البولي ايثيلين جلايكول كفاءة تحويل ساطة (PEG) من موس Physcomitrella patens

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحويل SCO Metre Protoplasts. يتم تحقيق ذلك عن طريق هضم النباتات أولا باستخدام Drizly. بعد ذلك ، يتم غسل البروتوبلاست بالمانيتول لإزالة الدريزلي ثم يتم احتضانها بالحمض النووي والوتد.

أخيرا ، يتم نشر البروتوبلاستات المحولة على ألواح وتحضينها. في النهاية ، يمكن الحصول على النتائج. هذا العرض الذي يعبر عن البروتوبلاستات المتحولة التي تعبر عن البروتينات ذات العلامات الفلورية من خلال الفحص المجهري الفلوري ، وسيكون إثبات الإجراء Y lu ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها فعالة وتولد باستمرار البروتوبلاست الذي يعبر عن البروتين محل الاهتمام لعزل الطحالب ، تبدأ Protoplasts بإضافة تسعة ملليلتر من 8٪ مانيتول في طبق بتري باستخدام ملعقة ضع طحالبا عمرها خمسة إلى سبعة أيام من اثنين إلى ثلاثة PP NH أربعة أطباق في المانيتول. يرجى الاطلاع على البروتوكول المكتوب المصاحب لهذا الوصفات ووصفات الكاشف الإضافية. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من 2٪ dizzly واحتضن في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف لمدة ساعة واحدة.

قم بتصفية الخليط من خلال شبكة 100 ميكرون للحصول على معلق أخضر متجانس. ثم قم بتدوير المرشح عند 250 جم لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية برفق شديد.

أعد تعليق البروتوبلاست في 500 ميكرولتر من 8٪ مانيتول. ثم أضف 9.5 مل إضافي من 8٪ مانيتول. تأكد من تعليق البروتوبلاست بالكامل.

قم بتنفيذ خطوات الغسيل مرتين أخريين عن طريق تدوير المحلول مرة أخرى عند 250 جم لمدة خمس دقائق. التخلص من المادة الطافية وتعليق البروتوبلاستات. الأول في 500 ميكرولتر.

ثم 9.5 مل من 8٪ مانيتول باستخدام مقياس الخلوي hemo. احسب عدد البروتوبلاست في 10 ميكرولتر من المعلق لتحويل الحمض النووي إلى البروتوبلاست المعزول. أولا ، قم بتدوير خليط البروتوبلاست على حرارة 250 جم لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق البروتوبلاستات عند 1.6 مليون لكل مليلتر في محلول MMG. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 600 ميكرولتر من محلول Protoplasts إلى أنبوب مزرعة يحتوي على 60 ميكروغراما من الحمض النووي. هز.

أضف برفق 700 ميكرولتر من محلول الكالسيوم PEG ورج. احتضان العينة جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة خلال فترة الانتظار هذه. قم بتغطية ألواح PRMB بالسيلوفان.

ثم قم بتخفيف التعليق بثلاثة ملليلتر من W خمسة محلول يدور عند 250 جم لمدة خمس دقائق. لإزالة إعادة تعليق PEG ، يتم تثبيت البروتوبلاست في ملليلترين من لوحة PRMT ملليلتر واحد لكل لوحة PRMB مغطاة بالسيلوفان. احتفظ بالصفائح عند 25 درجة مئوية في غرفة النمو.

أخيرا ، بعد أربعة أيام من التحول ، انقل السيلوفان إلى ألواح اختيار جديدة. يوضح هذا الشكل مثالا على نباتات عمرها 18 يوما تم تجديدها من البروتوبلاست ، والتي تم تحويلها ب 15 ميكروغراما من البلازما فائقة اللف ، الحمض النووي ، تحمل كاسيت مقاوم للهيغروميسين. هنا ، تم تحويل 30 ميكروغراما من نفس البلازميد الفائق الملفوف ، الحمض النووي ، إلى بروتوبلاستات.

تم تحويل 60 ميكروغراما من الحمض النووي المنقوش في هذه العينة. وأخيرا ، تم تجديد هذه النباتات من البروتوبلاست التي تم تحويلها ب 120 ميكروغراما من نفس الحمض النووي للبلازما فائق اللف الذي يحمل كاسيت مقاومة الهيغروميسين. لا تتأثر كفاءة التحويل بتركيزات الحمض النووي التي تصل إلى 60 ميكروغراما.

ومع ذلك ، فإن التركيزات العالية من الحمض النووي تضر بهذا الإجراء. تشير البيانات إلى أن هذه الطريقة تقدم نتائج متسقة على نطاق واسع من كميات الحمض النووي مرة واحدة في الفصل الدراسي. يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق إضافية مثل RNAi العابر والضربة القاضية الجينية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول وظيفة الجينات.