ في DPBS ثم وزعها على الأطباق.

ضع قطرات بحجم 10 µL من المعلق البكتيري المخفف تسلسلياً على طبق آجار دم في ثلاث مكررات. حضّن الأطباق عند 37 °C طوال الليل. بعد تحضين الأطباق لمدة تتراوح بين 16 إلى 18 ساعة، افحص وسجل النمط الظاهري لتحلل الدم للملقح.

قم بعدّ الوحدات المكونة للمستعمرات على الأطباق. سيتم حساب اللقاح المعدي بناءً على عدد الوحدات المكونة للمستعمرات الموجودة على الأطباق.

قم بتحضير حقنة تحتوي على 100 µL من المعلق البكتيري في DPBS الذي تم تحضيره مسبقاً. قبل الحقن، يجب تخدير الفئران بحيث يكون معدل تنفسها حوالي مرة واحدة في الثانية. ولأغراض العرض، يظهر في هذا الفيديو فأر تم القضاء عليه رحمةً.

احقن M ser في أحد الجانبين بعد الحقن. انقل الفأر مرة أخرى إلى قفصه. راقب الحيوانات لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس ساعات بعد الحقن للتأكد من أن الفأر على قيد الحياة قبل نقله مرة أخرى إلى غرفة الحيوانات.

راقب الآفات الموجودة على ظهور الحيوانات يومياً بعد تضحية الحيوانات. قم بقياس وتسجيل حجم وحالة الآفات الموجودة على الجلد. يتم تقدير مساحة الآفات في كل من الجلد والعضلات عن طريق ضرب طول الآفة في عرضها بالمليمترات.

يجب تقسيم الآفات غير منتظمة الشكل إلى قطع متماثلة أصغر حجمًا وقياس كل قطعة بنفس الطريقة. قم بتجهيز أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter تحتوي على 100 µL من DPBS لجمع الأنسجة. قم بعمل شق في الجلد باستخدام شفرة حلاقة معقمة واستأصل الآفة باستخدام مقص معقم.

عند استئصال الآفة، تأكد من استئصال ما يقرب من 2 إلى 5 ملم من الجلد السليم المحيط بالمنطقة أيضاً. ضع الآفة في أنابيب جمع الأنسجة لتحليل آفات العضلات. قم بإزالة الجلد بعناية لقياس الحجم وتسجيل حالة الآفة في النسيج العضلي.

اجمع الطحال والكليتين. ضع هذه الأنسجة في أنابيب جمع فردية خاصة بها. قم بتجنيس الأنسجة عن طريق التقليب باستخدام سرنجة سعة 1 mL لمدة 30 ثانية تقريباً.

أضف 900 µL من DPBS إلى كل أنبوب. قم بتجهيز أطباق THA وقم بخلط عينات الأنسجة المتجانسة باستخدام جهاز vortex لمدة خمس دقائق. ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي للعينة.

تتراوح المعلقات من 1 إلى 10⁶ ضعفاً. في أطباق ذات 96 بئراً، يتم توزيع 10 µL من كل معلق مخفف تسلسلياً على الأطباق. تُحضن الأطباق في حاضنة بكتيرية عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل.

في صباح اليوم التالي، قم بعدّ الوحدات المكونة للمستعمرات من الأطباق واحسب عدد الوحدات المكونة للمستعمرات بناءً على عوامل التخفيف. إذا تم إجراء العدوى بشكل صحيح، ستظهر فقاعة على سطح الجلد مباشرة بعد الحقن تحت الجلد. أما إذا لم تظهر فقاعة، فقد يكون الحقن عميقاً جداً، مما قد يؤثر على نتيجة العدوى.

يمكن تقييم حجم الآفة وبقاء البكتيريا على قيد الحياة في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة بـ MSA. تم فحص الآفات الجلدية التالية في اليوم الثالث بعد الإصابة، وهي تمثل أمثلة لآفة على فأر من سلالة CD one تم إصابته في جانب واحد بـ 1×10⁷ وحدة تشكيل مستعمرة. وعادة ما توجد الآفات العضلية في الأنسجة الموجودة أسفل الآفات الجلدية.

فيما يلي أمثلة على آفات سطح العضلة المتزامنة مع صور آفات الجلد التي عُرضت سابقاً. هذه الآفات العضلية لوحظت في اليوم الثالث بعد الإصابة في فأر تم حقنه بـ 1×10⁷ وحدات تشكيل مستعمرات. يتم تحديد مساحة الآفة على أنها الطول مضروباً في العرض للآفة مقاساً بالملليمترات، ويمكن قياسها لتقييم تلف أنسجة الجلد.

يمكن تقدير عدد الوحدات المكونة للمستعمرات للبكتيريا المتمركزة في موقع العدوى على الآفات المستأصلة. ويمكن أن يشير تعداد الوحدات المكونة للمستعمرات إلى ما إذا كان عامل الضراوة يمنح MSA ميزة للبقاء. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام احتياطات السلامة القياسية نظرًا لاستخدام الإبر والميكروبات شديدة الإمراض المتبعة في هذا الإجراء.

وأخيراً، يمكن استخدام نموذج الخراج بجرعة تلقيح أقل بـ 1,000 ضعف مقارنة بنموذجنا للإجابة على أسئلة إضافية، مثل: ما هي عوامل S التي تعزز استمرار عدوى RSA؟ لا تنسَ أن التعامل مع محاقن مملوءة بـ Mars A يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ومن الضروري اتخاذ احتياطات مثل التخلص من المحقنة مباشرة في حاوية الأدوات الحادة لتجنب الوخز العرضي بالإبرة. كما أنه من المهم في هذه التجربة اتباع بروتوكولات BSO2 القياسية لضمان التطهير السليم لمنطقة العمل.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة. مرحباً. مرحباً، وداعاً.