Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وتقييم الشريان المغذي للعقدة الليمفاوية الإربية داخل الجسم الحي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء سديلة جلدية من خلال تشريح الجلد بعناية في المنطقة الإربية للفأر، بحيث تغطي العقدة الليمفاوية الإربية. بعد ذلك، يتم فصل النسيج الضام الذي يغطي منطقة العقدة الليمفاوية.

بعد ذلك، يجب إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة للكشف عن الأوعية الشريانية المغذية للعقدة اللمفاوية. وأخيراً، يتم تصوير وتقييم التغيرات في أوعية العقدة اللمفاوية عن طريق المجهر الحيوي P. وعلى الرغم من ذلك، فإن التحضير الذي ستشاهدونه اليوم هو للدورة الدموية الدقيقة في العقدة اللمفاوية الإربية. ويمكن استخدام هذه التقنيات الجراحية لتحضيرات أخرى مثل العضلات الهيكلية وكذلك الدماغ.

بشكل عام، عند تطبيق هذه التقنية، يواجه المبتدئون صعوبات لسببين رئيسيين؛ الأول هو التعامل مع حيوان حي، والثاني هو أن إجراء الجراحة في منطقة صغيرة جداً يجعل أي نوع من الاضطرابات في الوعاء الدموي نفسه أو المنطقة المحيطة به يؤدي إلى تأثير سلبي، مما قد يضر بالتجربة المراد إجراؤها. لذا، يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً حاسماً لتحقيق النجاح.

هناك عدد من الخطوات المعقدة التي يتضمنها الإجراء، والتي لا يمكن نقلها بشكل جيد من النص إلى التطبيق الفعلي للتقنية. لذا، من المهم مشاهدتها ليتم تنفيذها بشكل صحيح. مع تمنياتنا لكم بالتوفيق.

يتم تخدير الفأر أولاً وحلاقة منطقة الجراحة. يرجى مراجعة المخطوطة النصية للحصول على التفاصيل. يمكن بعد ذلك وضع الفأر على لوح جراحي شفاف في وضعية الاستلقاء على الظهر.

قم بتثبيت الفأر على اللوحة عن طريق لصق كل وسادة قدم. في اليوم السابق للتجربة، اخلط مادة thes guard 180 4 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ثم باستخدام طبق بتري قياسي مخصص للاستخدام مرة واحدة كقالب، صب الخليط ليكون بعمق حوالي ربع بوصة واتركه ليتصلب طوال الليل. قم بإزالة thes guard من طبق بتري وضعه على لوحة الجراحة.

ضع الفأر المخدر والمحلوق تحت مجهر التشريح. قم بإجراء شق في خط الوسط على طول السطح البطني للتجويف البطني باستخدام ملاقط من الفولاذ المقاوم للصدأ رقم 5 ومقصات زنبركية ذات شفرات مستقيمة. بعد ذلك، واصل الشق في خط الوسط قطرياً باتجاه الأطراف، ثم قم بإزاحة الجلد نحو العمود الفقري الضخم.

بمجرد أن يصبح العصب الظهري (ln) مرئياً بوضوح، قم بتثبيت الجلد المتراجع باستخدام دبابيس حشرات من الفولاذ المقاوم للصدأ وملقط مطلي بإيبوكسي الإينوكس على قاعدة السيجار 180 ذات الأرجل الأربع. أضف محلول الملح الفسيولوجي أو محلول PSS إلى المنطقة.

بعد ذلك، قم بإزالة الطبقة الرقيقة من النسيج الضام التي تغطي المنطقة المحيطة بـ ln. وباستخدام الملقط، ارفع قطعاً صغيرة من النسيج الضام بعناية وقم بتشريحها بعيداً عن ln. ثم استخدم مقصاً نابضاً لإزالة النسيج الدهني الذي يغطي ويحيط بـ LN حتى ينكشف السرير الوعائي الدقيق.

في هذه الخطوة، من المهم توخي الحذر الشديد لتجنب ملامسة الأوعية الدموية المستهدفة بالأدوات الجراحية، أو إصابة الأوعية عن طريق تسليط قوة مفرطة عليها أثناء التعامل مع الأنسجة المحيطة بها. وأفضل طريقة لإزالة الدهون من حول ln هي إرخاء النسيج الضام، وإمساك النسيج الدهني بالملقط، ثم إزالة النسيج الدهني برفق حتى يتضح مجال الرؤية. وبمجرد إزالة الأنسجة الضامة والدهنية، يمكن رؤية القطاع الشرياني الرئيسي المجاور لـ LN والوريد المصاحب الذي يغطيه.

بمجرد كشف جزء الوعاء الدموي المطلوب تحت مجهر التشريح، قم بتثبيت العينة على المجهر الحيوي. قم بإعداد خطوط التروية الفوقية والشفط. خلال هذا الجزء من الإجراء، من الضروري الحفاظ على الأنسجة المكشوفة تحت التروية الفوقية المستمرة باستخدام محلول PSS المتوازن.

تتم عملية التروية الفائقة لمحلول PSS بفعل الجاذبية. يتم التلقيم من خزان أولي إلى خزان مسخن بواسطة غلاف مائي، ويتم ترويته بمزيج من 5% Carbon dioxide وموازنة من nitrogen، ثم ينساب عبر خط تقطير بمعدل 10 milliliters per minute. يجب استخدام خط شفط لمواصلة سحب محلول PSS المروى بعيداً عن العينة عن طريق وضعه في أسفل السديلة الجلدية، ثم يجب فحص درجة حرارة حمام الماء المتداول ومعدل التروية الفائقة لمحلول PSS وضبطهما لتحقيق درجة حرارة مثلى تبلغ حوالي 36 degrees Celsius.

طوال فترة التحضير، اترك الأوعية الدموية تتوازن مع محلول PSS لمدة 60 دقيقة على الأقل. تأكد من عدم إصابة الحيوان بانخفاض في درجة حرارة الجسم باستخدام مقياس حرارة شرجي وتوفير مصباح حراري خارجي. وأثناء عملية توازن محلول PSS، قم بقياس قطر الوعاء الدموي.

استخدام الفرجارات المرئية في نقاط زمنية متعددة للتأكد من استقرار الوعاء؛ ويُعرَّف الاستقرار بأنه بقاء قياس القطر ثابتًا في حدود 5 µm لمدة 20 دقيقة. تُسجل قياسات القطر على جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج ChartLab. بعد فترة الاتزان، يتم تقييم سلامة الوعاء باستخدام مُحفز محدد للعضلات الملساء مثل phenylephrine كما هو موضح هنا باستخدام phenylephrine.

أضف المادة المحفزة إلى العينة. يجب تقييم ثماني مواد محفزة عند كل زيادة لوغاريتمية في التركيز التراكمي للمادة المحفزة أثناء إضافتها إلى الوعاء بين إعطاءات كل مادة محفزة. يجب إجراء مرحلة غسيل باستخدام PSS لمدة 30 دقيقة أو حتى يعود الوعاء إلى قطر الاستراحة.

فيما يلي نتائج نموذجية لعقدة لمفاوية إربية بعد فترة التوازن. يؤدي تغذية الشريان بمحلول ملحي فسيولوجي إلى الحصول على صورة واضحة تسمح بتحديد كل من الشريان المغذي المشار إليه هنا بالسهم الأحمر والوريد المشار إليه بالسهم الأخضر، واللذين يمدان العقدة اللمفاوية الإربية. يوضح الرسم البياني استجابة وعائية نموذجية لشريان عقدة لمفاوية إربية للإضافة التراكمية لـ phenylephrine المدمج مع SUP إلى محلول ملحي فسيولوجي.

من تركيز 10⁻⁹ مولار إلى 10⁻⁵ مولار، يشير وجود تضيق وعائي قوي إلى الوظيفة الطبيعية للعضلات الملساء الموجودة في الشريان. يوضح هذا الرسم البياني استجابة وعائية نموذجية لإضافة تراكمية من الأسيتيل كولين المدمج إلى محلول ملحي فسيولوجي. تظهر النتائج من تركيز 10⁻⁹ مولار إلى 10⁻⁵ مولار.

يشير وجود توسع وعائي قوي إلى وظيفة بطانية طبيعية في الشريان. عند محاولة هذا التحضير، فإن أحد الأمور الرئيسية التي يجب تذكرها هي تقليل الاضطرابات التي تلحق بالوعاء والمنطقة المحيطة به لضمان تحقيق أقصى قدر من النجاح. بعد هذا الإجراء، يمكن إدخال طرق أخرى مثل الفلورة لاستكشاف وظائف خلوية أخرى مثل حركة الخلايا.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للربط بين مجالات المناعة وبيولوجيا الأوعية الدموية ليبرز مجال جديد وهو المناعة الوعائية.