التصوير الضوئي للخلايا العصبية في العقدة كراب فموي معدي مع الجهد حساسة للملونات

الهدف من التجربة التالية هو استخدام الأصباغ الحساسة للجهد لتسجيل التغيرات المحتملة للغشاء بصريا والتفاعلات المشبكية بين الخلايا العصبية في مولدات النمط المركزي للعقدة النجمية القشرية St Somatic. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل الخلايا العصبية المحددة مع DD ثمانية وفي PQ عن طريق حقن الشبكية الأيونية باستخدام أقطاب كهربائية دقيقة حادة وتسجيل متزامن خارج الخلية لنشاط العصب الحركي كخطوة ثانية ، يتم إثارة مضان الصبغة الحساسة للجهد بواسطة الضوء الأخضر ، مما يسمح بتصوير التغيرات الفلورية التي تتوافق مع التغيرات في إمكانات غشاء الخلية. بعد ذلك ، يتم تحليل بيانات الصورة عن طريق اختيار منطقة ذات أهمية في غشاء الخلايا العصبية ومقارنة الإشارة الضوئية بنشاط الدراجة خارج الخلية المسجل من أجل تحديد إمكانات الفعل والإمكانيات المتشابكة.

في الصورة ، يتم الحصول على نتائج الخلايا العصبية التي تظهر التسجيل البصري للخلايا العصبية المولدة للنمط المتفاعل متشابك يمكن أن تكمل تقنيات التسجيل التقليدية وتفتح فرصا جديدة لفهم كيفية عمل الشبكات العصبية لمولد النمط المركزي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التسجيلات الإضافية وبين الخلايا ، هي أنه بعد ملء الغوص ، يمكن تحقيق التسجيلات البصرية للتغيرات المحتملة للأعضاء والتفاعلات المشبكية دون القيود الفراغية التي يفرضها وضع القطب الكهربائي ودون مزيد من الضرر للخلايا العصبية أثناء التسجيلات طويلة المدى. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة إضافية لتوليد النمط في عقدة المعدة القشرية.

يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل الحركة والتنفس في الفقاريات. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن حقن اختيار D وإعداده أمر صعب ، ويجب تعيين معلمات تحليل بيانات الصورة بشكل كاف لاكتشاف التغيرات المحتملة في الغشاء. ابدأ الاستعدادات بصنع محلول صبغة الفلورسنت في قارورة بلاستيكية ، ومزيج خمسة ملليغرام من الصبغة الحساسة للجهد الفلوري D ثمانية و FPQ مع مليلتر واحد من حمض الأونيك F1 27 في محلول DMSO.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للصبغة الذائبة لمدة 20 دقيقة بمعدل 12 ، 000 دورة في الدقيقة. من أجل فصل جزيئات D الأكبر حجما التي قد تسد القطب الصغير بعد مستخدم الطرد المركزي الذي تم إعداده لشفط أعلى 200 ميكرولتر من supinate ، قم بطرد supinate في قارورة بلاستيكية منفصلة. لف القارورة بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء.

قم بتخزين محلول D في فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر في يوم التجربة. قم بإذابة محلول الصبغة عن طريق وضع القارورة الملفوفة في ماء 25 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. للتحضير للتسجيلات ، ابدأ بعزل الجهاز العصبي المعدي الجسدي STS للسلطعون وإزالة تغليف العقدة المعدية الجسدية.

ضع الفازلين حول جزء من العصب البطيني الجانبي أو LVN لإنشاء حجرة معزولة كهربائيا. استخدم طين النمذجة لربط طبق بتري بمنصة التشغيل لمجهر التصوير. ضع سلكا كهربائيا من الفولاذ المقاوم للصدأ في حجرة الفازلين للتسجيل من مكان LVN ، وهو قطب كهربائي آخر من الفولاذ المقاوم للصدأ في الحمام كقطب مرجعي.

عندما يتم إذابة المحلول D ، ارسم ما يكفي من المحلول D لملء ما يقرب من ثلثي إبرة الملء الدقيق. قم بحقن المحلول D من إبرة الملء الدقيق في طرف قطب كهربائي زجاجي صغير. قم بتغطية القطب الكهربائي المملوء بالصبغة بصندوق وانتظر 15 دقيقة.

ثم قم بإعادة ملء القطب الصغير بمحلول كلوريد البوتاسيوم ثلاثي المولار. ضع القطب الصغير مرة أخرى في صندوق تخزين قطب كهربائي مظلم لمدة 10 إلى 20 دقيقة للسماح بعمل الشعيرات الدموية لسحب محلول النرد إلى الطرف الدقيق للقطب. بعد 10 إلى 20 دقيقة ، ضع القطب الصغير في حامل قطب كهربائي وقم بتوصيله بمرحلة رأس مكبر الصوت داخل الخلايا.

توصيل مكبر الصوت داخل الخلايا بلوحة الحصول على البيانات التي توفر إشارة نبضية لدفع النبضات الحالية إلى القطب الصغير. بعد ذلك ، اضبط القطب الصغير على زاوية مائلة وضع طرفه فوق عقدة المعدة الجسدية. اخفض هدف المجهر حتى يصبح طرف القطب في بؤرة التركيز.

ثم اخفض الهدف ، مع الحرص على التوقف قبل لمس القطب الصغير. ثم اخفض القطب الصغير حتى يظهر مرة أخرى. في تركيز التقدم الموضوعي في مراقبة الراسم ، اخترق برفق غشاء الخلايا العصبية العقدية المعدية الجسدية المختارة.

في هذه المرحلة ، قارن إمكانات العمل المسجلة داخل الخلايا وخارجها. من أجل تحديد الخلايا العصبية المخوزقة ، ابدأ حقن الصبغة عن طريق تبديل مكبر الصوت داخل الخلايا إلى وضع الحقن الحالي وحقن 10 خطوات تيار موجب نانو في القطب الصغير. يجب أن تستمر الخطوات الحالية لمدة ثانية واحدة ، مفصولة بفجوات ثانية واحدة بدون تيار.

استمر في هذا الحقن الحالي لمدة 30 دقيقة. بعد 10 دقائق من حقن الصبغة ، استخدم نظام التصوير MYCA zero two للتحقق من انتشار الصبغة داخل الخلايا العصبية. كرر هذا ، تحقق بعد 30 دقيقة.

إذا نجحت حشوة الصبغة ، فيجب أن تنمو الرقعة المصبوغة حول القطب الصغير بين الصور التي تتراوح مدتها 10 دقائق و 30 دقيقة. اسحب القطب الكهربائي من الخلية العصبية واترك الخلايا العصبية تسترخي لمدة 20 إلى 30 دقيقة على الأقل للسماح للصبغة بالانتشار أكثر في الخلية. خلال هذا الوقت ، يمكن حقن خلية عصبية أخرى بالصبغة.

قم بالتبديل إلى هدف كفاءة نقل التمييز 20 مرة على نظام التصوير MYAM zero two. أعد وضع مرحلة تشغيل المجهر حسب الحاجة ، وركز على الخلايا العصبية للمجال D. قم بتغذية بيانات التسجيل خارج الخلية في نظام التصوير من خلال قناة الإدخال التناظرية الخاصة به.

أطفئ إضاءة الغرفة وجميع مصادر الإضاءة المتبقية. بالإضافة إلى ذلك ، أغلق ستارة سوداء حول جهاز التسجيل لمنع التعرض للضوء من المصادر الخارجية. اضبط نظام التصوير على دقة البكسل المناسبة ووقت التصوير الموضح في الرسم البياني.

إذا لم تكن الصبغة في الخلايا العصبية قوية جدا ، فاستخدم إعداد H bin. اضبط مستوى ضوء المجاهر عند أدنى مستوى ممكن لتجنب تعديل الصور وتلف الصور للخلايا العصبية المسجلة. اضبط جلسات التصوير على ما بين أربع إلى 16 ثانية.

ثم سجل النشاط التلقائي للخلايا العصبية DY خلال عدة جلسات تصوير. لبدء تحليل الاستجابات البصرية باستخدام برنامج التصوير BV A NA ، حدد منطقة دائرية مناسبة على كل خلية عصبية مسجلة إذا كان التنعيم الزمني للبيانات ضروريا. على سبيل المثال ، إذا كان D يولد كمية منخفضة نسبيا من التألق ، فاستخدم البرنامج لتطبيق التنعيم الزمني بثلاث إلى خمس وحدات زمنية.

يتم تحديد الخلايا العصبية المحقونة بالصبغة في الجزء العلوي الأيسر من هذا الشكل على أنها خلية عصبية باركنسون وخلية عصبية LP على أساس تسجيلاتها داخل الخلايا. تظهر آثار الجهد على يمينها الاستجابات البصرية التلقائية من كل خلية عصبية. يظهر التسجيل خارج الخلية ل LVN في أسفل الشكل.

الخلايا العصبية LP و PD هي جزء من مولد النمط المركزي البواب لعقدة المعدة الجسدية ومثبطة متبادلة. يمكن مطابقة تسجيلاتهم البصرية بشكل جيد مع التسجيلات خارج الخلية ل LVN. يظهر الجزء الداخلي في الجزء السفلي تراكبا لعدة عمليات مسح لإمكانات عمل LP ومتوسطها يوضح التطابق بين الأنشطة المسجلة بصريا وكهربائيا.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التلوين المناعي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل نوع المشابك التي شاركت في إحداث التغيرات المحتملة في الغشاء الملحوظة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل الخلايا العصبية المتعددة المحددة والأخلاقية في العقد المعدية في المعدة.