الطرق السريعة لنقل وتوطين مسببات المرض داخل القناة الهضمية لايم القراد

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحقن المجهري وتوطين خلايا Borrelia burgdorferi في أمعاء القراد. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير الإبر الشعرية الزجاجية أولاً وملئها بخلايا B. burgdorferi. بعد ذلك، يتم نقل خلايا B. burgdorferi إلى أمعاء القراد عن طريق الحقن المجهري.

يتم بعد ذلك تشريح القراد وإزالة أنسجة الأمعاء. وأخيراً، يتم إجراء وسم بالفلورة المناعية لـ beberg defer في أمعاء القراد. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تثبت تموضع beberg to ferry في أمعاء القراد باستخدام المجهر البؤري.

مرحباً، أنا الدكتورة روث بول، أستاذ مساعد في جامعة ميريلاند بقسم الطب البيطري. اليوم سيقوم اثنان من أعضاء مختبري، تورو كايرو، وهو زميل ما بعد الدكتوراه، وآدم كولمان، وهو طالب دراسات عليا، بعرض إجراء العدوى الاصطناعية للقراد عبر الحقن المجهري الذي نقوم به بشكل روتيني في المختبر. بعد الحقن المجهري، سنقوم بتشريح القرادة وتصوير البكتيريا في أمعاء القرادة باستخدام مجهر confocal CE.

تتمثل الميزة الرئيسية للحقن المجهري في جيل من القراد المصاب طبيعياً في مدة الإجراء؛ حيث يعمل الحقن المجهري على اختصار العملية بأكملها من أسابيع إلى ساعات، بينما يتطلب توليد قراد مصاب عن طريق عملية التغذية الطبيعية ما يقرب من خمسة أسابيع. ويمكن أيضاً تطويع هذه التقنية لحقن كواشف مفيدة أخرى، مثل الـ double stranded RNA لعملية الـ RNAi أو الأمصال المضادة (antisera) لتحقيق تداخل أجسام مضادة محددة داخل القرادة.

للبدء، قم بتصنيع عدة إبر للحقن المجهري عن طريق تسخين وسحب أنابيب شعيرية زجاجية بقطر 1 mm باستخدام جهاز سحب الماصات الزجاجية المجهرية. قم بإزالة الأنابيب الشعيرية الهشة بعناية. ثم احفظ الإبر المجمعة على شريط لاصق في طبق بتري مع توجيه الرؤوس إلى الأعلى.

بعد ذلك، يتم استزراع *B. bergdeferri* في وسط BSK حتى يصل التركيز إلى حوالي 10⁷ خلية/مل. يتم تجميع خلايا *B. bergdeferri* في صورة كرة (pellet) عن طريق الطرد المركزي بسرعة 3000 ×g لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة، يتم إزالة السائل الطافي (supernatant) وإعادة تعليق الكرة تماماً في وسط BSK عن طريق تمريرها برفق عبر طرف ماصة معقم سعة 200 µL للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10⁹ خلية/مل.

بما أن الخلايا يتم إعادة تعليقها بكثافة خلوية عالية وقد تتكتل مع بعضها البعض، فيجب استخدام المعلق الخلوي فوراً للحقن المجهري. ولتجهيز القراد، ضع شريطاً لاصقاً شفافاً مزدوج الوجه على شريحة زجاجية أثناء العمل على حصيرة لاصقة، ثم انزع القراد بعناية من الوعاء. باستخدام فرشاة صغيرة، ضع العدد المطلوب حقنه من القراد على الشريط اللاصق بحيث يكون الجانب البطني للأعلى وفي اتجاه واحد. اسحب 5 µL من مزرعة beberg de ferry داخل الإبرة الشعيرية المجمعة. وباستخدام طرف ماصة تحميل دقيق سعة 20 µL، افحص الإبرة للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة، وأعد تحميل الإبرة بالمزرعة البكتيرية.

عند الضرورة، افحص القراد تحت المجهر التشريحي ثنائي العينية وركز على منطقة الفتحة الشرجية للقراد. المس طرف الإبرة الشعرية برفق لكسر الأنبوب في النقطة التي يكون فيها القطر أصغر قليلاً من قطر الفتحة الشرجية للقراد لتكوين إبرة الحقن المجهري. تعد هذه الخطوة حاسمة، حيث أن أي محاولة لحقن القراد بأطراف إبر غير مناسبة تسبب إصابة وقد تؤدي إلى الموت.

بالنسبة للقراد المحقون، ضع القراد المكبّل تحت مجهر تشريحي ثنائي العينين وركز على الفتحة الشرجية، التي تغطيها صفيحتان شرجيتان متحركتان. وباستخدام ملقط دقيق، المس برفق وطبّق ضغطًا خفيفًا جدًا على أي منطقة بالقرب من الفتحة الشرجية.

سيتيح ذلك فصل الصفائح الشرجية وفتح المسام الشرجية التي تتصل بالأمعاء. أدخل طرف الإبرة بعناية وبشكل طفيف في الفتحة الشرجية من خلال الفتح القسري للصفائح الشرجية. يجب تقليل إدخال الإبرة إلى أدنى حد، حيث يمكن لطرف الزجاج أن يتلف الأمعاء الخلفية شبه الشفافة التي تتصل بالمستقيم.

باستخدام محقن دقيق مزود بجهاز تحكم آلي يعمل بالقدم، يتم حقن محلول beberg de ferry وفقًا للمعايير التالية: ضغط حقن 1000 Hector Pascals، ووقت حقن 0.2 seconds، وضغط تعويض قدره eight Hector Pascal's. تتلقى كل بيضة حقنة واحدة بعد عملية الحقن الدقيق.

يجب أن يظهر القراد علامات الحركة أو يزحف استجابةً للمحفزات بشكل مشابه لما كان عليه قبل الحقن. ولتشريح القراد من أجل الفحص بالمجهر الفلوري المناعي، ضع أولاً قطرة من محلول ملحي منظم بالفوسفات على شريحة زجاجية نظيفة مخصصة للتشريح، وقطرة أخرى على شريحة مغطاة بـ poly L lysine. ولأغراض الفحص المجهري، قم بتجهيز شريحة زجاجية أخرى باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه. بعد ذلك، أخرج القراد من الحاوية وضعه على الشريط اللاصق مزدوج الوجه.

باستخدام فرشاة صغيرة تحت مجهر التشريح مع التركيز على القراد، ضع شفرة حلاقة حادة على القراد بين الزوجين الأول والثاني من الأرجل. اضغط بقوة لقطع القراد إلى قطعتين، مما يؤدي إلى كشف البطن، ثم اغمر البطن فوراً في قطرة من PBS باستخدام ملقط دقيق. أمسك الهيكل الخارجي الظهري والبطني حول موقع القطع.

اسحب الدرع الظهري بعناية إلى الأعلى وبعيداً عن القراد لكشف الرتوج المعوية ذات اللون البني. احرص على إبقاء القراد الذي يتم تشريحه مغموراً في محلول PBS في جميع الأوقات. تقع حزم الغدد اللعابية شبه الشفافة على جانبي المنطقة الأمامية من الأمعاء، ويمكن إزالتها في هذه المرحلة إذا رغبت في ذلك.

أمسك الجزء المتبقي من الهيكل الخارجي في مكانه باستخدام ملقط، ثم اسحب الأمعاء بعناية من البطن. نظف الأمعاء بعناية عن طريق إزالة أي أنسجة عالقة مثل القصبات الهوائية. وباستخدام طرف ملقط دقيق، انقل أمعاء القراد بسرعة إلى قطرة من PBS على شريحة زجاجية مطلية بـ poly L lysine.

قم بتجزئة الأمعاء إلى قطع أصغر باستخدام شفرات دقيقة أو عن طريق الضغط بلطف بطرف ملقط دقيق. اشفط بعناية فائض PBS المحيط بأنسجة الأمعاء. اترك أنسجة الأمعاء لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

قم بتثبيت أمعاء القراد عن طريق غمرها في الأسيتون لمدة 10 دقائق. اتركها لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة، ويمكن تخزين الشرائح في هذه المرحلة لعدة أشهر عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في حاوية محكمة الإغلاق. ولإجراء الوسم المناعي الفلوري للأمعاء، ارسم دائرة حول أمعاء القراد المثبتة باستخدام قلم PAP أو أي أداة أخرى لرسم حاجز كاره للماء.

سيساعد ذلك في الحفاظ على محاليل الصبغ خلال خطوات الحضن اللاحقة. قم بتغطية أمعاء القراد بقطرة واحدة أو بضع قطرات من محلول الحجب (blocking buffer) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

يعتمد المصل المستخدم في عملية الحجب على مصدر الحيوان المضيف للأجسام المضادة. لا تسمح للشريحة بالجفاف من هذه النقطة فصاعداً. قم بشفط محلول الحجب ببطء.

يتم تحضين الأمعاء مع محاليل الأجسام المضادة الأولية و/أو الثانوية المناسبة. نستخدم أجساماً مضادة لـ B berg موسومة بالفلوريسين أو الإيزوثيوسيانات أو FXI. تُضاف الأجسام المضادة بتخفيف 1:100 في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة.

في درجة حرارة الغرفة، قم بتغطية الوعاء بورق ألومنيوم للحد من التعرض للضوء. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة عن طريق الشفط اللطيف. قم بتحضين الأمعاء بصبغة فلورية لوسم أنسجة القراد مثل DPI أو propidium iodide.

نستخدم عادةً 20 µg/mL من يوديد البريديوم في محلول PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم نغسل ثلاث مرات باستخدام 0.05% tween 20 في محلول PBS لمدة خمس دقائق. وأخيراً، يتم تثبيت الشريحة في جليسرول منظم يحتوي على كاشف Antifa وتغطيتها بعناية بغطاء زجاجي. يمكن تخزين الشرائح الانزلاقية في هذه الخطوة لبضعة أشهر عند 4 °C في حاوية محكمة الإغلاق، ومن ثم تصوير وتحديد موقع b berg de ferry باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope).

يظهر هنا الحقن المجهري لقرادة باستخدام إبرة مملوءة بصبغة kumasi brilliant blue لضمان الرؤية. تُستخدم ملاقط دقيقة لتسليط ضغط خفيف على الجسم، مما يسمح بفصل الصفائح الشرجية وفتح المسام الشرجي للحقن المجهري. تظهر هنا المنطقة الأمامية لرتحة معوية مع وجود beberg ferry داخل الأمعاء.

يتم وسم نوى الأمعاء واللولبيات باستخدام يوديد البروبيديوم أو مضاد beberg ferry المقترن بـ fitzy على التوالي. وبمجرد إتقان هذه العملية، وجدنا أن حقن 10 قراد مجهرياً بـ 100,000 من الفير الناجية والمصابة طبيعياً يكون كافياً. وبينما يمكن استخدام القراد فوراً في تجارب أخرى، فإننا ننتظر عادةً يوماً أو يومين للتأكد من بقاء القراد على قيد الحياة بعد الإجراء قبل المتابعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد قراد مصابة اصطناعيًا عن طريق الحقن المجهري والوضع الموضعي للحواجز داخل أمعاء القراد باستخدام التصوير المناعي متحد البؤر. إن العمل مع القراد وإبر زجاجية دقيقة مملوءة بممرض بشري مثل *Borrelia burgdorferi* قد يكون خطيرًا أثناء العمل. لذا، كن مدركًا لمواقع القراد والإبر، والتزم باحتياطات المستوى الثاني من السلامة البيولوجية في جميع الأوقات.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.