التحول من الحمض النووي البلازميد في كولاي استخدام أسلوب الصدمة الحرارية

مرحبا ، أنا أليكس هوج. أعمل في صالة الألعاب الرياضية في مختبر قاعة الصالة الرياضية في قسم علم وظائف الأعضاء والفيزياء الحيوية في جامعة كاليفورنيا في إيرفين. واليوم سأوضح لكم كيفية تحويل الإشريكية القولونية المختصة كهربائيا بطريقة كل صدمة.

لذلك أستخدم اليوم هذه التقنية لتحويل القولونية باستخدام منتج الإحباط الخاص بي لأنني أقوم بإجراء عملية للقيام ببعض التركيب الكامل في أسماك الزرد. حسنا ، سنبدأ في إجراء التحول. لذلك تحتاج أولا إلى الحصول على حمام مائي أو حافلة جافة عند 42 درجة.

يجب أن يكون لديك بكتيريا أخرجتها للتو من المدينة الرئيسية في الجليد. اليوم نستخدم خلايا الكفاءة الكهربائية من المجالات وكذلك الحمض النووي الخاص بك في الجليد. تحتاج أيضا إلى أنبوب من وسائط SOC في درجة حرارة المنزل أو 37 وأطباقك من LV بالإضافة إلى وسائط المضادات الحيوية.

والآن سأضيف الحمض النووي مع البكتيريا. لذلك أعمل بجانب اللهب حتى لا تلوث البكتيريا. لذلك أضيف الإحباط مع البكتيريا.

إنها 50 ميكرولترا من البكتيريا ثم تعود إلى الجليد على الفور ، يمكنك النقر عليها قليلا لخلط البكتيريا والحمض النووي الخاص بك وتتركها لمدة تصل إلى 15 دقيقة في الجليد. لقد مرت الآن 15 دقيقة ونحن مستعدون لإجراء الصدمة الحرارية ، وهي وضع البكتيريا عند 42 درجة لمدة 45 ثانية. لذلك أخرج الأنابيب من الجليد مباشرة عند ضبط 42 درجة ، 30 مؤقتا و 45 ثانية ، ثم أعيدها إلى الجليد بسرعة كبيرة وأضعها من 42 مباشرة على الجليد.

ثم ننتظر لمدة دقيقتين. لذا سأقوم الآن بإضافة وسائط SOC إلى البكتيريا وأضعها عند 37 لمدة 30 دقيقة. لذلك أقوم بتدخينها 500 ميكرولتر من وسائط SOC ووضعتها في البكتيريا ووضعها في غرفتي المؤقتة الصغيرة.

لذلك إذا كنت ستستخدم أنابيب eend وغرفة مؤقتة للحاضنة الخاصة بك ، فتأكد من وضع أنابيب eend أفقية لأنها ستهتز بشكل أفضل من هذا القبيل. حتى الآن نحن على استعداد لوضع الأنابيب في شاكر. لهذا السبب لدينا هذه الغرفة الصغيرة عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة.

لقد انتهينا الآن من الحضانة عند 37 درجة وسنقوم بوضع البكتيريا على رطل بالإضافة إلى المضادات الحيوية. لذلك في حالتي هو الكلورال. لذلك في أنا 50 ميكرولتر من كل عينة ووضعها على اللوحة.

لذلك مع 500 ميكرولتر المتبقية ، تقوم بتدويرها في سطح طاولة صغير ، والبعض يرفض من أجل تقشيرها البكتيريا. لذلك بعد التركيب نحصل على حبيبات لطيفة وما سنفعله الآن هو إزالة جميع وسائط SOC تقريبا ، فقط اترك 50 ميكرولتر وبعد ذلك يمكننا طلاء 50 ميكرولتر من البكتيريا المركزة. لذلك أدفع ما يقرب من 450 ميكرولتر.

أنا فقط أترك هذا كثيرا. حتى الآن سأقوم بتعليق البليت في 50 ميكرولتر متبقي من وسائط SOC. وبعد ذلك يمكنني وضع هذا 50 ميكرولتر على طبق آخر.

لذلك أقاوم كل منصة نقالة ، ثم أقوم بدمرها وقمت بإعدادها. لذلك سيكون هناك في النهاية صفيحتان لكل عينة. لذا علينا الآن نشر البكتيريا على صفيحة LB.

لذلك سأستخدم بعض الخرز الزجاجي الأوتوكلاف ، ولكن يمكنك أيضا استخدام أنبوب ماضي تقوم بتشكيله في موزعة من هذا القبيل. لذلك سأضع القليل من الخرز على طبق بتري. أحب ذلك.

حسنا ، 10 15. لذلك بعد إضافة الخرزات ، تضع كل أطباقك في كومة كهذه وتهزها برفق حتى تنشر الخرزات البكتيريا في كل مكان بالتساوي على الأطباق. لذلك بينما أحرك الأطباق حتى تجف.

لذلك ، مما يعني أنه لا يجب أن ترى خطوطا كبيرة من السائل عند التحرك بالخرز. على سبيل المثال ، في تلك اللوحة ، تميل الخرزات إلى الانهيار معا ورؤية الكثير من الخطوط. إنه عرق أن تتحرك الخرزات بحرية ، وتلك جافة.

حتى الآن الجفة الألواح حتى نتمكن من التخلص من الخرز. لذلك أذهب إلى السحب من هذا القبيل حتى تتمكن من إعادة تدويرها. والآن سنضع اللوحة في الحاضنة في الساعة 37 بين عشية وضحاها ، وتضع الألواح رأسا على عقب بعد 12 ساعة من الحضانة في 37 ، نخرج اللوحة من الحاضنة.

وكما نرى ، لدينا عدد أقل من المستعمرات في اللوحة حيث أقوم بصفيحها 50 ميكرولتر مقارنة باللوحة التي قمت فيها بطلاء الباقي. المهم عند تحويل البكتيريا هو أن يكون لديك الكمية المناسبة من المستعمرات على طبقك ، والكثافة المناسبة. لذلك في هذا المكان لديك عدد قليل جدا من المستعمرات ، ولكن إذا كنت تريد المزيد من المستعمرات ، فيمكنك الحصول على مثال جيد في هذه اللوحة حيث تكون الكثافة الصحيحة تماما ، حوالي 100 مستعمرة لكل طبقة.

هذه اللوحة هي مثال سيء لأن هناك الكثير من المستعمرات ولا يمكنك اختيار مستعمرات فردية. لذلك أوضحت لكم للتو كيفية تحويل الإشريكية القولونية عن طريق كل تحويل. لذا فإن الجانب المهم جدا في هذه التقنية هو الحفاظ على كل شيء أو باردا قبل الصدمة.

ثم 45 ثانية طبيعية ، وأكثر عند 42 درجة في الجليد. ثم يجب أن يكون كل شيء آخر في درجة حرارة دافئة أو 37 درجة. حتى الآن سأقوم بفحص مستعمراتي عن طريق فحص PCR.

لذا فإن إحدى النقاط المهمة أيضا هي أن يكون لديك لوحا. أولا ، نتوقع أن يكون لدينا الكثير من المستعمرات وتلك المستعمرات الأقل. والمهم هو أن تكون أطباقك جافة جدا باستخدام الخرز أو الأنبوب الماضي.

شكرا للمشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تأكيد الحجز الخاص بك.