الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

الهدف العام من هذا الإجراء هو استنتاج الانتحاء الفيروسي في مريض مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق تسلسل المنطقة الخامسة الثلاثة من جين الغلاف الفيروسي لبدء استخراج H-I-V-R-N-A من بلازما دم المريض. بعد ذلك ، قم بتضخيم المنطقة الخامسة الثلاثة من فيروس نقص المناعة البشرية GP واحد 20 باستخدام R-T-P-C-R المتداخلة. ثم حدد وجود المنتج باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ، متبوعا بالتسلسل السكاني لمنتجات V المضخمة الثلاثة.

أخيرا ، قم بتحليل التسلسلات باستخدام برنامج الاستدعاء الأساسي واستنتاج استخدام المستقبلات المشتركة باستخدام خوارزمية الجينوم إلى الفينو. في النهاية ، يمكن أن تظهر هذه النتائج ما إذا كانت القوة الفيروسية للمريض هي R five أو غير R خمسة من خلال التسلسل السكاني لحلقة فيروس نقص المناعة البشرية الثلاثة. لذا فإن الميزة الأساسية لهذه التقنية هي فحص القوات على الطرق الحالية مثل المقايسات القائمة على الخلايا المظهرية هي أنه يمكن إجراؤها في أي مختبر مجهز بجهاز تسلسل لتقليل التكلفة في فترة زمنية أقل مع مواد أولية أقل.

هذه التقنية ذات صلة بالعلاج بالعلاج المضاد للفيروسات القهقرية لأنها يمكن أن تحدد ما إذا كان من المحتمل أن يستجيب السكان الفيروسيون للمريض لمضاد CCR خمسة من 500 ميكرولتر من البلازما. استخدم مستخرج آلي سهل ماج لاستخراج H-I-V-R-N-A. انتقل الآن إلى غرفة تنظيف تفاعل البوليميراز المتسلسل لإعداد R-T-P-C-R من أجل ضمان أخذ عينات كافية من السكان الفيروسيين.

خطط لإجراء كل تفاعل نسخ عكسي في ثلاث نسخ في هذا التفاعل بخطوة واحدة. استخدم الحمض النووي الريبي الفيروسي لتصنيع CDNA ، وتضخيم المنطقة الثلاثة لفيروس نقص المناعة البشرية على وجه التحديد باستخدام SQV ثلاثة F1 و CO 6 0 2 الإصلاح الرئيسي. بناء على مكونات كل تفاعل.

اصنع محلولا لمزيج المخزون كافيا لعدد العينات المراد تضخيمها باستخدام ماصة مكرر أضف 36 ميكرولترا من مزيج العينة إلى كل بئر من لوحة PCR. انتقل الآن إلى ماصة متعددة القنوات لتحويل ميكرولتر من مستخلص عينة الحمض النووي الريبي إلى كل بئر من الآبار المخصصة. احرص على تغيير النصائح بين كل إضافة.

بمجرد اكتمال النقل ، قم بتغطية الآبار بأغطية شريط PCR. ثم ضع لوحة PCR في جهاز تدوير حراري مبرمج لخطوة واحدة R-T-P-C-R من المنطقة الثلاثة لفيروس نقص المناعة البشرية. بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل، استخدم إصلاح التمهيدي SQV three F two و CD four R.

احسب كمية الكاشف المطلوبة لعدد العينات المراد تضخيمها في غرفة نظيفة PCR. قم بإنشاء مزيج PCR المتداخل ثم استخدم ماصة مكرر لنقل 19 ميكرولترا لكل بئر من لوحة PCR نظيفة. عند الانتهاء من R-T-P-C-R ، انتقل إلى غرفة ما بعد التضخيم.

استخدم ماصة متعددة القنوات ثماني قنوات لنقل ميكرولتر واحد من قالب R-T-P-C-R إلى مزيج PCR المتداخل. قم بتغيير النصائح بين كل إضافة. قم بتغطية الآبار بأغطية شريط PCR وانقل اللوحة إلى جهاز تدوير حراري للتضخيم.

قم بإزالة اللوحة من جهاز التدوير الحراري بعد عودة درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية. من أجل التأكد من أن المنطقة الثلاثة V قد تم تضخيمها بنجاح ، قم أولا بتحليل المنتجات عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. قم بإعداد جل AROS بنسبة 1.6٪ مع صبغة جل آمنة عبر الإنترنت.

باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 10 ميكرولتر. انقل ثماني عينات ميكرولتر PCR إلى الآبار المعنية. قم أيضا بتحميل سلم الحمض النووي إلى بئر واحد على الأقل لكل صف.

قم بتشغيل الجل عند حوالي 100 فولت لمدة 10 دقائق. تصور العصابات عن طريق الأشعة فوق البنفسجية وتوثيق الصورة عن طريق التصوير الفوتوغرافي. قم بتدوين العينات التي نجحت فيها جميع عمليات التضخيم الثلاثية.

إذا لزم الأمر، كرر R-T-P-C-R لتلك العينات التي تحتوي على أقل من ثلاثة تضخيمات للمنتج. يتم التحقق من عينات CDNA الفيروسية المضخمة بشكل أكبر عن طريق تفاعلات تسلسل الحمض النووي التي سيتم إجراؤها باستخدام بادئات V 3 0 2 F و S QV ثلاثة R واحد. قم بإزالة الكاشف الكبير من الفريزر وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة.

حساب وإعداد الكواشف المطلوبة لعدد العينات المراد تشغيلها. قم بتجميع خمسة ميكرولترات من تفاعل التسلسل في آبار الصفائح المناسبة باستخدام ماصة متعددة القنوات. غطي الطبق بمنديل كيم وضعيه جانبا.

وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد تخفيف من واحد إلى 15 لمنتج PCR المضخم عن طريق إضافة 180 ميكرولترا من الماء المعقم إلى منتج PCR المتبقي. ماصة ميكرولتر واحد من العينة المخففة إلى قاع اللوحة المناسبة. تقوم الآبار دائما بتغيير النصائح بين العينات عند اكتمال نقل العينة.

أغلق اللوحة بأغطية شريطية ودوامة لمدة ثانية واحدة. لطرد اللوحة ، اضبط السرعة على 140 5G. عندما تصل سرعة الدوران إلى 140 5G ، أوقف الدوران.

ضع اللوحة في جهاز تدوير حراري حتى يستمر التفاعل. في كل بئر ، قم بترسيب الحمض النووي بأربعة ميكرولترات من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار و 40 ميكرولتر من الإيثانول المبرد بنسبة 95٪ ، وأعد إغلاق الأغطية. قم بتثبيت القشرة لمدة 10 ثوان واضغط على اللوحة لإخراج أي فقاعات هواء.

ضع الأطباق على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تتراوح بين 30 دقيقة وساعتين. استعادة الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي عند 2000 جم لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة أغطية الشريط والتخلص منها.

اقلب اللوحة فوق حاوية النفايات وصب السوبر ناتين. تخلص من أي سوبر ناتين متبقي. عن طريق مسح الألواح المقلوبة على منشفة ورقية.

قم بطي ورقتين من منشفة ورقية لشطيرة الطبق. ضع اللوحة ووجهها لأسفل في جهاز الطرد المركزي وقم بتدويرها عند 140 5 جيجا. إيقاف الدوران عندما يصل إلى 140 5G.

ثم يغسل ب 155 ميكرولتر من 95٪ من الإيثانول والصيب. ثم كرر الطرد المركزي. اترك اللوحة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق للسماح لأي إيثانول أخير بالتبخر.

من أجل تشويه طبيعة عينات الحمض النووي ، استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 10 ميكرولترات من الصبغة العالية للعبوة في جميع الآبار الموجودة على اللوحة ، بما في ذلك تلك الفارغة. أغلق الطبق بفتحة إنتان وضعه في جهاز تدوير حراري على حرارة 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أخيرا ، ضع لوحة العينة في لوحة التسلسل وفي جهاز التسلسل.

أحد الطرق المقبولة لتحليل البيانات هو استخدام استدعاء البرنامج لإجراء مكالمات أساسية تلقائية دون تدخل بشري. الاستدعاء هو برنامج اتصال مجاني قائم على التخصيص ، وقم بتسجيل الدخول وحدد نماذج من الملفات لتحميلها باستخدام خيار التصفح. حدد موقع ملف بيانات التسلسل الخام وقم بتحميل ما يصل إلى 20 ميغابايت.

بعد ذلك ، اضبط التسلسل المرجعي على V ثلاثة. انقر فوق معالجة البيانات. حدد المجلد الناتج على الجانب الأيسر من الصفحة لإظهار قائمة العينات.

تلك الحمراء قد فشلت. تلك التي هي خضراء قد مرت. من خلال النقر على عينة معينة وزر العرض ، يمكنك مراجعة التسلسل ، واتباع التعليمات الموجودة على الجانب الأيمن من الصفحة للتنقل عبر التسلسل ، وتنزيل الملفات في مجلد مضغوط.

يمكن استنتاج الانتحاء الفيروسي من التسلسلات الناتجة عن التسلسل القائم على السكان باستخدام خوارزمية المستقبلات المشتركة من الجينو إلى الفينو. من القائمة المنسدلة للإعداد المهم ، حدد الأمثل بناء على تحليل البيانات السريرية من التحفيز 2٪ و 5.75٪ FPR. اختر الآن تحميل أو لصق تسلسل للتحليل.

ملفات FASTA مقبولة. لا تضيف إجراءات أخرى للحصول على متنبئ جينو Tono FPRA للاستجابة لخصوم CCR الخمسة. يوفر تقرير G two P الذي تم إنشاؤه تسلسل V ثلاثي الحلقات في الأحماض الأمينية ويشير إلى المواضع ذات الصلة من الطفرات المرتبطة ب non R five باستخدام الفيروس.

في الجزء السفلي من التقرير ، يتم إعطاء المعدل الإيجابي الخاطئ وتفسيره من حيث الاستجابة لخصم CCR الخمس. يمكن تنزيل هذا التقرير كملف PDF. إذا تم الاستدلال على أن أيا من التسلسلات الثلاثة من العينة غير R خمسة ، فمن غير المحتمل أن يستجيب المريض لمضاد CCR الخامس كما هو متوقع الرحلان الكهربائي الهلامي ل RTP تشير تضخيمات RTP CR لفيروس نقص المناعة البشرية إلى أنه لا تنتج جميع العينات السريرية منتجا.

يمكن تصور التسلسلات التي تم إنشاؤها من العينات المضخمة في مخطط كروماتوغرامي يقرأ عن طريق الاستدعاء. من المتوقع تسلسل نظيف مع القليل من الخلائط. في بعض الأحيان قد تكون التسلسلات فوضوية وغير قابلة للتخصيص الأساسي الدقيق.

قد يتم تحديد بعض المرضى على أنهم غير مصابين ب CCR خمسة باستخدام الفيروس كما هو موضح هنا. من غير المحتمل أن يستجيب هؤلاء المرضى للعلاج باستخدام مضاد CCR الخمس. ومع ذلك ، وجد أن غالبية المرضى لديهم مجموعة فيروسية تتكون من CCR خمسة باستخدام الفيروس كما هو موضح في المربع الأخضر في الجزء السفلي من تقرير تحليل G two P.

لذلك بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون أربعة أيام تقريبا من البداية إلى النهاية. هذا من الاستخراج إلى التحليل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التنبؤ بالانتحاء الفيروسي باستخدام طرق التسلسل المستندة إلى السكان جنبا إلى جنب مع خوارزمية المعلوماتية الحيوية للجينومات فينو.

حسنا ، هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.