من مثلي Xenografting Luciferase الموسومة الإنسان الخبيثة ورم الخلايا العصبية المحيطية لغمد في الجسم الحي اختبار وكلاء المرشح علاجي

تم وصف طريقة لتطعيم موثوق بها الإنسان الخبيثة luciferase الموسومة غمد ورم الخلايا العصبية الطرفية في العصب الوركي العوز المناعي لدى الفئران. وتناقش أيضا استخدام التصوير تلألؤ بيولوجي لإثبات إنشاء السليم للترقيع الورم ومعايير العزل عشوائية من الحيوانات إلى مجموعات الدراسة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ما إذا كان العامل العلاجي المرشح يمنع بشكل فعال نمو خلايا M-P-N-S-T المطعمة في العصب الوركي للفئران التي تعاني من نقص المناعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الخلايا السرطانية أولا من قارورة الأنسجة وغسلها وتعليقها بالتركيز المناسب. الخطوة الثانية من الإجراء هي تعريض العصب الوركي جراحيا ثم حقن العصب ب 5000 خلية.

الخطوة التالية هي تحديد نجاح التطعيم باستخدام التصوير القائم على الضوء في الجسم الحي الذي يحدد CIN عشوائيا لمجموعات الدراسة وبدء العلاج بالعامل العلاجي المرشح. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في جمع الأورام بعد 30 يوما من التطعيم وتحليل تأثيرات العامل العلاجي المرشح على الورم. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح ما إذا كان العامل العلاجي قد قلل من نمو الورم من خلال طرق مثل مقارنة أوزان الورم ، والنظر في المعدلات النسبية للانتشار عن طريق التلوين المناعي ل KI 67 وتقييم مستويات موت الخلايا السرطانية في الفئران الضابطة والمعالجة بمقايسات النفق.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التطعيم تحت الجلد ، هي أنها نمذجة للبيئة المكروية الطبيعية ، والتي أفضل نماذج نمو M-P-N-S-T التي توضح هذه التقنية ستكون إيمي تورك ، فنية من مختبري. يتم تحضير الفئران غير العارية التي تعاني من نقص المناعة في اليوم السابق للتطعيم. استخدم المقصات لحلاقة الشعر من فأر مخدر يعمل على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.

استخدم عامل إزالة الشعر الكيميائي لإزالة الشعر المتبقي. بمجرد إزالة الشعر بالكامل ، ضع الماوس على وسادة تدفئة في قفص عزل بدون فراش حتى يتعافى تماما. في يوم التطعيم ، قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة snat بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في DMEM 10 بدون pur mycin إلى تركيز نهائي من خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الثالثة لكل ثلاثة ميكرولترات. احتفظ بالخلايا على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستخدام. للبدء ، ضع مخدرا على وسادة تدفئة وقم بتطبيق مرهم العين على كل عين.

قم بقص علامة أذن برقم معرف فريد على الأذن اليمنى لكل ماوس. لسهولة التعرف عليه طوال الدراسة ، ضع على بطنه وافرد رجليه الخلفيتين. قم بتغطية الفأر بستارة معقمة وكشف نافذة جراحية حيث سيحدث التطعيم.

ضع البيتادين على موقع الجراحة باستخدام قضيب قطني مائل بدءا من وسط الجناح ويتصاعد تدريجيا إلى الخارج إلى حواف النافذة الجراحية. ثم يتم تطبيق 70٪ من الإيثانول على موقع الجراحة بنفس الطريقة. تتكرر التطبيقات المتتالية للبيتادين متبوعا بالإيثانول مرتين أخريين.

قم بإزالة الخلايا من الجليد وإما دوامة برفق أو تحريك الأنبوب لإعادة تعليق الخلايا المستقرة. استخدم ماصة لإزالة 3.2 ميكرولتر من معلق الخلية وإخراجها على قطعة من الطفيلي. اسحب ثلاثة ميكرولترات من تعليق الخلية في حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر.

مجهزة بإبرة قياس 33. امسك الخلايا والخلية التي تحتوي على حقنة على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام. استخدم مقبض مشرط رقم أربعة ، مزودا بشفرة مشرط رقم 22 لعمل شق عبر جلد الجناح أسفل عظم الفخذ مباشرة وبالتوازي معه.

افتح شق الجلد باستخدام المشبك الجراحي لكشف العضلة الأساسية. استخدم زوجا من المقصات الحادة ذات الرؤوس الحادة لتشريح اللفافة التي تمتد على طول الساق وفضح العصب الوركي الذي يقع تحت بنية خطية بيضاء حول سمك خيط سميك يعمل تحت المجهر. استخدم زوجا من الملقط المنحني الحاد ذو الرؤوس لتشريح العصب بعناية ، مما يؤدي إلى إرخاءه من العضلة الأساسية.

اترك الملقط في مكانه للحفاظ على العصب مرتفعا ومعزولا بعناية أدخل إبرة حقنة هاميلتون في العصب في محاولة للحفاظ على زاوية الحقن بالتوازي مع العصب قدر الإمكان ، حتى لا تثقب في الجانب السفلي. بمجرد وضع الإبرة بشكل صحيح في العصب ، قم بإرخاء التوتر الناتج عن الملقط وحقن الخلايا ببطء على مدار 45 إلى 60 ثانية. يعد الحقن البطيء ضروريا لمنع الغسيل العكسي للخلايا السرطانية مما يؤدي إلى فقدانها.

بعد حقن جميع الخلايا بنجاح ، اسحب الإبرة ببطء لتقليل فقدان المواد المحقونة. بعد اكتمال الحقن ، قم بإزالة المشبك الجراحي والملقط. ثم ضع العصب بعناية مرة أخرى في موقعه الأصلي.

أغلق الشق بغراء جراحي للرابطة البيطرية ، وامسكه بالملقط لمدة 20 ثانية تقريبا للسماح للغراء بالجفاف. ضع في قفص ساخن خال من الفراش حتى يتعافى تماما. مراقبة صحة الفئران.

تتم إزالة الفئران اليومية من الدراسة. إذا تجاوز عبء الورم 10٪ من وزن جسم الطبيعي أو تجاوز فقدان الوزن 20٪ لتحديد نجاح الإجراء ، قم بإجراء تصوير التلألؤ البيولوجي بعد يوم وثلاثة أيام من التطعيم. حقن الفأر ب 2.5 ملليغرام من لوسيفر وضع المخدر على منصة التصوير الساخنة.

الكشف عن انبعاث الضوء من الورم المعبر عنه لوسيفيراز اليراع بعد 10 دقائق من حقن الركيزة. باستخدام برنامج من Xeno Gen ، قم بتعيين أوقات الحصول على الصور على نطاق من ثانية واحدة إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، التقط صورا بالأبيض والأسود للفئران Pseudocolor.

يتم تراكب تحجيم التلألؤ البيولوجي مع هذه الصور لتوفير مقياس لشدة انبعاث الضوء. لكي تكون مؤهلة للإدراج في مجموعة تجارب ما قبل السريرية ، يجب أن يكون لدى الفئران إشارة تلألؤ بيولوجي يمكن اكتشافها ، بعد يوم وثلاثة أيام من التطعيم ، ويجب أن تزداد شدة الإشارة بين اليومين الأول والثالث. كما هو موضح هنا زيادة تدريجية نموذجية في التلألؤ البيولوجي لوحظت بعد يوم إلى 18 يوما من التطعيم في طعم غريب تقويمي تم إنشاؤه بشكل صحيح في فأر عاري.

لاحظ التشابه في الإشارات المكتشفة داخل المنطقة التي تهم الفئران المختلفة. تظهر إعادة التصوير بعد 10 أيام و 18 يوما من التطعيم أن إشارات الإضاءة الحيوية تزداد تدريجيا في موقع الكسب غير المشروع في الفئران الفردية. يظهر القياس الكمي لإشارات الإضاءة الحيوية التي لوحظت بعد يوم إلى 24 يوما من التطعيم أنه على الرغم من أن هذه الإشارات تزيد تدريجيا ، إلا أن نمو الورم يتسارع بشكل ملحوظ في المراحل اللاحقة من فترة الدراسة.

نظرا للنمو العدواني ل M pns ts ، غالبا ما تخترق الخلايا السرطانية المطعمة الحواجز الطبيعية للعصب وتغزو الأنسجة المجاورة. يوضح هذا الرسم المجهري لموقع الكسب غير المشروع نمو الورم والغزو البؤري للعضلات الهيكلية المجاورة بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في فأر واحد في 10 دقائق عند إجراؤها بشكل صحيح.