تقييم خصائص اشارة من الظهارة الأدمة خلال التنمية الجمجمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أجنة خيمرية عن طريق نقل الأديم الظاهر من أجنة مانحة إلى الفك العلوي النامي لأجنة الدجاج. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الأديم المانح لغرض الزرع، ومن ثم يتم تحضير موقع المضيف لعملية التطعيم.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في وضع النسيج المانح على موقع المضيف وتثبيت الطعم في موضعه. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر انغراسًا حصريًا للأديم الظاهر المانح، ومن خلال التحليل الجزيئي والمورفولوجي، يمكن تحديد وظيفة الأديم الظاهر المعاد ترميزه المانح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الأحياء التنموي، مثل تحديد دور الأنسجة المختلفة أثناء التخلق الشكلي.

ستقوم الدكتورة ديان، وهي باحثة أولى من مختبرنا، باستعراض هذا الإجراء. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير الأوساط الزراعية والتأكد من أن جميع المحاليل المطلوبة متاحة وفي درجة الحرارة الصحيحة. بعد ذلك، وأثناء ارتداء واقي العين المناسب، قم بسحب أنابيب الشعيرات الدقيقة لتشكيل نقطة دقيقة فوق لهب كحولي.

لصنع دبابيس زجاجية لسن إبر التنجستن عن طريق تثبيتها في لهب مشعل البروبان. ابدأ باستخراج الجنين المانح من القشرة عن طريق وضع قطعة من الشريط اللاصق على طرف البيضة. استخدم بعد ذلك طرف إبرة التشريح لعمل ثقب صغير في مركز الشريط اللاصق.

أدخل محقنة سعة 10 milliliter وإبرة تحت الجلد قياس 18 gauge في الفتحة، واسحب 1 milliliter من الألبومين من البيضة. بعد ذلك، وباستخدام إبرة تشريح، اصنع ثقباً صغيراً في الجزء العلوي من القشرة. ضع قطعة ثانية من الشريط اللاصق لتغطية هذا الثقب.

قم بعمل فتحة دائرية في البيضة باستخدام زوجين من الملاقط. أمسك الجنين وضعه في طبق من PBS بارد جداً لغسله. بعد إزالة رأس الجنين، ضعه في طبق زراعة أنسجة يحتوي على DMEM خالٍ من السيروم وبدرجة حرارة الغرفة.

ضع الطبق تحت مجهر التشريح مع تثبيت الرأس باستخدام الملقط. استخدم مقصًا نابضيًا لتشريح الفك العلوي واللاغون (lagon) بشكل عياني وفصلهما عن بقية الرأس. بعد ذلك، وباستخدام حامل شفرات مزود بشفرة حلاقة حادة، قم بقص النتوء الأنفي الجبهي من الفك العلوي.

استخدم ماصة لنقل النتوء الأنفي الجبهي إلى طبق بتري بقطر 30 مليمتر يحتوي على حجم كافٍ من diss في PBS واحضنه على الثلج لمدة 20 دقيقة. بعد انقضاء وقت الحضانة، اسحب محلول dispa دون تعريض النسيج للاضطراب. ثم غطِّ الأنسجة بالكامل بوسط DMEM الذي يحتوي على 1%BSA.

لإيقاف عملية الهضم، انقل النسيج إلى طبق زراعة جديد. ثم، وبالعمل تحت مجهر تشريحي، ثبت النسيج باستخدام إبرة تنغستن غير مدببة، واستخدم إبرة تنغستن مدببة لإجراء التشريح.

افصل الأديم الظاهر عن طريق تقشيره بعيداً عن الأنسجة الأخرى. وبمجرد تحضيره، احفظ النسيج المطعّم في وسط DMEM مع BSA على الثلج حتى يصبح المضيف جاهزاً لعملية الزرع. وباستخدام الطريقة الموضحة سابقاً، قم بعمل نافذة في بيضة الدجاج.

ضع البيضة التي تحتوي على الجنين تحت مجهر التشريح باستخدام زوجين من الملاقط. أمسك بغشاء IGN والسلى ثم مزقهما برفق لإحداث فتحة وكشف جنين المضيف. قم بتدوير الرأس عن طريق وضع ملقط على العين اليمنى والضغط عليها مع تثبيت الرأس.

استخدم ملقطاً وإبرة لإزالة أدمة المضيف لتهيئة مكان الطعم. أضف 2 µL من الأحمر المتعادل إلى طبق بتري الذي يحتوي على الطعوم المُجهزة. استخدم ماصة زجاجية لنقل الطعم إلى المضيف.

ضع الطعم في الموضع المخصص ليحل محل الأديم الظاهر الذي تمت إزالته. أدخل دبوساً زجاجياً في كل زاوية من زوايا النسيج المطعّم لتثبيت الطعم في مكانه بعد عملية التطعيم. أغلق النافذة بإحكام باستخدام الشريط اللاصق.

أعِد الجنين إلى الحاضنة حتى يصل إلى مرحلة النمو المطلوبة للتحليل، وتظهر هذه الصورة نسيجاً من الـ URA لصيص سمان تم صبغه بجسم مضاد anti Q-C-P-N-A خاص بالسمان. يقع النسيج المطعّم بين السهمين. لا يوجد دليل على صبغة QCPN في نسيج النوع المتوسط من خيمرة فأر وصيص تظهر هنا، ومرة أخرى، يقع النسيج المطعّم بين السهمين في C2، والتهجين مع مسبار محدد للتسلسل التكراري B2.

يكشف تكرار جينات الفئة الأولى أن تعبير sign B two يقتصر على الجزء الذي يتكون من الطعم الموضح هنا كصورة لجنين هجين من فراخ السمان والسمان الذي صُبغ بصبغة trichrome، حيث تظهر صبغة trichrome الكولاجين والعظام باللون الأزرق. ويظهر تضاعف هيكل الفك العلوي كما يشير السهم. وتوضح هذه الصورة جنيناً هجيناً من فراخ الفأر والسمان قد صُبغ مرة أخرى بصبغة trichrome.

يظهر تضاعف في هيكل الفك العلوي. توضح هذه الصورة تهجيناً موضعياً مشعاً لتعبيير BMP seven الطبيعي في الميزنكايم (mechy) لجنين دجاج مُطعم، حيث تظهر هنا أنسجة من كيميرا (chime mirror) بين فأر ودجاج. ويمكن ملاحظة أن تعبير BMP seven قد تم تحفيزه في الميزنكايم المجاورة للطعم كما يشير السهم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع أجنة الدجاج لتقييم الآليات التي تنظم تطور النتوء الجبهي والأنفي.