الطرق السريعة لنقل وتوطين مسببات المرض داخل القناة الهضمية لايم القراد
فبراير 14, 2011
دراسات بحثية لايم المرض غالبا ما تتطلب جيل من القراد المصابين burgdorferi البورلية الممرض ، وهي العملية التي عادة ما يستغرق عدة أسابيع. نحن هنا يبرهن على وجود عدوى قراد microinjection المستندة إلى الإجراء الذي يمكن أن ينجز في غضون ساعات. نظهر أيضا أسلوب المناعي للتوطين في الموقع من burgdorferi باء داخل القراد.
الهدف العام من هذا الإجراء هو الحقن الدقيق وتوطين خلايا العبارة في أمعاء القراد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الإبر الشعرية الزجاجية أولا وتعبئتها بخلايا beberg de ferry. بعد ذلك ، يتم نقل خلايا تأجيل البيبيرج إلى أمعاء القراد عن طريق الحقن المجهري.
ثم يتم تشريح القراد وإزالة أنسجة الأمعاء. أخيرا ، يتم إجراء وضع العلامات على التألق المناعي لتأجيل بيبيرج في أمعاء القراد. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح توطين بيبيرج للعبارة في أمعاء القراد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.
مرحبا ، أنا الدكتورة روث بول بول ، أستاذة مساعدة في جامعة ماريلاند في قسم الطب البيطري. اليوم ، سيظهر لك اثنان من أعضاء مختبري تورو كايرو ، زميل ما بعد الدكتوراه وآدم كولمان ، طالب الدراسات العليا ، إجراء العدوى الاصطناعية للقراد عن طريق الحقن المجهري الذي نقوم به بشكل روتيني في المختبر. بعد الحقن المجهري ، سنقوم بتشريح القراد وتصوير البكتيريا الموجودة في أمعاء القراد باستخدام مجهر CE متحد البؤر.
الميزة الرئيسية للحقن المجهري للقراد لجيل من القراد الطبيعي المصاب هي مدة الإجراء. يعمل الحقن المجهري على تقصير الإجراء بأكمله من أسابيع وساعات حيث يلزم ما يقرب من خمسة أسابيع لتوليد القراد المصاب عن طريق عملية التغذية الطبيعية. يمكن أيضا تكييف هذه التقنية لحقن كواشف مفيدة أخرى مثل الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل ل RNAi أو الأمصال المضادة لتداخل الأجسام المضادة المحددة داخل القراد.
للبدء ، قم بتصنيع العديد من إبر الحقن الدقيق عن طريق تسخين وسحب أنابيب شعرية زجاجية ملليمتر واحد في جهاز سحب زجاجي ميكروبيبيت. قم بإزالة الأنابيب الشعرية الهشة بعناية. قم بتخزين الإبر المجمعة بحيث يكون طرفها متجها لأعلى على شريط لاصق في طبق بتري.
بعد ذلك ، تنمو b berg de ferry في ثقافة BSK. متوسط إلى تركيز حوالي 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر بيليه ب بيرج دي العبارة عن طريق الطرد المركزي عند 3000 مرات G لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة snat وأعد تعليق الحبيبات تماما في وسط BSK عن طريق المرور برفق عبر طرف صغير معقم سعة 200 ميكرولتر إلى تركيز نهائي من 10 إلى الخلايا التسع لكل مليلتر.
نظرا لأن الخلايا يتم تعليقها بكثافة خلوية عالية ويمكن أن تتكتل معا ، يجب استخدام تعليق الخلية على الفور للحقن المجهري لتحضير القراد ، ووضع شريط لاصق شفاف على الوجهين على شريحة زجاجية تعمل على حصيرة لزجة ، وإزالة القراد بعناية من الحاوية باستخدام فرشاة صغيرة ، ضع العدد المطلوب من القراد ليتم حقنها على الجانب البطني للشريط اللاصق لأعلى في مواجهة نفس الاتجاه. قم بتحميل خمسة ميكرولترات من ثقافة العبارة beberg de في الإبرة الشعرية المجمعة. باستخدام حمولة صغيرة سعة 20 ميكرولتر من طرف الماصة، افحص الإبرة بحثا عن فقاعات الهواء المحتبسة وأعد تحميل الإبرة بالثقافة البكتيرية.
إذا لزم الأمر ، اعرض القراد تحت المجهر المجهري التشريح وركز على منطقة الفتحة الشرجية للقراد. المس برفق طرف الإبرة الشعرية لكسر الأنبوب حيث يكون قطره أصغر قليلا من قطر فتحة الشرج للقراد التي تشكل إبرة الحقن المجهري. هذه الخطوة حاسمة لأن أي محاولة لحقن القراد بأطراف إبرة غير مناسبة تسبب الإصابة والوفاة المحتملة.
إلى القراد المحقون. ضع القراد الثابت تحت المجهر المجهري المفصل وركز على الفتحة الشرجية المغطاة بصيحتين شرجيتين متحركتين. باستخدام ملقط دقيق ، المس برفق واضغط على أي منطقة بالقرب من فتحة الشرج واضغط على ذلك.
سيسمح ذلك بفصل الصفائح الشرجية وفتح المسام الشرجية التي تتصل بالقناة الهضمية. أدخل طرف الإبرة بعناية قليلا في الفتحة الشرجية من خلال الفتح القسري للألواح الشرجية. يجب تقليل إدخال الإبرة إلى الحد الأدنى لأن الطرف الزجاجي قد يتلف الأمعاء الخلفية شبه الشفافة التي تتصل بالمستقيم.
باستخدام حاقن صغير مجهز بالتحكم الآلي في القدم ، قم بحقن حل العبارة beberg de باستخدام المعلمات التالية. ضغط حقن 1000 هيكتور باسكال 0.2 ثانية وقت الحقن ، وثمانية ضغط تعويض هيكتور باسكال. يتلقى كل قراد حقنة واحدة بعد الحقن المجهري.
يجب أن تظهر على القراد علامات الحركة أو الزحف استجابة لمنبهات مشابهة لما قبل الحقن. لتشريح القراد للفحص المجهري المناعي ، ضع أولا قطرة من محلول ملحي مخزن بالفوسفات على شريحة زجاجية نظيفة للتشريح وأخرى على شريحة مطلية ب بولي L ليسين للفحص المجهري ، قم بإعداد شريحة زجاجية أخرى بشريط لاصق على الوجهين. بعد ذلك ، قم بإزالة القراد من الحاوية وضعه على شريط لاصق على الوجهين.
باستخدام فرشاة صغيرة تحت عرض مجهر التشريح والتركيز على القراد ، ضع شفرة حلاقة حادة على القراد بين الزوجين الأول والثاني من الساقين. اضغط لأسفل بقوة ، وقطع القراد إلى قطعتين ، وتعريض البطن على الفور غمر البطن في قطرة من PBS باستخدام ملقط دقيق. أمسك الهيكل الخارجي الظهري والبطني حول موقع القطع.
اسحب الدرع الظهري بعناية لأعلى وبعيدا عن القراد ، مما يكشف عن مسار الأمعاء البني اللون. احرص على إبقاء القراد التشريح تحت PBS في جميع الأوقات. توجد حزم الغدة السالية شبه الشفافة على جانبي المنطقة الأمامية من القناة الهضمية ويمكن إزالتها في هذه المرحلة إذا رغبت في ذلك.
أمسك الهيكل الخارجي المتبقي في مكانه باستخدام ملقط ، واسحب القناة الهضمية بعناية من البطن. نظف الأمعاء بعناية عن طريق إزالة أي أنسجة محاصرة مثل القصبة الهوائية. باستخدام طرف الملقط الناعم ، انقل أمعاء القراد بسرعة إلى قطرة من PBS على شريحة زجاجية بولي L lysine.
افصل القناة الهضمية إلى قطع أصغر باستخدام شفرات دقيقة أو بالضغط برفق بطرف الملقط الناعم. استنشق بعناية PBS الزائدة حول أنسجة الأمعاء. اسمح لأنسجة الأمعاء بتجفيف الهواء في درجة حرارة الغرفة.
قم بإصلاح أمعاء القراد عن طريق غمرها في الأسيتون لمدة 10 دقائق. اتركه يجف في الهواء ، ويمكن تخزين شرائح درجة حرارة الغرفة في هذه الخطوة لأشهر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر في حاوية محكمة الإغلاق. لوضع العلامات على الفلورسنت المناعي للأمعاء ، ارسم دائرة حول أمعاء القراد الثابتة بقلم عنق الرحم أو أي جهاز بطانة حاجز آخر كاره للماء.
سيساعد ذلك على الاحتفاظ بمحاليل التلوين أثناء خطوات الحضانة اللاحقة. قم بتغطية أمعاء القراد بقطرة واحدة أو بضع قطرات من المخزن المؤقت للانسداد لمدة 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة.
يعتمد المصل المستخدم للحجب على مصدر المضيف للجسم المضاد. لا تدع الشريحة تجف من هذه النقطة فصاعدا. استنشق ببطء المخزن المؤقت المانع.
احتضان الأمعاء بمحلول الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية المناسبة. نحن نستخدم الفلورسين أو الأيزوثيوسيانات أو FXI المسمى مضاد ب ب بيرج. تأجيل الأجسام المضادة عند التخفيف من واحد إلى 100 في المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة.
في درجة حرارة الغرفة ، قم بتغطية الحاوية بورق الألمنيوم للحد من التعرض للضوء. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة عن طريق الشفط اللطيف. احتضان الأمعاء بصبغة فلورية لتسمية أنسجة القراد مثل DPI أو يوديد البروبيديوم.
نستخدم عادة 20 ميكروغراما لكل مليلتر يوديد بيريديوم في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ونغسل ثلاث مرات مع 0.05٪ توين 20 في PBS لمدة خمس دقائق. أخيرا ، قم بتركيب الشريحة في الجلسرين المخزن الذي يحتوي على كاشف أنتيفا وقم بتغطيته بعناية بغطاء زجاجي. يمكن تخزين الشرائح الانزلاقية في هذه الخطوة لبضعة أشهر عند أربع درجات مئوية في صورة حاوية محكمة الإغلاق وعبارة مترجمة ب بيرج دي فيري تحت مجهر متحد البؤر.
يظهر هنا حقن دقيق للقراد بإبرة مملوءة باللون الأزرق اللامع كوماسي للرؤية. تستخدم الملقط الدقيق لتطبيق ضغط لطيف على الجسم ، مما يسمح بفصل الصفائح الشرجية وفتح المسام الشرجية للحقن المجهري. هنا ، تظهر المنطقة الأمامية من رتج الأمعاء مع عبارة بيبيرج داخل القناة الهضمية.
يتم تصنيف نوى الأمعاء واللولبيات باستخدام يوديد البروبيديوم أو عبارة فيتزي المترافقة المضادة لبيبيرج على التوالي. بمجرد إتقانها ، وجدنا أن 10 قراد يمكن أن تكون قوة حقن دقيقة مع بقاء مائة ألف بشكل طبيعي ومصابين ب fer. بينما يمكن استخدام القراد على الفور في تجارب أخرى ، فإننا ننتظر عموما يوما أو يومين للتأكد من بقاء القراد على قيد الحياة من الإجراء قبل المتابعة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد القراد المصاب الاصطناعي عن طريق حشرة الحاجز الدقيقة والموضعية داخل أمعاء القراد باستخدام تدفقات مناعية متحدة البؤر. مايكرو يمكن أن يكون العمل مع القراد والإبر الزجاجية الدقيقة المملوءة بمسببات الأمراض البشرية مثل زريعة البريليا بريور أمرا خطيرا أثناء العمل. كن على دراية بمواقع القراد والإبر ومارس احتياطات السلامة البيولوجية من المستوى الثاني في جميع الأوقات.
شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة قائمة على حقن المايكرو للحاقق بالقراد مع Borrelia burgdorferi، مما يقلل بشكل كبير من الوقت المطلوب لإصابة القراد. بالإضافة إلى ذلك، يتم توضيح تقنية الفحص المناعي الفلوري لتحديد موقع المُمْرِض داخل أنسجة القراد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- بيولوجيا الناقل
- تحديد موقع المُمْرِض
الخلفية
- مرض لايم يسببه البكتيريا Borrelia burgdorferi.
- القراد هي الناقلات الرئيسية لنقل هذا المُمْرِض.
- الطرق التقليدية لإصابة القراد تستهلك وقتًا طويلًا.
- يمكن لطرق العدوى السريعة تعزيز كفاءة البحث.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة أسرع لإصابة القراد بـ B. burgdorferi.
- لتمكين تحديد موقع المُمْرِض داخل أنسجة القراد في الموقع.
- لتحسين فهم تفاعلات القراد-المُمْرِض.
الطرق المستخدمة
- تحضير إبر مايكرو الشعرية الزجاجية للحقن المايكرو.
- حقن المايكرو لخلايا B. burgdorferi في أمعاء القراد.
- تشريح القراد لعزل أنسجة الأمعاء.
- الفحص المناعي الفلوري لـ B. burgdorferi في أنسجة الأمعاء.
النتائج الرئيسية
- حقن المايكرو الناجح لـ B. burgdorferi في أمعاء القراد.
- تحديد موقع المُمْرِض بشكل فعال تم إثباته من خلال الفحص المناعي الفلوري.
- تمت رؤية النتائج باستخدام المجهر المقطعي الليزري ال confocal.
- تعمل الطريقة على تقليل الوقت بشكل كبير لإصابة القراد.
الاستنتاجات
- تعتبر تقنية الحقن المايكرو بديلاً صالحًا لإصابة القراد.
- يسمح الفحص المناعي الفلوري بتحديد موقع المُمْرِض بدقة.
- يمكن أن تسهل هذه الطريقة المزيد من الأبحاث حول انتقال مرض لايم.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Borrelia burgdorferi-tick gut interactions to validate therapeutic targets involved in pathogen persistence and transmission.
- Operational Value: Delivers standardized pathogen loads across tick cohorts, reducing variability in infection models and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports functional target de-risking by allowing controlled exposure to pathogen strains, including those attenuated in murine models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates infected tick tissues suitable for downstream immunofluorescence and confocal imaging assays to quantify pathogen localization and burden.
- Operational Value: Produces quantifiable, microscopy-ready outputs that enable standardization of pathogen detection readouts across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large numbers of uniformly infected ticks, supporting assay reproducibility and platform reuse in vector-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying Borrelia burgdorferi localization in the tick gut, bridging in vitro findings to vector-based pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of pathogen distribution within tick tissues, informing hypotheses about tissue-specific virulence factors and transmission mechanisms.
- Preclinical Model Refinement: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering consistent pathogen exposure for evaluating intervention efficacy in tick-borne disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathogen-vector interactions by delivering controlled quantities of Borrelia burgdorferi to the tick gut for mechanistic interrogation.
- Screening: Produces standardized, infected tick tissues suitable for quantitative immunofluorescence assays, enhancing reproducibility in pathogen detection workflows.
- Analytics: Generates confocal microscopy-based readouts of pathogen localization and burden, enabling comparative analysis across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Connects in vitro pathogen culture to tick tissue localization, supporting biomarker alignment and pathophysiological relevance in vector-borne disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for infecting ticks with diverse biological agents, including antibodies and RNAi reagents, extending utility beyond Borrelia burgdorferi studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-vector interactions through localized pathogen detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of tick infection models, reducing time and resource investment compared to natural feeding methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency in early discovery by providing rapid, standardized pathogen exposure models for target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Lyme disease research initiatives through reliable, high-fidelity infection models that reduce biological variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques, tick handling, and confocal immunofluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary needle preparation, microinjector instrumentation, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of injection parameters and gut dissection protocols across teams to ensure consistent pathogen delivery and localization readouts.
- Adaptation to different tick species or pathogen strains may require optimization of needle size, injection pressure, and bacterial concentration.
- Practical limitations include the technical skill required for successful microinjection and gut dissection, as well as the need for biosafety level two containment when handling human pathogens.
