Name: توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: تعلم طريقة توسيع وتنقية خلايا NK البشرية من خلايا PBMC باستخدام خلايا K562 المشعة وIL-2. تحقق من وظيفتها باستخدام اختبار السمية الخلوية غير المشع.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر لورانس كوبر ، Harjeet سينغ ، وHurton ينكا لعملهم في خلق K562 aAPC الأولية وناقلات mIL21 الانصهار. تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل برنامج UT أندرسون عالم طبيب ، مؤسسة Baldrick سانت ، وأساطير Friendswood.

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
<li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Klinische+Padiatrie%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li>
<li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li>
<li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li>
<li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56%2B+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li>
<li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li>
<li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets%3A+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li>
<li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li>
<li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A%2C+4-1BB+ligand%2C+and+interleukin-15%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

NK توسيع الخلايا وتنشيط وسائل الإعلام (NKEM) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90 ٪ RPMI 1640 (Cellgro) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ٪ الجنين المصل البقري (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X البنسلين / الستبرتوميسين (Cellgro) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L - 1X الجلوتامين (Gibco) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية بتعقيم وسائل الاعلام قبل الاستخدام. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / مل IL2 (Proleukin واللقاحات والتشخيص نوفارتيس ، وشركة) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- المخففة من الأسهم IU / ميكرولتر 200. إضافة إلى IL2 المبلغ المطلوب من وسائل الإعلام فقط قبل استخدام في كل مرة. </li></ul></li></ul> وPBMC NK زنزانة انفرادية <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll - Paque (GE للرعاية الصحية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Alsever محلول (سيجما) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RosetteSep خلية NK الإنسان كوكتيل التخصيب (Stemcell تكنولوجيز) </li></ul> NK الفحص الخلوي السمسة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcein - AM (Invitrogen) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأسهم هو الحل في متجر ، 1mg / مل المجمدة في 50 aliquots ميكرولتر. تذوب في وسائل الاعلام لتحقيق NKEM التخفيف المطلوب لتلوين الخلية. </li></ul></li></ul> الأضداد يتم سرد قائمة من الأجسام المضادة المستخدمة في الخلية phenotyping ناغورني كاراباخ في الجدول أدناه ؛ <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> الجسم المضاد </td><td> حجم لكل اختبار </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> أنبوب 1 </td><td valign="top"> Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC FACS العازلة اجمالى حجم التداول </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> أنبوب 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE - Cy5 CD16 اليكسا 647 FACS العازلة اجمالى حجم التداول </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> أنبوب 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE - Cy5 NKG2D APC FACS العازلة اجمالى حجم التداول </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> دينار بحريني Pharmingen R &amp; D نظم Miltenyi بيوتيك R &amp; D نظم دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> أنبوب 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE - Cy5 CD27 APC FACS العازلة اجمالى حجم التداول </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> أنبوب 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM - 1) PE CD3 PE - Cy5 CD160 Alexa647 FACS العازلة اجمالى حجم التداول </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> أنبوب 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE - Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS العازلة اجمالى حجم التداول </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان nk

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا تلعب دورا هاما في مراقبة المناعة ضد مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة المعدية والأورام. قيدت توافر محدود من الخلايا القاتلة الطبيعية والقدرة على التوسع في تطوير المختبر المناعي خلايا NK. نحن هنا تصف طريقة لتوسيع بكفاءة كميات هائلة من وظيفية NK فيفو السابقين الخلايا باستخدام الخلايا K562 معربا عن غشاء محدد IL21 ، باعتبارها خلية مستضد تقديم الاصطناعي (aAPC). وقد استخدمت العلاج بالخلايا NK بالتبني حتى الآن منتج الخلية التي حصلت عليها الدولة المستقرة leukapheresis من المانحين تليها استنفاد الخلايا التائية أو التحديد الإيجابي للخلايا NK. وعادة ما يتم تنشيط المنتج في IL - 2 ثم بين عشية وضحاها وتدار في اليوم التالي 1. بسبب التردد المنخفض من الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم المحيطي ، وقد تم تسليم عدد قليل نسبيا من الخلايا القاتلة الطبيعية في التجارب السريرية. وقد عجز لنشر الخلايا القاتلة الطبيعية في المختبر العامل المحدد لتوليد أرقام خلية كافية لنتائج سريرية الأمثل. التوسع في بعض الخلايا القاتلة الطبيعية (5-10 أضعاف على مدى 1-2 أسابيع) ويمكن تحقيقه من خلال وحده IL - 2 جرعة عالية 2. ويمكن تنشيط خلايا تي ذاتي التوسط NK توسيع الخلية ، ويفترض أيضا من خلال الافراج عن خلوى المحلية 3. يمكن أن تدعم سدى مع الوسيطة أو الخلايا الاصطناعية تقديم المستضد (aAPCs) دعم التوسع في الخلايا القاتلة الطبيعية سواء من الدم المحيطي ودم الحبل السري 4. يجري تسويق NKp46 المشتركة وتفعيل CD2 بواسطة الأجسام المضادة المغلفة الخرز للتوسع الخلايا القاتلة الطبيعية (Miltenyi بيوتيك ، صحراء كاليفورنيا) ، مما أدى إلى التوسع في ما يقرب من 100 مرات في 21 يوما. التجارب السريرية باستخدام aAPC الموسع أو تنشيط خلايا NK جارية ، واحد باستخدام خط خلية اللوكيميا CTV - 1 لرئيس الوزراء وتنشيط خلايا NK 5 دون توسع كبير. والمحاكمة الثانية تستخدم LCL - EBV للتوسع الخلية ناغورني كاراباخ ، وتحقيق التوسع يعني 490 مرات في 21 يوما 6. ثالث يستخدم لaAPC K562 المستندة transduced مع 1BBL - 4 (CD137L) و 7 غشاء محدد IL - 15 (MIL - 15) ، والتي حققت توسعا يعني NK 277 مرات في 21 يوما. على الرغم من أن الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام موسع - K562 - 41BBL mIL15 aAPC السامة للخلايا هي غاية في المختبر والمجراة مقارنة مع الخلايا القاتلة الطبيعية unexpanded ، والمشاركة في ADCC ، يقتصر انتشارها الشيخوخة التي نسبت الى تقصير التيلومير 8. وأفيد في الآونة الأخيرة توسعا 350 ضعفا من الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام K562 ميكا الإعراب ، و 4 و 9 - 1BBL IL15. وصف أسلوبنا في توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية تنتج هنا الانتشار السريع لخلايا NK الشيخوخة دون تحقيق التوسع وسيطة 21000 مرات في 21 يوما.

نحن هنا تصف طريقة لتوسيع بكفاءة وتنقية أعداد كبيرة من الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية وتقييم وظائفها.

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

تلعب الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) دوراً هاماً في المراقبة المناعية ضد مجموعة متنوعة من الكائنات الدقيقة المعدية والأورام. ونظراً لمحدودية توافر...

الهدف العام من هذا الإجراء هو التوسيع السريع لأعداد كبيرة من خلايا NK البشرية. ابدأ في المختبر (Ex vivo) بعزل p BMCs أو خلايا NK من طبقة buffy coat أو عينة دم كاملة. بعد ذلك، يتم إجراء زراعة مشتركة لـ pbmc مع خلايا اصطناعية مقدمة للمستضد في عملية توسيع خلايا NK.يتم استكمال الوسط الغذائي بـ IL-2 للحفاظ على مستنبت الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) لمدة ثلاثة أسابيع مع التحفيز الأسبوعي باستخدام a PCs، مع الحرص على إبقاء عدد الخلايا القاتلة الطبيعية أقل من 1×10⁶ لكل ملليلتر من المستنبت. وأخيراً، يتم التحقق من الفعالية الوظيفية للخلايا القاتلة الطبيعية التي تم تكثيرها باستخدام مقايسة السمية الخلوية غير الإشعاعية. وينتج عن مخطط التكثير هذا عائد نموذجي من الخلايا القاتلة الطبيعية يصل في وسطه إلى تكثير بمقدار 21,000 ضعف في نهاية 21 يوماً، وتظهر هذه الخلايا سمية خلوية عالية ضد أورام مختلفة وفقاً لما تم تحديده من خلال مقايسة تحرر الكالسيوم.يمكن لهذا المقطع الطبي أن يساعد في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال بيولوجيا الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell)، وذلك لأن الحصول على أعداد كبيرة من هذه الخلايا كان صعباً للغاية تاريخياً. ولهذه التقنية انعكاسات على العلاج المناعي للسرطان البشري، نظراً لأن إنتاج ما يكفي من الخلايا القاتلة الطبيعية لمثل هذا العلاج كان صعباً للغاية في السابق. ستقوم سيسيل، مساعد البحث الأقدم في مختبري، بتوضيح هذه التقنية للحصول على الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) من دم متبرعين أصحاء.عادةً ما يتم استخدام طبقة البافي كوت (Buffy coat) من بنك الدم كمصدر. أولاً، أضف PBS لضبط حجم طبقة البافي كوت إلى 140 milliliters. بعد ذلك، ضع 35 milliliters من العينة فوق 15 milliliters من fial PA لإجراء الفصل المتدرج بواسطة جهاز الطرد المركزي عند 400 G لمدة 20 minutes.بدون كسر الطبقة الفاصلة. استعد بعناية الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (P BMCs) من الواجهة الفاصلة بين البلازما وFial PA، واحتفظ بأنبوب خلايا الدم الحمراء (RBCs) لاستخدامه لاحقاً. اغسل P BMCs ثلاث مرات باستخدام PBS مع إجراء الطرد المركزي في كل مرة عند 400 G لمدة 10 دقائق.استخدم هذا الجزء من خلايا P BMCs لتوسيع خلايا NK. والآن عد إلى أنبوب التدرج. قم بشفط الطبقة العلوية.انقل خلايا RBCs إلى أنبوبي طرد مركزي سعة 50 milliliter واغسلها باستخدام PBS المضاف حتى علامة 50 milliliter. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي عن طريق قشط الجزء العلوي من طبقة RBCs؛ وذلك لإزالة الخلايا المحببة.قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل، ثم أعد تعليق خلايا RBC في حجم مساوٍ من محلول else، واحفظها في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد. يمكن استخدام جزء RBC هذا لتنقية خلايا NK باستخدام طريقة roset SEP في نهاية أسبوعين من التوسيع. لتوسيع خلايا NK الوظيفية بكفاءة خارج الجسم الحي، تُستخدم خلايا K 5 62 clone nine المرتبطة بغشائياً بـ IL 21، والتي سيشار إليها فيما يلي باسم K 5 62.تُستخدم خلايا Clone nine IL 21 كخلايا اصطناعية مقدمة للمستضد؛ أولاً، يتم عدّ خلايا pbmc وحساب الحجم اللازم للحصول على 5×10⁶ خلية ليتم استزراعها من أجل توسيع خلايا NK. لكل 5×10⁶ خلية pbmc، يتم تشعيع 10×10⁶ خلية من K 5 62 clone nine IL 21 باستخدام جهاز تشعيع غاما بجرعة 100 Gy. يمكن أيضاً تجميد الخلايا المشععة لاستخدامها مستقبلاً. الآن، تُغسل الخلايا المشععة مسبقاً بمحلول PBS وتعاد تعليقها في وسط توسيع خلايا NK.الآن، قم بإضافة الخلايا المشععة إلى خلايا pbmc بنسبة اثنين إلى واحد في 40 milliliters من وسط توسيع خلايا NK، ثم ضع قارورة T 75 بشكل عمودي في حضانة عند 37 degrees Celsius و 5%carbon dioxide. في اليوم الثالث، قم باستعادة الخلايا المحفزة عن طريق الطرد المركزي عند 400 G لمدة خمس دقائق، واستبدل نصف الوسط بوسط NKEM جديد وواصل الزرع. كرر عملية تغيير الوسط في اليوم الخامس. في نهاية الأسبوع الأول، قم بعدد الخلايا واحتجز 5 × 10⁵ خلية لتحديد النمط الظاهري باستخدام قياس التدفق الخلوي؛ أما بالنسبة للتحفيز الثاني، فقم بعدد وإشعاع خلايا K 5 62 بنسبة واحد إلى واحد.قم باستنساخ تسع خلايا IL 21 لتوسيع عدد خلاياها، ثم اجمع الخلايا في وسط توسيع خلايا NK بتركيز 2.5 × 10⁵ خلية إجمالية لكل ملليلتر. الآن ضع الخلايا في دوارق T 75 واستمر في استزراعها؛ وفي اليومين 10 و12، قم بنقل الخلايا في وسط توسيع خلايا NK بتركيز 2.5 × 10⁵ خلية لكل ملليلتر. وفي اليوم 14 من التوسيع، قم بتعداد الخلايا مرة أخرى وتحديد النمط الظاهري لعينة منها بواسطة قياس التدفق الخلوي.قم بتنقية هذا التوسع الخلوي المشتق من PBMCs باستخدام بروتوكول تنقية rosette SEP، وتحقق من نقاء خلايا NK عن طريق التنميط الظاهري باستخدام قياس التدفق الخلوي. قم بإجراء تحفيز ثالث على خلايا NK المنقاة باستخدام نسبة واحد إلى واحد من خلايا K 5 62 clone nine IL 21 المشعة. وأخيراً، في اليوم 21، قم بتحليل خلايا NK المضعفة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام لوحة أجسام مضادة كاملة للتنميط الظاهري.قم بتجميد مخزونات الخلايا في وسط FBS يحتوي على 10% DMSO بكثافة قصوى تبلغ 5×10⁷ خلية لكل أنبوبة. استخدم خلايا NK إما طازجة أو مجمدة لاختبار السمية الخلوية. في حال استخدام خلايا NK المجمدة، قم أولاً بإذابة أنبوبة من خلايا NK وزرعها في وسط NKEM لمدة 24 ساعة للسماح بتعافي الخلايا في يوم الاختبار، ثم أعد تعليق 10⁶ من الخلايا المستهدفة في 1 ml من وسط NKEM المحتوي على calcium am وحضنها لمدة ساعة واحدة عند 37 °C مع الرج من حين لآخر في طبق UBO ذو 96 بئراً، ثم أضف في ثلاث مكررات 200 µL من خلايا NK المعلقة بكثافة 1×10⁶ خلية لكل ml وقم بإجراء تخفيف تسلسلي للخلايا كما هو موضح.بعد مرور ساعة واحدة من تحميل الكالسيوم، تُغسل الخلايا المستهدفة في وسط توسيع خلايا NK مرتين عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 400 G. الآن، يتم إعادة عد الخلايا المستهدفة وإعادة تعليقها بتركيز 1×10⁵ خلية لكل ملليلتر. تُضاف 100 µL من الخلايا المستهدفة إلى كل بئر من أطباق الـ 96 بئر، ثم تُطرد مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 100 G لبدء تلامس الخلايا، وتُحضن عند 37 °C و 5% CO2 لمدة أربع ساعات.من أجل تعليق الكالسيوم المتحرر بشكل متجانس، اخلط المزرعة برفق عن طريق سحب الخلايا المترسبة بالماصة عند 100 G لمدة خمس دقائق، ثم انقل 100 microliters من supernatant إلى طبق 96 well plate مسطح القاع جديد، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات، وإذا لزم الأمر، قم بتفجير أي فقاعات قد تتكون باستخدام إبرة رفيعة. اقرأ الطبق باستخدام قارئ أطباق فلوري مضبوط على مرشح إثارة 485 nanometers ومرشح انبعاث 530 nanometers.احسب النسبة المئوية للتحلل النوعي. عادةً ما يؤدي توسيع 5 × 10⁶ من خلايا pbmc المعزولة من الطبقة البيضاء (buffy coat) إلى الحصول على ما بين 1 × 10⁹ و10¹⁰ من خلايا NK. وتعبر خلايا NK الموسعة عن مستقبلات مختلفة لخلايا NK تكون قابلة للمقارنة بخلايا NK الأولية غير الموسعة الموجودة في الطبقة البيضاء.قد تشكل الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) من 2% إلى 18% من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) في اليوم 14. ويمكن لعملية تنقية الخلايا الممتدة باستخدام طريقة الـ Rosette SEP أن تستعيد 40% إلى 70% من الخلايا القاتلة الطبيعية الموجودة في المزرعة، بنقاء يصل إلى 99% للخلايا القاتلة الطبيعية كما يشير مؤشر CD3 السالب وCD56 الموجب. وقد أظهرت الخلايا القاتلة الطبيعية الممتدة سمية خلوية ضد مجموعة من الخطوط الخلوية الورمية، بما في ذلك الورم الأرومي العصبي، وAML، والساركوما العظمية، والميلانوما.يظهر هنا تمثيل لعملية قتل الخلايا (A) كنسبة مئوية للتحلل النوعي. ويظهر فيديو BIOT المباشر قيام الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell) بقتل خط خلايا الورم الأرومي العصبي CHP 1 34 المحملة بالكالسيوم am. وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل إنتاج السيتوكينات بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية والنقل التكيفي في نماذج أورام حيوانية، للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بوظائف الخلايا القاتلة الطبيعية.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية توسيع وتنقية أعداد كبيرة من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells). يمكن تحقيق ذلك مباشرة من الخلايا الوحيدة النواة في الدم المحيطي ثم تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية، أو يمكن بدء عملية التوسيع باستخدام خلايا قاتلة طبيعية تم تنقيتها بطريقة الروزيتا (rosette method). في البداية، تنتج طبقة الغشاء الأبيض (buffy coat) النموذجية ما بين 15 إلى 40 مليون خلية NK، والتي يمكن استخدامها جميعاً لتوسيع أعداد كبيرة جداً من الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام المخطط الموضح في هذه الطريقة.

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

نحن هنا وصف طريقة لتفعيل وتوسيع خلايا NKT من معظم السكان الخلية باستخدام خلايا T مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC). استخدام CD1d القائم على AAPC يوفر طريقة موحدة لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا NKT الوظيفية.

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) مباشرة من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) باستخدام خط الخلايا المغذية. يتم استزراع PBMCs بشكل مشترك مع الخلايا المغذية للأرومات الليمفاوية المعدلة وراثيا التي تعبر عن إنترلوكين -21 المرتبط بالغشاء (mIL-21) ، ويتم استكمال الثقافة بالسيتوكينات إنترلوكين -2 (IL-2) وإنترلوكين -15 (IL-15). معا ، يؤدي هذا المزيج من الروابط إلى التوسع المطول لخلايا NK ذات النقاء العالي.

توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة خارج الجسم الحي

يصف هذا البروتوكول على تطوير وتوسيع والتصوير في الجسم الحي من خلايا NK المستمدة من hESCs وiPSCs.

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

نقدم هنا بروتوكولا معدلا يمكن استخدامه لتوليد عدد كبير من الخلايا التائية الطبيعية القاتلة الثابتة للفئران من طحال الفأر. يحدد البروتوكول نهجا يمكن من خلاله إثراء خلايا iNKT الطحالية وعزلها وتوسيعها في المختبر باستخدام عدد محدود من والكواشف.

والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

وصفت وهناك طريقة بسيطة وموثوق بها هنا لتحليل مجموعة من وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية مثل تحبب، خلوى والإنتاج chemokine ضمن مختلف مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية.

الفحص التدفق الخلوي استنادا لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية

ويرد هنا تدفق الخلوي طريقة لتحديد الكمية نشاط السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية.

تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

ويرد هنا وصف بروتوكول لدراسة الأحداث التي تحركها FcγRIIIa من قبل الأجسام المضادة العلاجية في الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية. تسمح منصة التحفيز الاصطناعي هذه باستجواب وظائف التأثير المصبي مثل إزالة التجريح ، وإنتاج chemokine / cytokine ، ومسارات الإشارات بوساطة أجزاء FcγRIIIa و Fc من الأجسام المضادة المشاركة في الربط.

تقييم أحداث الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية مدفوعة بمشاركة FcγRIIIa في وجود أجسام مضادة علاجية

نحن نصف بروتوكول سريع وقوي لإثراء الخلايا القاتل الطبيعي الثابت T (iNKT) من طحال الماوس وتوسيعها في المختبر إلى أرقام مناسبة للدراسات المختبرية وفي الجسم الحي.

تنقية وتوسيع الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت الماوس في المختبر وفي دراسات في الجسم الحي

هنا ، نقدم طريقة لتوسيع القاتل الطبيعي للدم المحيطي (PBNK) ، والخلايا القاتلة الطبيعية من أنسجة الكبد ، ومستقبلات المستضد الخيمري (CAR) - الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMCs) أو دم الحبل السري (CB). يوضح هذا البروتوكول توسع خلايا NK و CAR-NK باستخدام خلايا التغذية 221-mIL-21 بالإضافة إلى النقاء الأمثل لخلايا NK الموسعة.

طريقة تمدد الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) و CAR-NK باستخدام خط الخلية B المعدل بالغشاء IL-21

يوضح البروتوكول الحالي كيفية التمييز بين خلايا CD3− / CD45 + CD56 + ذات السمية الخلوية الخفيفة والخلايا الجذعية البشرية المحتملة الموسعة (hEPSCs) في ظل ظروف الاستزراع ثلاثي الأبعاد و 2D. وهذا يسمح بالتحقق من النمط الظاهري الروتيني دون تدمير البيئة المكروية المعقدة.

توليد الخلايا القاتلة الطبيعية من الخلايا الجذعية البشرية المحتملة الموسعة

تعلم طريقة توسيع وتنقية خلايا NK البشرية من خلايا PBMC باستخدام خلايا K562 المشعة وIL-2. تحقق من وظيفتها باستخدام اختبار السمية الخلوية غير المشع.

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

استكشف المزيد من الفيديوهات