Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

يتم وصف أساليب التصوير تلألؤ بيولوجي من الالتهابات البكتيرية في الحيوانات الحية. يتم تعديل في التعبير عن مسببات الأمراض luciferase التصوير الضوئي السماح الجسم كله من الإصابات في الحيوانات الحية. يمكن أن يصاب النماذج الحيوانية مع التعبير عن مسببات الأمراض luciferase وبطبيعة الحال ينجم عن ذلك من تصور المرض في الوقت الحقيقي من خلال التصوير تلألؤ بيولوجي.

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على صورة كمية للعدوى في الحية التي يمكن أن تسمح بتوطين الكائن الحي المصاب داخل الأنسجة والأعضاء المضيفة. تصاب الفئران المخدرة أولا عن طريق القصبة الهوائية بالبكتيريا المضيئة بيولوجيا. ثم يتم حقن الفئران المصابة ب Luciferian ، مما يسمح بإجراء التصوير الحي في نظام IVIS.

بمجرد الحصول على صور الجسم بالكامل ، يتم حصاد الرئتين المصابتين. يمكن إجراء تصوير الأعضاء المعزولة لإثبات التوطين الحقيقي لمسببات الأمراض. بعد التصوير ، يتم تجانس الرئتين وطلاء التخفيف على وسط نمو البكتيريا لتقدير الحمل الميكروبي.

في النهاية ، يتم الحصول على نتائج توضح موقع وعدد مسببات الأمراض الموجودة داخل المضيف في الوقت الفعلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية هي أنه يمكن تصور مسببات الأمراض ومراقبتها في الحية عن طريق التصوير في الوقت الفعلي مما يوفر نظرة ثاقبة للتشنجات اللاإرادية المكانية للعدوى الميكروبية. سيوضح هذا الإجراء الدكتور ميهي تشانغ ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري ، و SWAT Cillo ، الباحث في مختبري.

ابدأ بداخل الصفاق ، وحقن الفئران C التي يبلغ عمرها من ستة إلى 12 أسبوعا بمحلول مخدر مخلوط يحتوي على 100 ميكروغرام من الكيتامين و 10 ميكروغرام من الزيلازين لكل جرام من وزن الفأر. ضع الفئران مرة أخرى في أقفاصها حتى يصبح التخدير ساري المفعول. لتحديد ما إذا كان التخدير قد اكتمل أم لا، اضغط على وسادة القدم لكل فأر وتأكد من عدم حدوث تفاعل انعكاسي للدواسة.

بمجرد تخدير بالكامل ، خذ فأرا واحدا وضعه على التنبيب. قف مستلقيا على ظهره. استخدم شريطا لتثبيت أرجل الماوس وذراعيه على الحامل.

ثبت شريط مطاطي في حامل التنبيب. ثم ضعه تحت القواطع العلوية للماوس. بمجرد تثبيت الفأر ، استخدم الملقط لسحب اللسان برفق من الفم.

بعد ذلك ، أدخل المنظار برفق مع منظار الأذن داخل فم الفأر وابحث عن فتحة الحنجرة ، التي تقع أمام المريء على الجانب البطني من البلعوم الفموي. بمجرد تحديد فتحة الحنجرة ، أدخل قسطرة مقاس 22 بوصة تحتوي على سلك توجيه في القصبة الهوائية حتى يصل محور القسطرة إلى القواطع. قم بإزالة سلك التوجيه وقم بتوصيل القسطرة بالمضخة البلاستيكية.

ثم ادفع الهواء إلى القسطرة. سوف ينتفخ صدر الفأر إذا كان التنبيب صحيحا. بمجرد التأكد من الوضع الصحيح للقسطرة ، قم بإدخال 50 ميكرولتر من المحلول البكتيري المضيء بيولوجيا بالتركيز المطلوب في القسطرة ، وقم بتوصيل حقنة سعة ملليلتر واحد مع 50 ميكرولترا من الهواء لدفع المحلول إلى رئتي الفأر.

مرتين أو ثلاث مرات ، قم بإزالة القسطرة وإعادة وضع الفأر في قفصه للسماح له بالتعافي من التخدير. قبل إجراء التصوير الحيوي ، قم بتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران. بمجرد تخدير الفئران بالكامل ، أخرجها من غرفة الحث وقم بتطبيق مرهم بصري برفق لحماية عيون.

أثناء التصوير ، ضع الفئران في غرفة التصوير كل من مخاريط الأنف على مشعب التخدير. استخدم حاجزا ضوئيا بين الفئران لمنع انعكاس الضوء بين المجاورة. أخيرا ، قم بحقن كل فأر داخل الصفاق ب 150 ميكروغرام لكل جرام من وزن الجسم لوسيفر.

اسمح للوسيفر بالتشتت في جميع أنحاء أجسام لمدة 10 دقائق. ثم ابدأ التصوير. ابدأ تشغيل برنامج التصوير الحي وتهيئة نظام التصوير IVIS.

لتعيين المعلمات أولا ، انقر فوق إعداد التسلسل. ثم حدد وضع اللمعان والتصوير الفوتوغرافي. حدد صور الإضاءة الفوتوغرافية والهيكلية كجزء من تسلسل الصور لتمكين إعادة بناء DLIT 3D.

بعد ذلك ، اضبط وقت التعرض على دقيقة واحدة. ثم اضبط التجميع على متوسط و F-stop على واحد. اضبط مرشح الإثارة على الكتلة ومرشحات الانبعاث لفتحها لإعادة بناء 3D تمكن مرشحات متعددة بأطوال موجية مختلفة.

للسماح بالتوطين الدقيق لمصدر الإشارة ، حدد مجال الرؤية المقابل لعدد الفئران التي يتم تصورها. بمجرد تحديد جميع الإعدادات، انقر فوق إضافة في معالج الصورة في لوحة تحكم الاكتساب لإضافة إعداد التسلسل وانقر فوق الحصول لبدء تسلسل التصوير أثناء الاستحواذ. سجل التفاصيل والشروط التجريبية في نافذة تحرير الصورة واحفظ الصور.

أخيرا ، قم بإزالة الفئران من غرفة التصوير وأعدها إلى أقفاصها. راقب باستمرار حتى تتعافى من التخدير. لتصوير الأنسجة ، قتل الفئران بشكل إنساني.

في هذه المرحلة ، قم بحصاد رئتي كل فأر بشكل معقم ونقل الأعضاء إلى طبق بتري معقم. ضع طبق بتري الذي يحتوي على الرئتين المصابتين داخل غرفة التصوير واحصل على صور التلألؤ البيولوجي بنفس الطريقة الموضحة سابقا في هذا الفيديو. بمجرد الحصول على الصور ، قم بإزالة طبق بتري من غرفة التصوير وباستخدام ملقط معقم ، انقل الرئتين إلى أنبوب يحتوي على ملليلتر واحد من PBS المعقم باستخدام الخالط لتجانس الرئتين لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.

تحضير التخفيف التسلسلي لمتجانسات الرئة في PBS المعقمة. ثم ضع 100 ميكرولتر من كل تخفيف على أطباق بتري تحتوي على وسط انتقائي. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات البكتيرية بوضوح.

ثم احسب CFU لتقييم مستوى العدوى. ابدأ تشغيل برنامج الصور الحية وافتح ملفات الصور المطلوبة من متصفح الملفات. في لوحة الأدوات.

انقر فوق ضبط الصورة لتعديل إعدادات التصحيح والتصفية بالإضافة إلى عتبات مقياس الألوان. لتحديد شدة اللمعان ، استخدم منطقة الاهتمام أو أدوات عائد الاستثمار من القائمة المنسدلة ، وحدد رقم شكل عائد الاستثمار وحجمه. ثم انقر فوق قياس عائد الاستثمار واحفظ إخراج البيانات الكمية لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد.

أولا ، قم بتحميل تسلسل الصورة ، بما في ذلك الصور الخفيفة المنظمة. انقر فوق تضاريس السطح في لوحة الأدوات. ثم في القائمة المنسدلة ، حدد علامة التبويب إعادة البناء لإنشاء تضاريس سطحية.

بعد ذلك ، حدد إعادة بناء DILT 3D من لوحة الأدوات. انقر فوق علامة التبويب "الخصائص" في القائمة المنسدلة وقم بتعيين خصائص الأنسجة وطيف المصدر على العضلات. انقر فوق علامة التبويب تحليل وحدد الطول الموجي للتحليل.

ثم انقر فوق ابدأ. بمجرد ضبط جميع الإعدادات ، انقر فوق إعادة البناء لبدء التحليل ثلاثي الأبعاد. عند اكتمال إعادة البناء ثلاثية الأبعاد ، حدد عرض ثلاثي الأبعاد لعرض النتائج بالنقر فوق علامة تبويب النتائج ، ويمكن عرض كثافة الفوتون ، وفوكسيل البيانات ، ومعلمات الخوارزمية ، وحفظ النتائج وتصدير البيانات والصور لمزيد من التحليل.

كما هو موضح في هذا الشكل ، فإن الفأرين على اليمين اللذين أصيبا بالقصبة الهوائية ب 10 إلى سادس CFU من البكتيريا المضيئة بيولوجيا ينتجان إشارة قوية من منطقة الرئة ، في حين أن الفأر غير المصاب على اليسار لا ينتجان ذلك. تحليل مماثل ، باستخدام الرئتين المقطوعة من الفئران المصابة وحدها يؤكد أن التلألؤ ينبعث من الرئتين وليس من بعض الأنسجة الأخرى المتقاربة. يمكن بسهولة تحديد الإشارة المنبعثة من العينة كتدفق كلي داخل منطقة الاهتمام.

تحليل التصوير المقطعي أن موضع التلألؤ المعروض في هذه الصور كصناديق حمراء يقع ضمن المنطقة التي تحتوي على رئتي الفأر على النحو الذي تحدده إعادة البناء ثلاثية الأبعاد. أخيرا ، يشهد التشابه بين منحنى كثافة الفوتون المقاس على اليسار ومنحنى كثافة الفوتون المحاكي على اليمين على الجودة الجيدة لإعادة البناء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير المصابة بالسوابق وتحليل الصور لتوطين الذكريات وتحديدها كميا.