FISH ما قبل انغراس التشخيص الوراثي

توضح هذه المقالة اختيار تحقيقات مناسبة للأسماك وحيدة الخلية ، وتقنيات لنشر قسيم أرومي النوى ، والتهجين في الموقع وسجل إشارة ، تطبق على التشخيص الجيني قبل الزرع (PGD) في عملية إعداد سريرية.

الهدف من هذا الإجراء هو استخدام تقنية التهجين المضان في الموقع لتحديد حالة الكروموسوم الجنسي أو الإزاحة للأجنة البشرية في المختبر المعرضة لخطر حدوث خلل وراثي. يتم تحقيق ذلك عن طريق التحلل ، وهي خزعة من خلية واحدة من جنين اليوم الثالث على شريحة زجاجية وتجفيف النواة بالهواء. الخطوة الثانية هي ترميز الطبيعة D وتهجين الحمض النووي للنواة المستهدفة باستخدام مجسات الحمض النووي المسمى بالفلوروكرومات بألوان مختلفة.

بعد ذلك ، تتم إزالة المسبار الزائد باستخدام غسيل صارم ويتم تلطيخ النواة بصبغة فلورية خاصة بالحمض النووي. الخطوة الأخيرة هي عرض النواة باستخدام المجهر الفلوري والتقاط الصور الرقمية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح رقم نسخ مناطق الكروموسوم المستهدفة من خلال الفحص المجهري الفلوري.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأنها في أقصى حد من تقنية التهجين المضان في الموقع. قبل 24 ساعة ، قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلية لنشر الخلايا. قم بتصفية المحلول وتوزيع مليلتر واحد من الحصص إلى 10 إلى 15 ، 1.7 مليلتر من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة ، وأغلق وتسمية الأنابيب قبل التجميد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر قبل إجراء الخزعة مباشرة.

قم بإذابة عازلة التحلل في درجة حرارة الغرفة. سجل دائرة صغيرة قطرها حوالي خمسة ملليمترات على الجانب السفلي من شريحة مطلية بالأمين باستخدام قلم ماسي ، ثم استخدم قلم رصاص صلب بأربعة H مسمى مسبقا على الشريحة BLO بقفاز من اللاتكس. لإزالة أي غبار من الجرافيت ، استخدم شريحة منفصلة لكل مرآة مكبر بترتيب رقمي.

الآن ضع حجما صغيرا من المخزن المؤقت للتحلل داخل الدائرة. انقل مكبر الخزعة إلى مخزن التحلل. أضف المخزن المؤقت للتحلل حسب الضرورة لتحلل الخلية.

راقب النواة للتأكد من بقائها داخل الدائرة وعدم فقدانها. إذا لم يكن للخلية نواة أو تحتوي على نوى متعددة ، فقم بإجراء خزعة من خلية أخرى. اترك الشريحة لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

أولا ، اغسل العينات مسبقا في برطمانات مشتركة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اشطفها مرتين بالماء المقطر المعقم ، والمجفف بسلسلة الإيثانول لمدة دقيقتين ، كل منهما في درجة حرارة الغرفة ويجفف في الهواء. تأكد من غمر الشرائح بالكامل وإذا طاف أي غبار من الجرافيت على السطح ، امتصاصه بمنديل نظيف.

سجل موضع النواة داخل الدائرة من خلال التصور باستخدام مجهر تباين الطور. ثم قم بتجفيف العينات بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وتجفيفها في الهواء. الآن ضع ميكرولترين من خليط المسبار وقم بتغطيته بقلة غطاء تسعة في تسعة ملليمترات.

أغلق حواف زلة الغطاء بالأسمنت المطاطي. قم بإجراء الترميز المشفر. ضع على كتلة حرارية عند 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتهجينها طوال الليل في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لكل جرة اقتران.

قم بتوازن 50 مل من محلول الغسيل الصارم SSC 0.4 مرة في حمام مائي 71 درجة مئوية. ضع زجاجة الغسيل الصارمة وجرة التوصيل الفارغة في الحمام المائي على حرارة الغرفة إلى 71 درجة مئوية درجة الحموضة ، والغسيل الصارم وصب في برطمانات كوشين. استمر في إزالة الأسمنت المطاطي بعناية من كل شريحة واشطف زلة الغطاء باستخدام أربع مرات SSC 0.05٪ بين 20 درجة حموضة سبعة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل العينات في الغسيل الصارم SSC 0.4 مرة عند 71 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، تليها أربع مرات SSC 0.05٪ Tween 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بالنسبة للمجسات التي تم تصنيفها بشكل غير مباشر ، قم بتصريف شرائح السائل الزائد وقم بتطبيق 20 ميكرولترا من الجسم المضاد المترافق بالفلورسنت تحت 20 × 20 ملم مربع من الطفيلة. احتضن في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

قم بإزالة الفيلم وقم بإجراء عمليات الغسيل التالية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. مرة كل أربع مرات SSC 0.05٪ بين 20 ومرتين لمدة دقيقتين في PBS. بعد تصريف الشرائح ، ضع ستة ميكرولترات من وسط تركيب الدرع المتجه الذي يحتوي على DPI على 22 × 22 ملم.

انزلاق غطاء الرقم صفر واقلب الشريحة فوق الغطاء. انزلق وصمة عار وأغلق حواف زلة الغطاء بورنيش الأظافر الشفاف. أخيرا ، قم بتحليل العينات عن طريق المجهر الفلوري.

سجل كل نواة بواسطة محللين مستقلين. استخدم أيضا برامج التصوير لالتقاط صورة للنواة لتأكيد التشخيص البصري وأرشفة الصور كجزء من ضمان جودة المختبر. هنا يشير انتشار الطور ونواة الطور البيني المحضرة من الخلايا الليمفاوية الدموية المحيطية إلى ناقل انتقال متبادل بين الأذرع القصيرة للكروموسومات خمسة وتسعة مع نقاط كسر عند خمسة P 14.3 وتسعة P اثنين ، 4.1.

تضيء مجسات الأسماك كلا من الأجزاء المتحولة والجزء المركزي من إشارات الكروموسوم التسعة. في مجرد نوى من اليوم الثالث ، يمكن التقاط الأجنة ثم دمجها لتشكيل صورة مركبة. تشير إشارتان لكل مسبار إلى نسختين من كل موضع ، وهو ما يتوافق مع مكمل عادي أو متوازن.

بالنسبة لكروموسومات الإزاحة ، تشير الإشارات الملونة إلى نسخة واحدة من الجزء العابر الموجود من الكروموسوم ، وخمس نسخ وثلاث نسخ من الجزء الموجود عبر الكروموسوم التاسع ، ونسختين من الجزء المركزي من كروموسوم CH التاسع. تتوافق هذه البيانات مع حاصل ضرب غير متوازن لرجل سومي لخمسة P 14.3 إلى خمسة PT والتثلث الصبغي لتسعة P اثنين ، 4.1 إلى تسعة نقاط. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل خلية واحدة مأخوذة من جنين بشري وإعداد نواة واحدة باستخدام تقنية التهجين الفلوري في الموقع.

هذا مهم لتحقيق نتائج اختبار قابلة للتكرار ومثالية لتحديد مكمل الكروموسوم الجنسي ، أو حالة نقل الجنين.