NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

يعتبر نظام استبقاء العينات في جهاز NanoDrop تقنية مبتكرة تستخدم التوتر السطحي المتأصل للسوائل لحجز وقياس عينات ذات أحجام ميكروية بين قاعدتين بصريتين دون الحاجة إلى استخدام أنابيب الكوارتز (QTS) أو الشعيرات الدموية. يتم سحب كمية ضئيلة من العينة تصل إلى 1 µL ونقلها مباشرة فوق السطح البصري السفلي. وعند إغلاق ذراع المقياس الطيفي، يتشكل عمود سائل بين القاعدتين البصريتين العلوية والسفلية.

من خلال التوتر السطحي الذي يشكل مسارًا بصريًا رأسيًا، يمكن لطول المسار الرأسي أن يتغير تلقائيًا في الوقت الفعلي أثناء القياس. ويسمح تقصير طول المسار بقياس تركيزات أعلى، مما يلغي الحاجة فعليًا إلى إجراء عمليات تخفيف لمعظم عينات الأحماض النووية. علاوة على ذلك، يسرع نظام استبقاء العينة العملية التجريبية بفضل عملية تنظيف سريعة، تتمثل ببساطة في مسح الأسطح البصرية باستخدام منديل مختبر (laboratory Wipe).

سنقوم اليوم بشرح إجراءين لتحديد تركيز الحمض النووي باستخدام أجهزة قياس الأحجام الدقيقة من شركة Thermo Scientific. يتضمن البروتوكول الأول قياساً مباشراً للحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000 C. أما البروتوكول الثاني فهو قياس غير مباشر للحمض النووي عن طريق الفلورة باستخدام مقياس الطيف الفلوري NanoDrop 3, 300.

للبدء، قم بتنظيف الأسطح البصرية العلوية والسفلية لنظام استبقاء العينات في مقياس الطيف الضوئي للمجالات الدقيقة عن طريق نقل 2 إلى 3 µL من الماء منزوع الأيونات النظيف إلى السطح البصري السفلي. أغلق ذراع الرافعة مع التأكد من ملامسة القاعدة العلوية للماء منزوع الأيونات. ارفع ذراع الرافعة وامسح كلا السطحين البصريين باستخدام منديل مختبري نظيف وجاف وخالٍ من الوبر.

بعد ذلك، افتح برنامج NanoDrop وحدد تطبيق الحمض النووي. استخدم ماصة معايرة ذات حجم صغير لإجراء قياس فارغ (blank) عن طريق وضع 1 µL من المحلول المنظم على السطح البصري السفلي. اخفض ذراع الرافعة واختر "blank" في تطبيق الحمض النووي.

بمجرد اكتمال قياس العينة الفارغة، نظف كلا السطحين البصريين باستخدام منديل مختبري. وكما سبق، اختر الثابت المناسب للعينة المراد قياسها. بعد ذلك، ضع 1 µL من عينة الحمض النووي على القاعدة البصرية السفلية وأغلق ذراع الرافعة.

بما أن القياس لا يعتمد على الحجم، فإن العينة تحتاج فقط إلى سد الفجوة بين السطحين البصريين. ولإجراء القياس، اختر "measure" في برنامج التطبيق، وسيقوم البرنامج تلقائياً بحساب تركيز الحمض النووي ونسب النقاء. بعد قياس العينة، راجع المخرج الطيفي؛ حيث ستظهر عينة الحمض النووي النموذجية ملفاً تعريفياً مميزاً للغاية.

تشمل المؤشرات الطيفية لتدني جودة العينة وجود شقوق في الطول الموجي في القاع وفي ذروة 260 نانومتر. وتتضمن المصادر الشائعة للملوثات المرتبطة بتقنيات عزل الأحماض النووية المحددة الفينول والتريول والاستخلاص بالأعمدة. وفي حالة الاستخلاص بالفينول والتريول، قد يُستدل على تلوث الكاشف المتبقي من خلال أطياف غير طبيعية بين 220 و240 نانومتر، بالإضافة إلى إزاحات في المنطقة من 260 إلى 280 نانومتر.

وعلى العكس من ذلك، فإن بقايا الجوانيدين الناتجة عن استخلاص الأعمدة قد تساهم في ظهور قمة بالقرب من 230 نانومتر وإزاحة في القاع من 230 نانومتر إلى 240 نانومتر تقريباً. ولتقييم نقاء العينة بدقة، يجب تحليل نسبة 2 62 80 و2 62 30 بالاقتران مع الجودة الطيفية العامة. وعادة ما تعطي الأحماض النووية النقية نسبة 2 62 80 تبلغ 1.8 تقريباً لـ DNA و2.0 تقريباً لـ RNA على التوالي.

تعتمد هذه النسبة على pH والقوة الأيونية للمحلول المنظم المستخدم في قياسات العينة والعينة الفارغة. يستخدم جهاز Banana drop 3, 300 fluoro spectrometer نظام احتجاز العينات ذو الحجم الميكروي الحاصل على براءة اختراع والمستخدم في جهاز NanoDrop 2000 C spectrophotometer. ونظراً لأن قياسات الفلورة تُجرى باستخدام كمية ضئيلة من العينة تصل إلى 1 µL، يختار المستخدم أحد ثلاثة صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) كمصدر لإثارة العينة، حيث يتم توجيه الإثارة نحو العينة أفقياً.

يتم بعد ذلك تجميع الفلورة الناتجة عن العينة بزاوية 90 درجة رأسيًا في مطياف داخلي. ولإثبات الحساسية العالية في تقدير كمية الأحماض النووية ذات الحجم الميكروي باستخدام NanoDrop 3، يتم استخدام طقم Pico Green للفلورة؛ حيث نبدأ بموازنة معايير الطقم وجميع عينات الأحماض النووية عند درجة حرارة الغرفة. وتجدر الإشارة إلى أن العينات الفلورية حساسة للضوء، لذا يجب حفظها في أنابيب كهرمانية اللون أو مغلفة برقائق الألومنيوم.

قم بتحضير كمية كافية من منظم XTE بتركيز 1X لجميع المعايير والعينات المراد قياسها، وكذلك لمحلول عمل pico green المطلوب. يتم تحضير منظم XTE بتركيز 1X عن طريق تخفيف منظم XTE بتركيز 20X الموفر باستخدام ماء خالٍ من النيوكلياز وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. يمكن أن تتراوح أحجام التفاعل من 200 µL إلى أقل من 10 µL.

في هذا المثال، سنقوم بتحضير أحجام تفاعل تبلغ 10 µL. بعد ذلك، يتم تحضير معايير DNA مزدوج السلاسل مخففة تسلسلياً، بالإضافة إلى عبوات أو أنابيب خالية من النوكلياز. سيغطي ذلك نطاق التركيز المتوقع لعينات DNA المجهولة.

انقل 5 µL من كل معيار من معايير DNA مزدوج الشريط المخففة إلى أنبوب عنبري اللون أو مغطى برقائق القصدير، بحيث يكون كل أنبوب مُسمى بشكل منفصل وخالياً من النوكلياز. ثم قم بتوزيع 5 µL من كل عينة DNA مزدوج الشريط المراد دراستها في الأنبوب المناسب والمحمي من الضوء. بعد تحضير محلول التشغيل لـ Pico Green وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، انقل حجماً مساوياً من المحلول إلى كل أنبوب يحتوي إما على معيار DNA مزدوج الشريط أو عينة DNA مزدوج الشريط، وفي هذه الحالة تكون الكمية 5 µL.

امزج أحجاماً متساوية من محلول XTE المنظم ومحلول Pico Green التشغيلي. لتحضير الضابط السلبي الذي يعمل كمحلول مرجعي، اخلط محتويات كل أنبوب جيداً عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة، ثم اتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

يجب موازنة جميع المعايير والعينات عند درجة الحرارة نفسها قبل القياس، حيث تتأثر الإشارة الفلورية بدرجة الحرارة. ولتجهيز الجهاز وإجراء القياسات أولاً، نظف السطحين السفلي والعلوي لنظام تثبيت العينة، ثم ضع باستخدام الماصة من 2 إلى 3 µL من الماء منزوع الأيونات على السطح البصري السفلي وهو مغلق. بعد ذلك، افتح ذراع الرافعة وجفف القاعدة العلوية والسفلية باستخدام منديل مختبري نظيف وخالٍ من الوبر.

تأكد من خلو الأسطح من الوبر قبل المتابعة؛ وذلك لأن الوبر قد يُظهر فلورة في وجود مصدر استثارة، مما قد يتداخل مع عملية القياس. افتح برنامج الجهاز.

اختر تطبيق الأحماض النووية ثم اختر خيار pico green للحمض النووي مزدوج السلسلة، وانقل 2 µL من 1 XTE إلى القاعدة السفلية. أغلق ذراع الرافعة واختر "blank" في حقل برنامج الجهاز. بمجرد اكتمال عملية التصفير، قم بتجفيف محلول التصفير من كلا سطحي نظام احتجاز العينة.

بعد ذلك، اخلط المحلول المرجعي عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام رؤوس ماصات منخفضة الاحتفاظ. انقل 2 µL من المحلول المرجعي إلى القاعدة السفلية ثم أغلق ذراع الرافعة. اختر "reference" من علامة تبويب المعايير (standards) وحدد الوحدات المطلوبة.

انقر فوق "measure" لبدء دورة القياس. عند اكتمال دورة القياس، افتح ذراع الرافعة وقم بتجفيف أسطح نظام الاحتفاظ بالعينة جيداً. قم بقياس ما يصل إلى خمس مكررات للمرجع باستخدام Eloqua جديد لكل مكرر.

كرر العملية للمعايير الإضافية لإنشاء منحنى قياسي. يمكن استخدام ما يصل إلى سبعة معايير، وقد صُمم البرنامج لتخزين ما يصل إلى خمس مكررات لكل معيار.

يتم حساب متوسط مكررات المعايير لإنشاء منحنى قياسي تُحدد من خلاله تركيزات العينات تلقائياً. وبمجرد اكتمال المنحنى القياسي، اختر علامة تبويب العينات، وأدخل معلومات معرف العينة المقابلة، ثم قم بقياس كل عينة مجهولة. ويشير المنحنى الصالح إلى أنه قد تم استيفاء الحد الأدنى من عدد المعايير.

يتم تحديد تركيز DNA تلقائياً بناءً على المنحنى القياسي. يمكن لأجهزة NanoDrop ذات الحجم الميكروي تحديد تركيز الحمض النووي إما عن طريق قياسات A260 المباشرة أو باستخدام الطرق الفلورية غير المباشرة. كما يمكن استخدام أجهزة NanoDrop spectrophotometers لقياس كمية البروتينات باستخدام امتصاص A280 المباشر أو عن طريق مقاييس البروتين اللونية.