Name: البولي ايثيلين جلايكول كفاءة تحويل ساطة (PEG) من موس Physcomitrella patens /em (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: تعلم تحويل البروتوبلاستات في طحلب Physcomitrella patens باستخدام البولي ايثيلين جلايكول. هذه الطريقة الفعالة تتيح التعبير عن البروتينات المُصنَّعة وراثياً لدراسة وظائف الجينات في النباتات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

معتمد من قبل جبهة الخلاص الوطني LV (IOS 1002837)

1. جعل Protoplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9 مل من 8 ٪ مانيتول إلى طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة ، وطرح الطحلب العمر 7 أيام 2-3 PPNH4 لوحات من 5 -- في طبق بتري تحتوي مانيتول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من Driselase 2 ٪ (سيغما D9515 - 25G) إلى طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان طبق بيتري في درجة حرارة الغرفة لطيف مع الهز لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية تعليق الجبلة المجردة من خلال شبكة ميكرومتر 100 دينار بحريني (352350 فالكون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور تعليق تصفيتها في 250 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق protoplasts بلطف شديد مع 500 ميكرولتر من مانيتول 8 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9.5 مل مانيتول 8 ٪ في أنبوب الثقافة. تأكد من أن يتم تعليق protoplasts تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الترشيح وإعادة تعليق الخطوات (1.6 ، 1.7 و 1.8) مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 ميكرولتر من الحل الجبلة المجردة وحساب protoplasts في عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضرب عدد من الجبلة المجردة في منطقة مربع بحلول 16 10000 للحصول على عدد من protoplasts لكل مليلتر (أنظر الشكل 1). </li></ol> 2. تحول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور تعليق الجبلة المجردة في 250 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق protoplasts في حل مجموعة محمد المعجل في تركيز قدرها 1.6 مليون protoplasts / مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان تعليق الجبلة المجردة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ميكرولتر من تعليق الجبلة المجردة في أنبوب ثقافة تحتوي على 60 ميكروغرام الحمض النووي. دوامة أنبوب بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر من PEG / كا حل في خليط الجبلة المجردة / الحمض النووي. دوامة أنبوب الخليط برفق حتى كلها متجانسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال فترة الانتظار هذه ، وتغطية PRM - B مع لوحات السيلوفان (80 دوائر قطرها ملم ، AA التغليف المحدودة ، المملكة المتحدة) ؛ السيلوفان تسمح لهيدرات على سطح لوحة لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملعقة ، وإزالة أي فقاعات الهواء المحبوس بين السيلوفان وبليت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخليط مع 3 مل من W5 الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخليط في 250 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق protoplasts في 2 مل من ذاب PRM - T (قبل إضافته إلى protoplasts يمكن الاحتفاظ بهذا المحلول السائل عند درجة 42). لوحة 1 مل من اعادة تعليق protoplasts PRM - B في لوحة تغطيها السيلوفان. التفاف على لوحات مع Micropore (3M ، والرعاية الصحية). الحفاظ على لوحات في 25 درجة مئوية في غرفة النمو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك ، يمكن إعادة protoplasts مع وقف التنفيذ في 1 مل من السائل والمتوسطة الطلاء مطلي 0.5 مل على طبق PRM - B مغطاة السيلوفان. هذا يسمح أسرع التجدد ، ولكن عدد من محطات تجديد أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعيين الغرفة النمو عن 16 ساعة. ضوء وساعة 8. دورة الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل السيلوفان على طبق من ذهب لاختيار الطازجة 4 أيام بعد التحول. </li></ol> 3. ممثل النتائج : ويرد مثال على التحول في الشكل 2. كان الحمض النووي المستخدمة في هذا المثال على supercoiled 7.8 كيلوبايت بلازميد يحمل الكاسيت هيغروميسين مقاومة. تم تخفيض مبلغ protoplasts مطلي إلى 50 ٪ للتصوير الفوتوغرافي. تم التقاط الصور بعد أسبوعين تم نقل النباتات لاختيار لوحات. لا تتأثر كفاءة التحول من تركيز الحمض النووي يصل إلى 60 ميكروغرام. تركيزات أعلى من الحمض النووي تضر كفاءة التحول. وأظهرت البيانات أن هذه الطريقة توفر نتيجة متسقة عبر طائفة واسعة من كميات الحمض النووي. هذا الأسلوب يمكن أن تولد أيضا transformants مستقرة على نحو فعال كما هو مبين في الجدول رقم 1 ، ويمكننا الحصول على حوالي 4 transformants مستقرة في خطي ميكروغرام من الحمض النووي ، وهو أعلى بكثير من ما كان ذكر سابقا 14. اختبرنا أيضا تأثير الصدمة الحرارية على كفاءة التحول من خلال تحويل البلازميد supercoiled يحمل الجين لبروتين فلوري كعلامة. تم تنفيذ الصدمة الحرارية من 10 دقائق بعد حضانة درجة حرارة الغرفة (ضمن الخطوة 2.6) التي يحتضنها الخليط في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. وقد حضنت الخليط في درجة حرارة الغرفة حمام الماء مباشرة بعد الصدمة الحرارية لمدة 17 دقيقة. وسجلت النتائج بعد 22 ساعة التحول. وكانت نسب transformants حصل مع وبدون حرارة صدمة مشابهة جدا (~ 25 ٪) ، ولكن لاحظنا تأثير ضار من الصدمة الحرارية على صلاحية protoplasts (لا تظهر البيانات). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. في ضوء protoplasts عدادة الكريات يشار إلى المقطع اللازمة لفرز الجبلة المجردة من قبل مربع أحمر. لاحظ المربعات اللازمة لفرز 16 protoplasts (انظر 1.11) ، والصورة تظهر على عدد من 24 protoplasts (240000 خلية / مل). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. وكانت صور 18 transformants يوم عابر القديمة. Protoplasts العابرةشكلت مع المبلغ المشار إليه من البلازميد supercoiled. ج : 15μg ؛ B : 30μg ؛ C : 60μg ؛ D : 120μg. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كمية من الحمض النووي (ميكروغرام) </td><td> الكفاءة (tranformants / ميكروغرام DNA) </td></tr><tr><td> 15 ، supercoiled البلازميد </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30 ، supercoiled البلازميد </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60 ، supercoiled البلازميد </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120 ، supercoiled البلازميد </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60 ، خطي البلازميد </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> كفاءة تحويل الجدول 1. الحمض النووي في كميات مختلفة.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الطريقة المعروضة هنا يمكن تحويل الحمض النووي واضحة ومتسقة في protoplasts patens Physcomitrella. وضعت أصلا لهذا الأسلوب Arabidopsis 1 ، ولكن نحن هنا أثبت أنه يؤدي بشكل جيد مع protoplasts من patens Physcomitrella ، وهو نبات أبسط ومختلفة. ولذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنواع النباتية الأخرى مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة. التعديلات الممكنة لتحسين وتشمل تركيز الجبلة المجردة في مجموعة محمد المعجل ، فترة حضانة في الحل والربط MMG / كا. اخترنا لاستخدام الحمض النووي 60 ميكروغرام في تجاربنا الروتينية لأن عدد transformants الزيادات خطيا مع تركيز الحمض النووي حتى هذه النقطة (الجدول 1). يمكن أن نحصل على ما يقرب من 7000 transformants عابرة أو 200 transformants مستقرة على 60 ميكروغرام واحد تحول الحمض النووي ، التي تسمح لمزيد من الفحص والتحليل لعدد كبير من النباتات. يمكن أن تكون إما تحولت protoplasts مع انتشار المتوسطة الطلاء السائل أو PRM تي. على الرغم من أن كفاءة التجدد هو أقل عندما يتم استخدام الطلاء السائل المتوسطة ، ونحن اخترت هذا الأسلوب عندما تحولت protoplasts مع البلازميدات supercoiled. وأظهرت كما في الجدول رقم 1 ، التحولات فعلت مع DNA البلازميد supercoiled توليد المزيد من transformants وبالتالي ، يمكننا الحصول على ما زالت أعداد كبيرة من النباتات المتوسطة مع الطلاء السائل. وعلاوة على ذلك ، ونشر protoplasts المتوسطة مع الطلاء السائل يسمح أسرع التجدد ، وهو أمر مهم للتجارب التي تنطوي على الظواهر العابرة ، مثل [رني نهدم التجارب 9،15. بالإضافة لعدم وجود أجار أعلى يسمح لعزل محطة سهلة للimmunostaining وRT - PCR 9،15.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> عنصر </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1.84 ملي KH 2 PO 4 3.4 ملي كا (NO 3) 2 1 ملم MgSO 4 2.72 ملي طرطرات ثنائي الأمونيوم 54 ميكرومتر FeSO 4 0.7 H 2 O 9.93 ميكرومتر H 3 BO 3 1.97 ميكرومتر MnCl 0.4 2 H 2 O 0.23 ميكرومتر كوكلي 2 0.6 H 2 O 0.19 ميكرومتر ZnSO 4. 7H 2 O 0.22 ميكرومتر كبريتات النحاس 4. 5H 2 O 0.10 ميكرومتر نا 2 مو 4 0.2 H 2 O 0،168 ميكرومتر KI إضافة آغار 0.7 ٪ لمتوسطة الصلبة. </td></tr><tr><td> PRM - B </td><td> 4 PPNH مانيتول مع 6 ٪ و 0.8 ٪ أجار. إضافة 10 مل 1M CaCl 2-1 لام قبل صب لوحات. </td></tr><tr><td> PRM - T </td><td> 4 PPNH مانيتول مع 6 ٪ و 0.6 ٪ أجار. إضافة 0.5 مل 1M CaCl 2-50 مل قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> السائل التصفيحات متوسطة </td><td> 4 PPNH مانيتول مع 8.5 ٪ دون آغار. إضافة 0.5 مل 1M CaCl 2-50 مل قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> 2 ٪ Driselase </td><td> إضافة 4 غرام من Driselase (سيغما D9515 - 25G) إلى 200 مل من مانيتول 8 ٪. يحرك برفق لمدة 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، واحتضان 30 دقيقة. عند 4 درجات مئوية ، ويحرك برفق لمدة 5 دقائق. في درجة حرارة الغرفة. تدور ز 2500 لمدة 10 دقيقة ، وتجاهل بيليه. فلتر مع 0.22 ميكرون ، وتخزينها مجمدة في 10 مل aliquots. ذوبان الجليد في ماء الاستحمام درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0.4 M مانيتول 15 ملم MgCl 2 4 ملم زارة التربية والعلم (الرقم الهيدروجيني 5.7) </td></tr><tr><td> PEG / CA </td><td> 4 ز PEG4000 3 مل من H 2 O 2.5 مل مانيتول 0.8 M 1 مل 1M CaCl 2 </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 ملي كلوريد الصوديوم 125 ملم CaCl 2 5 ملم بوكل 2 مم زارة التربية والعلم (الرقم الهيدروجيني 5.7) </td></tr></tbody></table>

البولي ايثيلين جلايكول كفاءة تحويل ساطة (peg) من موس physcomitrella patens</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

وصفت طريقة بسيطة وفعالة لتحويل Physcomitrella protoplasts pantens. ويتم تكييف هذا الأسلوب من بروتوكولات لPhysocmitrella protonemal الجبلة المجردة وArabidopsis التحول الجبلة المجردة mesophyll 1. نظرا لقدرتها على الخضوع لالإنقسامية كفاءة إعادة التركيب مثلي ، فقد برزت Physcomitrella patens كنظام نموذجا هاما في السنوات الأخيرة 2. هذه القدرة تسمح للترددات عالية من استهداف الجينات 3-9 ، الذي لا ينظر في محطات أخرى مثل نموذج Arabidopsis. للاستفادة الكاملة من هذا النظام ، ونحن في حاجة الى طريقة فعالة وسهلة لإيصال الحمض النووي في خلايا الطحلب. الطرق الأكثر شيوعا لتحويل هذا الطحلب والقصف الجسيمات (10) والربط بوساطة الحمض النووي امتصاص 11. على الرغم من القصف الجسيمات يمكن أن يؤدي إلى كفاءة عالية التحول 12 ومدافع الجينات ليست متاحة بسهولة إلى العديد من المختبرات والبروتوكول من الصعب توحيد. من ناحية أخرى ، PEG التحول توسط لا يتطلب معدات متخصصة ، ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مع غطاء العقيمة. هنا ، وتبين لنا طريقة بسيطة وفعالة للغاية لتحويل protoplasts الطحلب. هذا الأسلوب يمكن أن تولد أكثر من 120 ميكروغرام لكل عابر transformants من الحمض النووي ، وهو ما يشكل تحسنا من البروتوكول الأكثر كفاءة ذكرت سابقا 13. بسبب كفاءته ، والبساطة ، واستنساخ ، يمكن تطبيق هذه الطريقة للمشاريع التي تتطلب عددا كبيرا من transformants فضلا عن التحول الروتينية.

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لتحويل<em&gt; Physcomitrella pantens</emيوصف&gt; protoplasts. ويتم تكييف هذا الأسلوب من بروتوكولات<em&gt; Physocmitrella</em&gt; protonemal والجبلة المجردة<em&gt; Arabidopsis</em&gt; التحول mesophyll الجبلة المجردة<sup&gt; 1</sup&gt;.

البولي ايثيلين جلايكول كفاءة تحويل ساطة (PEG) من موس Physcomitrella patens</em

توصَف هنا طريقة بسيطة وفعالة لتحويل البروتوبلاست في نبات *Physcomitrella patens*. وقد تم تكييف هذه الطريقة من بروتوكولات خاصة بنبات *Physcomitrella*...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحويل بروتوبلاست SCO Metre. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق هضم النباتات باستخدام Drizly. بعد ذلك، يتم غسل البروتوبلاست باستخدام المانيتول لإزالة Drizly، ثم تُحضن مع DNA وpeg.أخيراً، يتم توزيع البروتوبلاستات المحولة على أطباق ثم تُحضن. وفي النهاية، يمكن الحصول على النتائج التي تظهر البروتوبلاستات المحولة وهي تعبر عن بروتينات مُعلمة فلورياً من خلال المجهر الفلوري. وسيقوم Y lu، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها فعالة وتنتج باستمرار بروتوبلاستات تعبر عن البروتين المطلوب. لعزل بروتوبلاستات الحزازيات، ابدأ بإضافة 9 mL من المانيتول بتركيز 8% في طبق بتري باستخدام ملعقة مسطحة. ضع حزازيات يتراوح عمرها من خمسة إلى سبعة أيام من طبقين إلى ثلاثة أطباق PP NH4 في المانيتول. يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق لهذا الإجراء ولوصفات الكواشف الإضافية. بعد ذلك، أضف 3 mL من 2%drizly واحضن العينة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف لمدة ساعة واحدة.قم بترشيح الخليط عبر مشبك بمسامية 100 micron للحصول على معلق أخضر متجانس. ثم قم بتدوير الراشح بسرعة 250 G لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي بحذر شديد.أعد تعليق البروتوبلاستات في 500 µL من المانيتول بتركيز 8%. ثم أضف 9.5 mL إضافية من المانيتول بتركيز 8%. تأكد من تعليق البروتوبلاستات بشكل كامل.كرر خطوات الغسل مرتين إضافيتين عن طريق تدوير المحلول مرة أخرى عند 250 G لمدة خمس دقائق. تخلص من الطافي ثم أعد تعليق البروتوبلاستات، أولاً في 500 ميكرولتر.ثم يتم إضافة 9.5 milliliters من mannitol بتركيز 8% باستخدام مقياس خلايا الدم (hemo cytometer). قم بعدد البروتوبلاست في 10 µL من المعلق لتحويل DNA إلى البروتوبلاست المعزولة. أولاً، قم بطرد مركزي خليط البروتوبلاست عند 250 ×g لمدة خمس دقائق.أزل السائل الطافي وأعد تعليق البروتوبلاستات بتركيز 1.6 مليون لكل ملليلتر في محلول MMG. حضن المعلق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، أضف 600 µL من محلول البروتوبلاستات إلى أنبوب زراعة يحتوي على 60 µg من DNA. رج الأنبوب.أضف 700 µL من محلول PEG الكالسيوم برفق ثم رجّ الأنبوب. حضّن العينة جيداً في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة خلال فترة الانتظار هذه. قم بتغطية أطباق PRMB بـالسيلوفان.بعد ذلك، خفف المعلق باستخدام 3 mL من محلول W5 ثم قم بالتدوير عند 250 G لمدة خمس دقائق. ولإزالة PEG، أعد تعليق البروتوبلاست في 2 mL من PRMT، ثم وزع 1 mL على كل طبق PRMB مغطى بـ cellophane. احتفظ بالأطباق عند درجة حرارة 25 °C في غرفة نمو.أخيراً، بعد أربعة أيام من عملية التحويل، انقل السيلوفان إلى أطباق انتخاب جديدة. يوضح هذا الشكل مثالاً لنباتات عمرها 18 يوماً تم تجديدها من البروتوبلاست، والتي حُوِّلت باستخدام 15 micrograms من الـ DNA البلازميدي فائق الالتفاف الذي يحمل شريط مقاومة للهيجروميسين. هنا، تم تحويل 30 micrograms من نفس الـ DNA البلازميدي فائق الالتفاف إلى البروتوبلاست.تم تحويل 60 micrograms من DNA الملتوي في هذه العينة. وأخيرًا، تم تجديد هذه النباتات من البروتوبلاست التي حُولت باستخدام 120 micrograms من نفس DNA البلازمي فائق الالتواء الذي يحمل كاسيت مقاومة الـ hygromycin. ولا تتأثر كفاءة التحويل بتركيزات DNA التي تصل إلى 60 micrograms.ومع ذلك، فإن التركيزات الأعلى من DNA تكون ضارة بهذا الإجراء. وتشير البيانات إلى أن هذه الطريقة تعطي نتائج متسقة عبر نطاق واسع من كميات DNA في المرة الواحدة. ويمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق إضافية مثل تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNAi) العابر وتعطيل الجينات للإجابة على أسئلة إضافية حول وظيفة الجين.

efficient-polyethylene-glycol-peg-mediated-transformation-moss

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

بروتوكول يصف تعبير البروتين باستخدام الخميرة...

التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris</em

توضح هذه المقالة التحول الجيني للطحلب البحرية وحيدة...

الجينومية التحول من Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

يوصف منهجية الإنتاجية العالية، الآلي، إنتاج البروتوبلازم التبغ والتحول. النظام الآلي يمكن التعبير الجيني الموازي واسع والاكتشاف في نظام نموذجي BY-2 التي ينبغي أن تكون للترجمة للمحاصيل غير النموذجية.

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

نحن تصف استراتيجية استبدال الجينات قوية لمعالجة وراثيا فطر التفحم السوادية الذروية. يشرح هذا البروتوكول كيفية توليد المسوخ الحذف للتحقيق في الظواهر العدوى. ويمكن أن تمتد إلى تعديل الجينات بأي شكل من الأشكال المطلوبة، على سبيل المثال، عن طريق إضافة تسلسل ترميز علامة بروتين فلوري.

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وفعالة لإعداد كميات كبيرة من فول الصويا بروتوبلاستس لدراسة آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية.

طريقة بسيطة لعزل بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيق لتحليل التعبير الجيني عابر

التحول المتبعة بوساطة استخدام أسلوب الأزهار تراجع يمكن أن تستخدم بنجاح لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة من طراز اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. نحن نقدم على بروتوكول تعديل من أن نبات التمويل، النظر في عادات مختلفة للنمو والخصائص الفسيولوجية اكستريموفيتي.

النباتات النمو والتحول فلورال-تراجع المتبعة بوساطة من اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا

هنا ، نقدم بروتوكولا عالي الإنتاجية لنقل ملايين بروتوبلاستات الذرة بشكل عابر لاختبار مكتبات كبيرة من البلازميدات في خلايا ميزوفيل الذرة.

قابلية النقل القابلة للتطوير لبروتوبلاستات ميزوفيل الذرة

يحدد هذا البروتوكول استخدام التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) لدمج الجينات (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للطحالب الدقيقة الخضراء Chlorella vulgaris ، مما يؤدي إلى إنتاج محولات مستقرة.

Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

نقدم بروتوكولا بسيطا وفعالا وقابلا للتكرار لتحويل نبات Phytophthora palmivora بواسطة البكتيريا الزراعية، وهو أيضا قابل للتطبيق على P. capsici.

طريقة مبسطة لتحويل نبات نبات البالميفورا بواسطة البكتيريا الزراعية

تزايد بعض اصناف الكتان تحت الضغط النتائج المغذيات في الاختلاف الجيني في داخل مجموعة فرعية من الجينوم والتباين المظهري. ويرتبط المجمع الإدراج في موقع معين مع النمو في ظل الأنظمة المختلفة والمواد الغذائية مع التغيرات في التعبير الجيني للتغلب على هذه المواقع.

المستحثة بيئيا توريثه التغييرات في كتان

تعلم تحويل البروتوبلاستات في طحلب Physcomitrella patens باستخدام البولي ايثيلين جلايكول. هذه الطريقة الفعالة تتيح التعبير عن البروتينات المُصنَّعة وراثياً لدراسة وظائف الجينات في النباتات.

البولي ايثيلين جلايكول كفاءة تحويل ساطة (PEG) من موس Physcomitrella patens

استكشف المزيد من الفيديوهات