توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

الهدف العام من هذا الإجراء هو التوسيع السريع لأعداد كبيرة من خلايا NK البشرية. ابدأ في المختبر (Ex vivo) بعزل p BMCs أو خلايا NK من طبقة buffy coat أو عينة دم كاملة. بعد ذلك، يتم إجراء زراعة مشتركة لـ pbmc مع خلايا اصطناعية مقدمة للمستضد في عملية توسيع خلايا NK.

يتم استكمال الوسط الغذائي بـ IL-2 للحفاظ على مستنبت الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) لمدة ثلاثة أسابيع مع التحفيز الأسبوعي باستخدام a PCs، مع الحرص على إبقاء عدد الخلايا القاتلة الطبيعية أقل من 1×10⁶ لكل ملليلتر من المستنبت. وأخيراً، يتم التحقق من الفعالية الوظيفية للخلايا القاتلة الطبيعية التي تم تكثيرها باستخدام مقايسة السمية الخلوية غير الإشعاعية. وينتج عن مخطط التكثير هذا عائد نموذجي من الخلايا القاتلة الطبيعية يصل في وسطه إلى تكثير بمقدار 21,000 ضعف في نهاية 21 يوماً، وتظهر هذه الخلايا سمية خلوية عالية ضد أورام مختلفة وفقاً لما تم تحديده من خلال مقايسة تحرر الكالسيوم.

يمكن لهذا المقطع الطبي أن يساعد في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال بيولوجيا الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell)، وذلك لأن الحصول على أعداد كبيرة من هذه الخلايا كان صعباً للغاية تاريخياً. ولهذه التقنية انعكاسات على العلاج المناعي للسرطان البشري، نظراً لأن إنتاج ما يكفي من الخلايا القاتلة الطبيعية لمثل هذا العلاج كان صعباً للغاية في السابق. ستقوم سيسيل، مساعد البحث الأقدم في مختبري، بتوضيح هذه التقنية للحصول على الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) من دم متبرعين أصحاء.

عادةً ما يتم استخدام طبقة البافي كوت (Buffy coat) من بنك الدم كمصدر. أولاً، أضف PBS لضبط حجم طبقة البافي كوت إلى 140 milliliters. بعد ذلك، ضع 35 milliliters من العينة فوق 15 milliliters من fial PA لإجراء الفصل المتدرج بواسطة جهاز الطرد المركزي عند 400 G لمدة 20 minutes.

بدون كسر الطبقة الفاصلة. استعد بعناية الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (P BMCs) من الواجهة الفاصلة بين البلازما وFial PA، واحتفظ بأنبوب خلايا الدم الحمراء (RBCs) لاستخدامه لاحقاً. اغسل P BMCs ثلاث مرات باستخدام PBS مع إجراء الطرد المركزي في كل مرة عند 400 G لمدة 10 دقائق.

استخدم هذا الجزء من خلايا P BMCs لتوسيع خلايا NK. والآن عد إلى أنبوب التدرج. قم بشفط الطبقة العلوية.

انقل خلايا RBCs إلى أنبوبي طرد مركزي سعة 50 milliliter واغسلها باستخدام PBS المضاف حتى علامة 50 milliliter. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي عن طريق قشط الجزء العلوي من طبقة RBCs؛ وذلك لإزالة الخلايا المحببة.

قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل، ثم أعد تعليق خلايا RBC في حجم مساوٍ من محلول else، واحفظها في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد. يمكن استخدام جزء RBC هذا لتنقية خلايا NK باستخدام طريقة roset SEP في نهاية أسبوعين من التوسيع. لتوسيع خلايا NK الوظيفية بكفاءة خارج الجسم الحي، تُستخدم خلايا K 5 62 clone nine المرتبطة بغشائياً بـ IL 21، والتي سيشار إليها فيما يلي باسم K 5 62.

تُستخدم خلايا Clone nine IL 21 كخلايا اصطناعية مقدمة للمستضد؛ أولاً، يتم عدّ خلايا pbmc وحساب الحجم اللازم للحصول على 5×10⁶ خلية ليتم استزراعها من أجل توسيع خلايا NK. لكل 5×10⁶ خلية pbmc، يتم تشعيع 10×10⁶ خلية من K 5 62 clone nine IL 21 باستخدام جهاز تشعيع غاما بجرعة 100 Gy. يمكن أيضاً تجميد الخلايا المشععة لاستخدامها مستقبلاً. الآن، تُغسل الخلايا المشععة مسبقاً بمحلول PBS وتعاد تعليقها في وسط توسيع خلايا NK.

الآن، قم بإضافة الخلايا المشععة إلى خلايا pbmc بنسبة اثنين إلى واحد في 40 milliliters من وسط توسيع خلايا NK، ثم ضع قارورة T 75 بشكل عمودي في حضانة عند 37 degrees Celsius و 5%carbon dioxide. في اليوم الثالث، قم باستعادة الخلايا المحفزة عن طريق الطرد المركزي عند 400 G لمدة خمس دقائق، واستبدل نصف الوسط بوسط NKEM جديد وواصل الزرع. كرر عملية تغيير الوسط في اليوم الخامس. في نهاية الأسبوع الأول، قم بعدد الخلايا واحتجز 5 × 10⁵ خلية لتحديد النمط الظاهري باستخدام قياس التدفق الخلوي؛ أما بالنسبة للتحفيز الثاني، فقم بعدد وإشعاع خلايا K 5 62 بنسبة واحد إلى واحد.

قم باستنساخ تسع خلايا IL 21 لتوسيع عدد خلاياها، ثم اجمع الخلايا في وسط توسيع خلايا NK بتركيز 2.5 × 10⁵ خلية إجمالية لكل ملليلتر. الآن ضع الخلايا في دوارق T 75 واستمر في استزراعها؛ وفي اليومين 10 و12، قم بنقل الخلايا في وسط توسيع خلايا NK بتركيز 2.5 × 10⁵ خلية لكل ملليلتر. وفي اليوم 14 من التوسيع، قم بتعداد الخلايا مرة أخرى وتحديد النمط الظاهري لعينة منها بواسطة قياس التدفق الخلوي.

قم بتنقية هذا التوسع الخلوي المشتق من PBMCs باستخدام بروتوكول تنقية rosette SEP، وتحقق من نقاء خلايا NK عن طريق التنميط الظاهري باستخدام قياس التدفق الخلوي. قم بإجراء تحفيز ثالث على خلايا NK المنقاة باستخدام نسبة واحد إلى واحد من خلايا K 5 62 clone nine IL 21 المشعة. وأخيراً، في اليوم 21، قم بتحليل خلايا NK المضعفة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام لوحة أجسام مضادة كاملة للتنميط الظاهري.

قم بتجميد مخزونات الخلايا في وسط FBS يحتوي على 10% DMSO بكثافة قصوى تبلغ 5×10⁷ خلية لكل أنبوبة. استخدم خلايا NK إما طازجة أو مجمدة لاختبار السمية الخلوية. في حال استخدام خلايا NK المجمدة، قم أولاً بإذابة أنبوبة من خلايا NK وزرعها في وسط NKEM لمدة 24 ساعة للسماح بتعافي الخلايا في يوم الاختبار، ثم أعد تعليق 10⁶ من الخلايا المستهدفة في 1 ml من وسط NKEM المحتوي على calcium am وحضنها لمدة ساعة واحدة عند 37 °C مع الرج من حين لآخر في طبق UBO ذو 96 بئراً، ثم أضف في ثلاث مكررات 200 µL من خلايا NK المعلقة بكثافة 1×10⁶ خلية لكل ml وقم بإجراء تخفيف تسلسلي للخلايا كما هو موضح.

بعد مرور ساعة واحدة من تحميل الكالسيوم، تُغسل الخلايا المستهدفة في وسط توسيع خلايا NK مرتين عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 400 G. الآن، يتم إعادة عد الخلايا المستهدفة وإعادة تعليقها بتركيز 1×10⁵ خلية لكل ملليلتر. تُضاف 100 µL من الخلايا المستهدفة إلى كل بئر من أطباق الـ 96 بئر، ثم تُطرد مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 100 G لبدء تلامس الخلايا، وتُحضن عند 37 °C و 5% CO2 لمدة أربع ساعات.

من أجل تعليق الكالسيوم المتحرر بشكل متجانس، اخلط المزرعة برفق عن طريق سحب الخلايا المترسبة بالماصة عند 100 G لمدة خمس دقائق، ثم انقل 100 microliters من supernatant إلى طبق 96 well plate مسطح القاع جديد، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات، وإذا لزم الأمر، قم بتفجير أي فقاعات قد تتكون باستخدام إبرة رفيعة. اقرأ الطبق باستخدام قارئ أطباق فلوري مضبوط على مرشح إثارة 485 nanometers ومرشح انبعاث 530 nanometers.

احسب النسبة المئوية للتحلل النوعي. عادةً ما يؤدي توسيع 5 × 10⁶ من خلايا pbmc المعزولة من الطبقة البيضاء (buffy coat) إلى الحصول على ما بين 1 × 10⁹ و10¹⁰ من خلايا NK. وتعبر خلايا NK الموسعة عن مستقبلات مختلفة لخلايا NK تكون قابلة للمقارنة بخلايا NK الأولية غير الموسعة الموجودة في الطبقة البيضاء.

قد تشكل الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) من 2% إلى 18% من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) في اليوم 14. ويمكن لعملية تنقية الخلايا الممتدة باستخدام طريقة الـ Rosette SEP أن تستعيد 40% إلى 70% من الخلايا القاتلة الطبيعية الموجودة في المزرعة، بنقاء يصل إلى 99% للخلايا القاتلة الطبيعية كما يشير مؤشر CD3 السالب وCD56 الموجب. وقد أظهرت الخلايا القاتلة الطبيعية الممتدة سمية خلوية ضد مجموعة من الخطوط الخلوية الورمية، بما في ذلك الورم الأرومي العصبي، وAML، والساركوما العظمية، والميلانوما.

يظهر هنا تمثيل لعملية قتل الخلايا (A) كنسبة مئوية للتحلل النوعي. ويظهر فيديو BIOT المباشر قيام الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell) بقتل خط خلايا الورم الأرومي العصبي CHP 1 34 المحملة بالكالسيوم am. وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل إنتاج السيتوكينات بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية والنقل التكيفي في نماذج أورام حيوانية، للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بوظائف الخلايا القاتلة الطبيعية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية توسيع وتنقية أعداد كبيرة من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells). يمكن تحقيق ذلك مباشرة من الخلايا الوحيدة النواة في الدم المحيطي ثم تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية، أو يمكن بدء عملية التوسيع باستخدام خلايا قاتلة طبيعية تم تنقيتها بطريقة الروزيتا (rosette method). في البداية، تنتج طبقة الغشاء الأبيض (buffy coat) النموذجية ما بين 15 إلى 40 مليون خلية NK، والتي يمكن استخدامها جميعاً لتوسيع أعداد كبيرة جداً من الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام المخطط الموضح في هذه الطريقة.