التحول من الحمض النووي البلازميد في كولاي استخدام أسلوب الصدمة الحرارية

مرحباً، أنا أليكس هوغ. أعمل في مختبر جیم هول في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا، إيرفاين. وسأوضح لكم اليوم كيفية تحويل بكتيريا e coli ذات الكفاءة الكهربائية باستخدام طريقة الصدمة الكهربائية.

سأستخدم اليوم هذه التقنية لتحويل بكتيريا coli باستخدام ناتج عملية الـ lation، وذلك لأنني أقوم بإجراء تجربة للقيام بـ whole mount ization في أسماك zebrafish. حسنًا، سنبدأ الآن عملية التحويل. أولاً، يجب تجهيز الحمام المائي أو الحمام الجاف عند درجة حرارة 42 °C.

يجب وضع البكتيريا التي أخرجتها للتو من المزرعة الرئيسية في الثلج. نستخدم اليوم خلايا ذات كفاءة كهربائية من ities وكذلك الحمض النووي DNA الخاص بك في الثلج. تحتاج أيضاً إلى أنبوب من وسط SOC في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية، وأطباقك التي تحتوي على وسط LV مضافاً إليه المضاد الحيوي.

سأقوم الآن بإضافة الحمض النووي DNA إلى البكتيريا. سأعمل بجانب اللهب لتجنب تلوث البكتيريا. لذا، سأضيف المحلول الذي يحتوي على البكتيريا.

نضيف 50 µL من البكتيريا ثم نعيدها فوراً إلى الثلج، ويمكنك هز الأنبوب قليلاً لخلط البكتيريا مع الـ DNA الخاص بك، وتترك لمدة تصل إلى 15 دقيقة في الثلج. لقد مرت الآن 15 دقيقة ونحن مستعدون لإجراء الصدمة الحرارية، وهي وضع البكتيريا عند 42 °C لمدة 45 ثانية. لذا، أخرج الأنابيب من الثلج وأضعها مباشرة في درجة حرارة 42 °C، مع ضبط المؤقت على 45 ثانية، ثم أعيدها إلى الثلج بسرعة كبيرة، حيث يتم نقلها من 42 °C إلى الثلج مباشرة.

ثم ننتظر لمدة دقيقتين. والآن سأضيف وسط SOC إلى البكتيريا وأضعها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. لذا، سأقوم بسحب 500 µL من وسط SOC وأضيفها إلى البكتيريا ثم أضعها في حجرتي الصغيرة المؤقتة.

لذا، إذا كنت ستستخدم أنابيب eend وغرفة مؤقتة للحضانة، فتأكد من وضع أنابيب eend بشكل أفقي لأنها ستُرج بشكل أفضل بهذه الطريقة. والآن أصبحنا مستعدين لوضع الأنابيب في جهاز الرج. ولهذا السبب لدينا هذه الغرفة الصغيرة عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة.

لقد انتهينا الآن من عملية التحضين عند 37 درجة، وسنقوم بزراعة البكتيريا على أطباق lb تحتوي على مضادات حيوية. في حالتي، المضاد المستخدم هو chloral. لذا، سأقوم بنقل 50 µL من كل عينة ووضعها على الطبق.

وباستخدام الـ 500 µL المتبقية، يتم إجراء عملية طرد مركزي باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لترسيب البكتيريا. وبعد عملية الطرد المركزي، نحصل على ركازة جيدة، وما سنقوم به الآن هو إزالة معظم وسط SOC، مع ترك 50 µL فقط، ومن ثم يمكننا زراعة الـ 50 µL هذه من البكتيريا المركزة. لذا قمت بسحب 450 µL تقريباً.

سأترك هذه الكمية فقط. الآن سأقوم بتعليق الراسب في الـ 50 µL المتبقية من وسط SOC. وبعد ذلك، يمكنني توزيع هذه الـ 50 µL على طبق آخر.

لذا، أقوم بمسح كل طبق، ثم استخلاصه وتوزيعه على أطباق أخرى. وبذلك، سيكون هناك في النهاية طبقان لكل عينة. والآن، يتعين علينا نشر البكتيريا على طبق LB.

سأستخدم بعض الخرزات الزجاجية المعقمة بجهاز الأوتوكلاف، ولكن يمكنكم أيضاً استخدام أنبوب بلاستيكي يتم تشكيله كأداة نشر بهذا الشكل. سأقوم بوضع عدد قليل من الخرزات في طبق بتري؛ فأنا أفضل هذه الطريقة.

حسناً، 10 15. لذا، بعد إضافة الخرزات، ضع جميع الأطباق في كومة بهذا الشكل ورجّها برفق لتوزيع الخرزات والبكتيريا بالتساوي في جميع أنحاء الأطباق. وأنا أقوم بتحريك الأطباق حتى تجف.

وهذا يعني أنه لا ينبغي أن ترى خطوطاً كبيرة من السوائل عند تحريك الخرزات. على سبيل المثال، في تلك الصفيحة، تميل الخرزات إلى التكتل معاً ويظهر الكثير من الخطوط. أما في تلك الأخرى، فتتحرك الخرزات بحرية، وهي الجافة.

الآن جفت الأطباق، لذا يمكننا التخلص من الخرزات. سأقوم بسحبها بهذا الشكل حتى تتمكن من إعادة تدويرها. الآن سنقوم بوضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية طوال الليل، مع وضع الأطباق مقلوبة. وبعد 12 ساعة من الحضن عند 37 درجة مئوية، نخرج الطبق من الحاضنة.

وكما نرى، يوجد عدد أقل من المستعمرات في الطبق الذي استزرعت فيه 50 µL مقارنة بالطبق الذي استزرعت فيه الكمية المتبقية. من المهم عند إجراء عملية تحويل البكتيريا الحصول على العدد المناسب من المستعمرات في الطبق، أي الكثافة الصحيحة. لذا، في هذا الطبق يوجد عدد قليل جداً من المستعمرات، ولكن إذا كنت ترغب في الحصول على مستعمرات أكثر، يمكنك رؤية المثال الجيد في هذا الطبق حيث الكثافة صحيحة تماماً، أي حوالي 100 مستعمرة لكل طبق.

تعتبر هذه الطبقة مثالاً سيئاً بسبب وجود عدد كبير جداً من المستعمرات، مما يجعل من المستحيل التقاط مستعمرات فردية. لذا، فقد أوضحت لكم كيفية تحويل e coli من خلال كل عملية تحويل. إن الجانب الأكثر أهمية في هذه التقنية هو الحفاظ على برودة كل شيء على الثلج قبل عملية الصدمة.

ثم 45 ثانية في الظروف العادية، ثم فترة أطول عند 42 درجة مئوية، وبعد ذلك تُعاد إلى الثلج. ومن ثم يجب أن تكون جميع الخطوات الأخرى في درجة حرارة دافئة أو 37 درجة مئوية. والآن سأقوم بفحص المستعمرات الخاصة بي عن طريق فحص PCR.

لذا، تكمن إحدى النقاط أيضاً في توفير طبقين؛ حيث نتوقع في أحدهما ظهور عدد كبير من المستعمرات، وفي الآخر ظهور عدد أقل. ومن المهم جداً أن تكون الأطباق جافة تماماً باستخدام الخرز أو الماصة.

شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في عملية التأكيد الخاصة بكم.