طريقة بسيطة لقياس حساسية الايثانول في الذباب

مرحباً، أنا توماس مابلز من مختبر الدكتور أدريان روثن في قسم الطب النفسي بمركز جامعة تكساس ساوث ويسترن الطبي في دالاس. سأقوم اليوم بشرح إجراء بسيط لتحديد مدى حساسية الذباب للتخدير بالإيثانول. يعتمد هذا المقايسة على فقدان الذباب لمنعكس التصحيح والقدرة على المشي بعد التعرض للإيثانول.

يمكن استخدام هذا المقياس لتحديد الاختلافات في الحساسية للكحول بين سلالات مختلفة من ذباب الفاكهة (drosophila) والطفرات. كما يمكننا استخدام هذا الاختبار لتحفيز التحمل في الذباب، ويُقصد بالتحمل هنا استجابة منخفضة للكحول بعد التعرض المتكرر. لنبدأ الآن.

لهذه التجربة، ستحتاج إلى الأنابيب التالية. مع ثماني ذبابات فاكهة، من تلك التي جمعتها قبل يوم أو يومين. يمكنك إجراء التعريضات باستخدام الذكور أو الإناث.

ومع ذلك، يجب أن تحتوي كل قارورة على جنس واحد فقط. قارورة غذاء فارغة لا تحتوي على ذباب، وشفرة حلاقة، وسدادتان للقوارير مصنوعتان من مادة قطنية. إذا لم تتوفر لديك هذه الأنواع من السدادات، يمكنك أيضاً استخدام كرات قطنية، وماصة دقيقة سعة 1000 microliter مع رؤوس مخصصة لها، وإيثانول بتركيز 200 proof يحتوي على صبغة غذائية يمكن الحصول عليها من أي متجر بقالة، ومؤقت زمني.

أول ما يجب القيام به هو تجهيز غرفة تعريض، حيث سنقوم بتعريض الذباب للإيثانول ومراقبة حركيتها. ولإنشاء هذه الغرفة، ابدأ بقطع سدادة الأنبوب إلى نصفين باستخدام شفرة حلاقة، ثم ادفع أحد النصفين إلى قاع الأنبوب بحيث يغطي الغذاء.

يؤدي ذلك إلى تكوين سطح مستوٍ غير لزج لتمشي عليه الذباب. في حال استخدام كرة قطنية، اضغط عليها لأسفل بسلاسة وحاول جعلها أقل وبرية قدر الإمكان حتى لا يعلق الذباب في خيوط القطن. إذا كنت تقوم بإعداد غرف متعددة، فتأكد من أن الغذاء وسدادة الأنبوب يشغلان نفس القدر من المساحة في كل غرفة.

يضمن ذلك تعرض الذباب في كل حجرة إلى الإيثانول بنفس الحجم. ومع الممارسة، يصبح من السهل تعريض ثلاث قوارير من الذباب بشكل متوازٍ. وبمجرد تجهيز حجرات التعريض، يمكننا الآن تعريض الذباب للإيثانول.

أولاً، انقل قارورة تحتوي على ثماني ذبابات إلى غرفة تعريض، ثم أغلق الغرفة باستخدام السدادة الخاصة بالقارورة التي كانت تحتوي على الذبابات في الأصل. بعد ذلك، اسحب بالماصة 500 µL من الإيثانول المصبوغ بالتركيز الذي اخترته وضعها على أحد طرفي سدادة قارورة قطنية. ثم استبدل سدادة غرفة التعريض بالسدادة المطلية بالإيثانول، مع إدخال الطرف المطلي بالإيثانول داخل الغرفة.

ابدأ تشغيل المؤقت فور إضافة السدادة المغطاة بالإيثانول إلى غرفة التعريض. يساعد الصبغ الموجود في الإيثانول في ضمان توجيه جهة الإيثانول نحو غرفة التعريض وليس نحو جدار القارورة. وهذا أمر بالغ الأهمية خاصة عند استخدام كرات القطن بدلاً من سدادات buzz، لأن أي جانب من كرة القطن يمكن أن يواجه القارورة.

في هذه التجربة، نستخدم كحولاً بتركيز 100%، والذي ينتشر الآن في غرفة التعرض حيث تستنشقه الذباب من الهواء. سنقوم، في كل دقيقة تلي إضافة السدادة المطلية بالإيثانول إلى غرفة التعرض، بحساب عدد الذباب الذي أصبح ساكناً، وهو ما يعني عدم قدرتها على تقليب نفسها أو المشي. وكلما ظلت الذباب متحركة لفترة أطول، زادت مقاومتها عند كل فاصل زمني مدته دقيقة واحدة.

قم بإثارة الذباب عن طريق النقر على الحجرة فوق المنضدة للتأكد من أن جميع الذباب القادر على الحركة يتحرك بالفعل. راقب الذباب لمدة 10 ثوانٍ بعد النقر لمنحه الوقت لبدء الحركة أو التقليب لكل فاصل زمني مدته دقيقة واحدة. قم بتدوين عدد الذباب الساكن من بين الذباب الثمانية في بداية التجربة.

سوف تندفع معظم الذباب بسرعة إلى أعلى جانب القارورة بعد إفزاعها. وبعد حوالي ست دقائق من التعرض لـ 100% ethanol، تبدأ في التحرك ببطء وأحياناً بشكل غير منتظم بحلول الدقيقة 12. وستكون معظم الذباب ساكنة، حيث تكون غير قادرة على المشي أو تقليب نفسها عند استلقائها على ظهورهـا.

يجب إحصاء الذباب القادر على تعديل وضعيته والمشي فقط على أنه ذباب متحرك، بينما يجب إحصاء الذباب الذي يكتفي بتحريك أرجله أو أجنحته في مكانه على أنه ذباب ساكن. كما يجب إحصاء الذباب الذي يبقى على ظهره طوال فترة الملاحظة على أنه ساكن، لأن عدم قدرته على تعديل وضعيته تعد علامة على التسمم. وبالمثل، يجب إحصاء الذباب الذي يهز أجنحته بقوة طوال فترة الملاحظة البالغة عشر ثوانٍ على أنه ساكن، حتى لو تغير موقعه؛ حيث أن الغالبية العظمى من هذا الذباب تظل ساكنة بين فترات الحركة السريعة للأجنحة.

وباختصار، تُعتبر الذباب القادرة على تقليب نفسها والمشي ذباباً متحركاً، بينما يُعتبر الذباب غير القادر على التقليب، والذي يحرك أرجله وأجنحته في مكانها أو يهز أجنحته بسرعة، ذباباً ساكناً. وإذا طبقنا هذه القواعد، نلاحظ أن عدداً أكبر من ذباب النوع البري يصبح ساكناً مع زيادة دقائق التعرض لأبخرة الإيثانول. والقيمة التي يستخدمها هذا الفحص لقياس الحساسية للإيثانول هي متوسط وقت التخدير أو MST.

نُعرّف زمن السكون المتوسط (MST) بأنه عدد دقائق التعرض للإيثانول اللازمة لتصبح أربع من أصل ثماني ذباب في غرفة التعرض في حالة سكون. يتم تحديد هذه القيمة بسهولة إذا كان هناك أربع ذباب بالضبط في حالة سكون عند فترة ملاحظة محددة. على سبيل المثال، إذا كانت أربع ذباب بالضبط في حالة سكون بعد 11 دقيقة من التعرض، فإن قيمة MST تكون 11.

إذا كانت أربع ذباب بالضبط في حالة سكون بعد 11 دقيقة من التعرض، وظل الوضع كما هو حتى الدقيقة 12، يتم اعتماد القيمة الأولى لأنها تمثل الوقت الذي وصل فيه الذباب لأول مرة إلى حالة السكون (ST). أما إذا لم يكن هناك أربع ذباب في حالة سكون عند فترة ملاحظة محددة، فمن الضروري إجراء استيفاء خطي (linear interpolation) للوقت الذي أصبح عنده أربع ذباب في حالة سكون. على سبيل المثال، إذا قفز عدد الذباب الساكن من ثلاثة إلى خمسة، بين الدقيقة التاسعة والعاشرة من التعرض، يمكن تحديد أن متوسط وقت السكون (MST) هو 9.5 عن طريق التمثيل البياني. وتظهر البيانات التالية التي جُمعت باستخدام هذا المقايسة أن هذا التصميم التجريبي يعد طريقة دقيقة لقياس الحساسية للإيثانول.

تم استخدام عدد (N) يتراوح بين ست إلى ثماني قارورات في التجارب التالية، وهو ما تمت الإشارة إليه ضمن الأعمدة. يبلغ متوسط وقت البقاء (MST) للذباب من النوع البري الذكور المعرض لـ 100%Ethanol حوالي 11 دقيقة مع خطأ معياري منخفض. إن التباين اليومي منخفض وغير دال إحصائيًا في الغالب، ولكننا لا نزال نوصي بقياس العينات التجريبية والضوابط بالتوازي في اليوم نفسه.

يُرجى ملاحظة أيضاً أن الذباب الذي تعرض للمادة في اليوم A واليوم B ليسوا هم أنفسهم الأفراد ذاتهم. هؤلاء أشقاء يمثلون نفس السلالة الجينية؛ حيث لم تظهر ذباب الذكور والإناث المعرضة لـ 100%Ethanol أي اختلاف في MST. ومع ذلك، فإننا نوصي بالالتزام بجنس واحد.

إذا قمنا بتعريض ذباب الذكر والأنثى لجرعات متزايدة من الإيثانول، نحصل على منحنى استجابة للجرعة يظهر انخفاضاً ذا دلالة إحصائية في MST كدالة لزيادة تركيز الإيثانول. كما يعيد هذا الاختبار إنتاج الأنماط الظاهرية المنشورة سابقاً والتي تم قياسها باستخدام إعداد تبخير إيثانول أكثر تعقيداً؛ حيث أظهر الذباب الذي يحمل طفرة right rabbit one زيادة ملحوظة في MST. وقد لوحظت هذه الزيادة عند تركيز 100% وكذلك 90% من الإيثانول.

باستخدام هذا المقاييس، يمكننا أيضاً تحفيز وقياس تحمل الإيثانول في الذباب. ويُعرّف التحمل بأنه انخفاض في الاستجابة للكحول بعد التعرض المسبق له لتحفيز هذا التحمل. قم بتعريض قارورة من الذباب للإيثانول لمدة تعادل ضعف قيمة MST الخاصة بها تقريباً.

على سبيل المثال، نقوم بتعريض ذكور سلالة Berlin البرية هذه إلى إيثانول بتركيز 100% لمدة 24 دقيقة. وبعد تعريضها، يتم النقر بلطف لإعادة الذباب الثمانية إلى قارورة الغذاء الخاصة بها حيث تُترك للتعافي لمدة أربع ساعات. قم بتسجيل زمن الصمود في حالة التخدير (MST) الأصلي للذباب على القارورة الخاصة بها بعد أربع ساعات من التعافي، ثم أعد تعريض نفس الذباب إلى نفس الجرعة من الإيثانول وسجل زمن الصمود في حالة التخدير (MST) الثاني لها.

كما يتضح في هذا الرسم البياني، فإن زمن التخدير (MST) في التعرض الثاني للإيثانول أعلى بكثير من زمن التخدير في التعرض الأول، مما يشير إلى أن الذباب قد اكتسب تحملاً للتأثيرات المهدئة للإيثانول. ويتم حساب مقياس التحمل عن طريق قسمة زمن التخدير الثاني لمجموعة معينة من الذباب في القارورة على زمن التخدير الأول لنفس الذباب ثم طرح واحد؛ وتُعبر هذه القيمة عن نسبة التحمل المئوية، والتي تبلغ في حالتنا حوالي 50%. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجربتكم.