Name: FISH ما قبل انغراس التشخيص الوراثي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: تعلم تقنية FISH للتشخيص الوراثي قبل الانغراس في الأجنة البشرية. يوضح هذا البروتوكول تحليل الخلايا المنفردة لتحديد التحويلات الكروموسومية والحالات الوراثية غير الطبيعية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Lysing ونشر نواة من الخزعة قسيم أرومي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن نكون مستعدين للتحلل الخلية عازلة تنتشر الخلايا (0.2 ٪ Tween20 في حمض الهيدروكلوريك 0.01 م ، ودرجة الحموضة 2.0) 24 ساعة مسبقا وحفظها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تحضير 100 مل وتصفية 20 مل في وعاء معقم 30 مل الجميع باستخدام المحاقن المعقمة وتصفية 20 مل حقنة. 1 مل الاستغناء aliquots في 10-15 1.7 مل أنابيب microcentrifuge العقيمة ، وثيقة وتسمية الأنابيب قبل التجميد. فمن المستحسن أن يكون على دفعتين المختلفة الاستخدام ، دفعة جديدة والدفعة السابقة ، والتي تم اختبارها ويمكن استخدامها إذا كانت دفعة جديدة غير مرضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذويب المنطقة العازلة تحلل في درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة قبل إجراء الخزعة. للأغراض العملية سوف تكون درجة حرارة الغرفة بين درجة الحرارة ودرجة حرارة اليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> درجة دائرة صغيرة (قطرها حوالي 5 ملم) على الجانب السفلي من شريحة أمين المغلفة (مثل Genetix) باستخدام قلم الماس والتسمية قبل الشريحة مع رقم القضية ، فريد رقم الشريحة والتاريخ الخزعة. استخدام شريحة منفصلة لكل قسيم أرومي بالترتيب العددي ، والتسمية مع عدد الأجنة. ينبغي أن توضع على الشرائح مع قلم رصاص الصلبة مثل 4H ، و "نشف" مع القفازات المطاطية لإزالة أي غبار الغرافيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع كمية صغيرة من تحلل العازلة داخل الدائرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قسيم أرومي الخزعة في المخزن المؤقت تحلل. إذا لزم الأمر إضافة العازلة تحلل داخل الدائرة حتى يبدأ في الخلية ليز ، وينبغي الخلية ليز تماما والسيتوبلازم تفريق قبل أن يجف العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة النواة لضمان بقائه ضمن دائرة وضاع لا ؛ إذا كانت الخلية لا يملك نواة أو قد نوى متعددة ، خزعة خلية أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الشريحة لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 2. في الموقع التهجين من نواة واحدة قسيم أرومي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد سلسلة الايثانول (70 و 90 و 100 ٪) تتكون في الماء المقطر المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل وتعيين كتلة ساخنة (على سبيل المثال أو Hybaid Omnislide Hybrite Vysis) إلى 75 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيقات تذويب ، الدوامة ، والطرد المركزي. وينبغي أن شهدت الكواشف والتحقق من أن يكون صحيحا حتى قبل اتخاذ هذا الخليط التحقيق. أحجام ماصة على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة لتعويض خليط التحقيق في أنبوب 0.65 مل microcentrifuge معقمة ودوامة الطرد المركزي وقبل الاستخدام. وينبغي أن الحجم الكلي للخليط التحقيق تكون كافية للسماح لفحصها 2 ميكرولتر في نواة وتقريب تصل إلى 10 ميكرولتر أقرب للسماح بهامش أمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل غسل الشرائح في الجرار coplin باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (7.0 درجة الحموضة : 0.14 م كلوريد الصوديوم ، 3 مم بوكل ، 10 ملي نا 2 هبو 4 ، 2 مم KH 2 PO 4) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شرائح مرتين في ماء مقطر معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى الشرائح مع سلسلة الايثانول (70 ، 90 ، و 100 ٪) عن كل 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والهواء الجاف. مغمورة تماما ضمان الشرائح وإذا كان أي غبار الغرافيت يطفو على السطح ، وتمتص بمنديل نظيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل موقف للنواة داخل دائرة من خلال وضع تصور للمرحلة مجهر التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 2 ميكرولتر من خليط التحقيق ، وتغطي مع 9 × 9 ملم ساترة (1 / 4 من 18 × 18 مم ساترة NO.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حواف ساترة مع الاسمنت والمطاط (مثل الصمغ البقرة ؛ تدقيق البقرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Codenature الشرائح على كتلة الساخنة عند 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم بين عشية وضحاها هجن الشرائح (16-20 ح) في غرفة ترطيب عند 37 درجة مئوية. ويمزج التحقيق التي تتكون بالكامل من تحقيقات السنترومير (أي لحالات مرتبطة بالجنس) تعطي نتيجة مرضية بعد 60 دقيقة من التهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حمام مائي مع الجرار coplin كافية والحرارة إلى 71 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.4x سيترات المالحة القياسية (SSC) صرامة حل غسل (7.0 درجة الحموضة عند 71 درجة مئوية ، وكلوريد الصوديوم 0.06 M 6 مم ، C 6 H 5 O 7 3 نا 0.2 H 2 O) والحرارة في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 50 مل من غسل صرامة في جرة coplin المطلوبة ، وتأكد من أن درجة الحرارة 71 درجة مئوية قبل استخدامها على الفور باستخدام ميزان حرارة نظيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الاسمنت والمطاط من كل الشرائح وشطف قبالة باستخدام ساترة 4X SSC/0.05 Tween20 ٪ (الرقم الهيدروجيني 7.0) في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في غسل SSC 0.4x صرامة في 71 دقيقة لمدة 5 درجة مئوية. غسل ما لا يزيد عن 6 شرائح في جرة coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في 4X Tween20 SSC/0.05 ٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان يحتوي على مزيج المسبار المسبار المسمى بشكل غير مباشر (ق) ، واستنزاف الشرائح من السوائل الزائدة وتطبيق 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة مترافق fluorescently تحت مربع 20 x 20 مم من Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مرطب في غرفة في 37 دقيقة لمدة 15 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة Parafilm ويغسل مرة واحدة في 4X Tween20 SSC/0.05 ٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين لمدة 2 دقيقة في برنامج تلفزيونير درجة حرارة الغرفة واستنزاف الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 تطبيق ميكرولتر من دابي / Vectashield (160 نانوغرام من 4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole هيدروكلوريد في 1 مل من المتوسط ​​Vectashield المتصاعدة ، المتجهات مختبرات) إلى 22 مم 22 × لا. 0 ساترة وعكس الشريحة على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وختم وصمة عار على حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة. </li></ol> 3. التحليل باستخدام مجهر الإسفار مجهزة بالمعدات المناسبة مع الفلاتر المناسبة لمجسات مستعملة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إشارات النتيجة المباشرة التي تصور باستخدام مجهر مضان واحد الفرقة تمرير مرشحات لكل ملون تألقي في مقايسة. وينبغي أن سجل كل نواة من قبل اثنين من المحللين. وينبغي أن يكون المبدأ التوجيهي العام يؤدي الى التهديف من إشارة واحدة حيث إشارتين المتقاربة أقل من مجال واحد (إشارة العرض) وبصرف النظر ، ولكن الحكم على أساس الخبرة يحتاج إلى أن يمارس لتفسير إشارات متفاوتة الحجم والكثافة ، والانفصال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برامج التصوير (مثل إيزيس ، MetaSystems ، Altlussheim ، ألمانيا ؛ CytoVision ، Genetix) لالتقاط صورة من نواة لتأكيد التشخيص البصري ، وأرشفة الصور كجزء من خطة لضمان جودة المختبرات. </li></ol> 4. ممثل النتائج : ينبغي النظر الطورية والطور البيني من نوى الخلايا الليمفاوية مثقف الدم المحيطي للتأكد من أن تحقيقات المختارة هي محددة للصبغيات إزفاء ، بالمعلومات عن نقاط (التحقيقات subtelomere ينبغي هجن فقط على قطاعات وtranslocated التحقيق السنترومير (ق) إلى تتمحور وينبغي أن الجزء (ق)) واشارات في نواة الطور البيني يكون مشرقا ومنفصلة. سجل عدد من الإشارات لكل التحقيق في نواة الطور البيني 100 من كل شريك من المستحسن لتقييم كفاءة الفحص. في هذه الحالة وسجل 2 إشارات في 95 ٪ -99 ٪ من النوى لكل التحقيق. الشكل 1 يبين الطورية ونواة الطور البيني من التحضير لإزفاء متبادلة بين الأسلحة قصيرة من الكروموزومات 5 و 9. وينبغي أن الإشارات في نواة الطور البيني من blastomeres الجنين يكون مشرقا ومنفصلة ومستقلة وسجل باستخدام مرشحات تمرير الفرقة عن الألوان المستخدمة. ويبين الشكل 2 نواة قسيم أرومي مع نمط إشارة طبيعية (2 نسخ عن جميع مواضع اختبار) بما يتفق مع الكروموسومات العادي أو متوازنة للكروموسوم 5 و 9 ، ونواة مع إشارة نمط غير طبيعي يتفق مع منتج غير المتوازن للإزفاء الذي أحاد الصبغي (نسخة واحدة) للجزء translocated من كروموسوم 5 و تثلث الصبغي (3 نسخ) للجزء من كروموسوم translocated 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 وانتشار الطورية ونواة الطور البيني المحضرة من مثقف اللمفاويات في الدم المحيطي من حاملة لإزفاء متبادلة بين الأسلحة قصيرة من الكروموزومات 5 و 9 نقاط في 5p14.3 مع و9p24.1 : 46 ، س ص ، ر (5 ؛ 9) (p14.3 ؛ p24.1) العش ر (5 ؛ 9ptel30 ، 5ptel48 + ، + 9cen) ؛ 9) 5ptel48 ، 9ptel30 + ( وقد تم اختيار كل من الأسماك للتحقيقات شرائح translocated (5p14.3 → 5pter ، أحمر Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed ؛ 9p24.1 → 9pter ، الأخضر Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) وتتمحور حول الجزء من الصبغي 9 (9p24.1 → 9qter ، الأزرق ابوت CEP 9 القمر الصناعي SpectrumAqua ألفا). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> القبض على الرقم 2. إشارات في نواة الطور البيني قسيم أرومي من يوم 3 أجنة باستخدام فلتر مختلفة لكل ملون تألقي ودمجها لتكوين صورة مركبة. (أ) اثنان عن كل الإشارات تشير إلى التحقيق نسختين من كل مكان ، وهو ما يتسق مع تكملة طبيعية أو متوازنة لإزفاء الكروموسومات. (ب) والاشارة الحمراء ، وثلاث إشارات خضراء وزرقاء تشير إلى إشارتين نسخة واحدة من الجزء translocated من كروموسوم 5 ، وثلاث نسخ من الجزء translocated من كروموسوم (9) ونسختين من الجزء مركزية من الكروموسوم 9 ، وهو ما يتسق مع المجاورة -1 الفصل بين إزفاء مما أسفر عن المنتجات غير متوازن مع أحاد الصبغي ل5pter → 5p14.3 وتثلث الصبغي ل9pter → 9p24.1.

<ol><li>Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+translocations%3A+segregation+modes+and+strategies+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis.</a> Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for chromosome rearrangements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 194-201 (2009).</li>
<li>Harper, J. C., Coonen, E., Ramaekers, F. C. S., Delhanty, J. D. A., Handyside, A. H., Winston, R. M. L., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sex+of+human+preimplantation+embryos+in+two+hours+using+an+improved+spreading+method+and+fluorescent+in+situ+hybridisation+using+directly+labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in situ hybridisation using directly labelled probes.</a> Hum. Reprod. 9, 721-724 (1994).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for sex-linked diseases and sex-selection for non-medical reasons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 230-235 (2009).</li>
<li>Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+major+chromosome+aneuploidies+in+human+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.</a> Hum. Reprod. 8, 2185-2192 (1993).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for infertility (preimplantation genetic screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 203-229 (2009).</li>
<li>Scriven, P. N., Bossuyt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy%3A+theoretical+models+for+preimplantation+genetic+testing+of+a+single+nucleus+using+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.+Hum+Reprod%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy: theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique. Hum Reprod.</a> Cytogenetics. 5, 394-400 (2010).</li>
<li>Coonen, E., Dumoulin, J. C., Ramaekers, F. C., Hopman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+preparation+of+preimplantation+embryo+interphase+nuclei+for+analysis+by+fluorescence+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 9, 533-537 (1994).</li>
<li>Dozortsev, D. I., McGinnis, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fixation+technique+for+fluorescence+in+situ+hybridization+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">An improved fixation technique for fluorescence in situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis.</a> Fertil. Steril. 76, 186-188 (2001).</li>
<li>Hsu, L. Y., Benn, P. A., Tannenbaum, H. L., Perlis, T., Carlson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+polymorphisms+of+1%2C+9%2C+16%2C+and+Y+in+4+major+ethnic+groups%3A+a+large+prenatal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal polymorphisms of 1, 9, 16, and Y in 4 major ethnic groups: a large prenatal study.</a> Am. J. Med. Genet. 26, 95-101 (1987).</li>
<li>Shim, S. H., Pan, A., Huang, X. L., Tonk, V. S., Varma, S. K., Milunsky, J. M., Wyandt, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+variants+with+D15Z1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Genet.+Technol%22%5BJournal%5D)">FISH variants with D15Z1.</a> J. Assoc. Genet. Technol. 29, 146-151 (2003).</li>
<li>Knight, S. J., Flint, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+endings%3A+a+review+of+subtelomeric+probes+and+their+use+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis.</a> J. Med. Genet. 37, 401-409 (2000).</li>
<li>Thornhill, A. R., de Die-Smulders, C. E., Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Sermon, K. D., Wilton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium+%28PGS%29+ESHRE+PGD+Consortium+%27Best+practice+guidelines+for+clinical+preimplantation+genetic+diagnosis+%28PGD%29+and+preimplantation+genetic+screening+%28PGS%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium (PGS) ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'.</a> Hum. Reprod. 20, 35-48 (2005).</li>
<li>Munné, S., Wells, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+requirements+for+preimplantation+genetic+diagnosis+to+improve+assisted+reproduction+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes.</a> Fertil. Steril. 94, 408-430 (2010).</li>
<li>Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D., Voullaire, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+after+preimplantation+confirmation+of+euploidy+by+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization.</a> N. Engl. J. Med. 345, 1537-1541 (2001).</li>
<li>Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+comprehensive+chromosomal+screening+for+embryo+assessment%3A+microarrays+and+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).</li>
<li>Handyside, A. H., Harton, G. L., Mariani, B., Thornhill, A. R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyomapping%2C+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تطبيق مضان التهجين في الموضع (FISH) لخلية جنين واحد (قسيم أرومي) تحديات خاصة على حد سواء في الجوانب العملية وتفسير نمط الإشارة. الخلية الخزعة تحتاج إلى أن تنتشر داخل منطقة محددة مسبقا على الشريحة من أجل تسهيل السمكية في توطين التالية ؛ العناية القصوى يجب أن يؤخذ في ضمان lysed الخلية ، التي تم تفريق السيتوبلازم والنواة التي مرئيا وسليمة ، ولأن التشخيص يعتمد على النتائج من هذه الخلية واحدة ، وسجل الصارمة وتفسيرها وينبغي تطبيق المبادئ التوجيهية. ومع ذلك ، في أيدي ذوي الخبرة ، والسمك هي تقنية قوية لمرحلة ما قبل انغراس التشخيص الوراثي (PGD) في الممارسة السريرية. مبدأ PGD بواسطة FISH هي التي يمكن استخدامها تحقيقات هدف محدد الحمض النووي المسمى مع fluorochromes haptens مختلفة أو للكشف عن عدد النسخ من مواضع محددة ، وبالتالي للكشف عن الخلل الصبغي المرتبطة العزل الانتصافي لإعادة ترتيب الكروموسومات (1) ، بما في ذلك روبرتسوني translocations ، translocations المتبادل ، ظاهرة الانقلاب ، وإعادة ترتيب معقدة (2). ويمكن أيضا أن تستخدم السمكية لتحديد الأجنة الإناث في الأسر التي لديها العاشر مرتبطة المرض ، والتي لا يوجد اختبار طفرة معينة (3 ، 4). الأكثر إثارة للجدل ، كما تم السمكية المستخدمة للكشف عن عدم توازن الصبغيات في الكروموسوم متفرقة من أجل محاولة تحسين كفاءة المساعدة على الإنجاب (5 ، 6) ، إلا أن القيمة التنبؤية لهذا الاختبار باستخدام FSIH ومن المرجح أن تكون منخفضة بشكل غير مقبول في معظم الناس لا ينصح اليدين وذلك للاستعمال السريري الروتيني (7). هذا المقال يركز على الجوانب التقنية والقيود المطبقة على الأسماك وحيدة الخلية التشخيص السريري. طرق انتشاره وتحديد blastomeres واحدة تشمل الميثانول / حامض الخليك (5 ، 8) ، توين / حمض الهيدروكلوريك (9) ، ومزيج من توين / حمض الهيدروكلوريك والميثانول / حامض الخليك (10). تشمل معالجة الاختلافات ناقص التوتر من الخلايا قبل نشر و / أو البيبسين والعلاج بارافورمالدهيد بعد التثبيت. وينبغي التحقق من صحة الأسلوب المناسب للمختبر (14). يوصف أسلوب توين / حمض الهيدروكلوريك بالتفصيل في هذه المقالة. أسلوب توين / حمض الهيدروكلوريك هو بسيط للغاية من الناحية الفنية واستنساخه في المختبرات المختلفة. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لإعداد نواة واحدة لتشخيص السمكية من تحديد الجنس وإعادة ترتيب الكروموسومات مع دقة التشخيص مقبول (7). يمكن أن يمزج الجمع بين التحقيق مباشرة والمسمى المسمى غير مباشرة التحقيقات ، والتحقيقات من مختلف الصانعين. وينبغي تجنب تحقيقات للتعرف مناطق متعددة الأشكال الصبغي (11 ، 12) ، أو تلك المعروفة العابرة للهجن بشكل كبير مع غيرها من الصبغيات (13) ، رغم أنه يمكن استخدامها إذا ثبت أن تكون محددة ومناسبة لPGD عن طريق اختبار قبل الشركاء على حد سواء الإنجابية . fluorochromes متاح / haptens واستراتيجيات تميز تحقيقات تشمل ما يلي : تكساس الأحمر (TR) ، فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) ، SpectrumGreen (Vysis) ، SpectrumOrange (Vysis) ، SpectrumAqua ، مع الكشف عن التحقيقات biotinylated TR - أفيدين ، FITC أفيدين ، أو CY - 5 streptavidin (تصور استخدام عامل تصفية FarRed) ، وهو مزيج من مجسات أحمر وأخضر لإنتاج إشارة الصفراء ، وهي الجولة الثانية من التهجين وخلق لون ثالث من خلال التقاط متتابع للSpectrumOrange باستخدام TexasRed وتصفية SpectrumGold). وأوصت مجموعة المسبار يحتوي على ثلاثة تحقيقات ومحددة للمناطق السنترومير من كروموزومات X و Y واحد صبغي جسدي ، لتحديد نوع الجنس (14) ، ويستخدم المجس راثي لوضع الصيغة الصبغية وبالتالي التفريق بين تثلث الصبغي X (2N ، 47 ، XXX) ، وتثلث الصيغة الصبغية (3N ، 69 ، XXX) ، وبين رباع الصبغي X (48 ، XXXX) ورباع الصيغة الصبغية (4N ، 92 ، XXXX). تشكيل لتحقيق النموذجية المطبقة في هذا الإعداد هو مزيج يحتوي على AneuVysion ابوت ألفا الساتلية X ، Y ، و 18 ، وقد تم التحقيق أثبتت هذه المجموعة لديها نسبة التعدد قليلة جدا ، وبالتالي ما قبل المعالجة متابعة العمل من الشركاء الإنجابية ليس مطلوبا (14). وينبغي تحقيق هذا المزيج عن أي إعادة ترتيب معين : تحتوي على الأقل من الناحية المثالية تحقيقات كافية لكشف كل المنتجات المتوقعة لإعادة ترتيب مع الخلل الصبغي. إذا لم يكن هذا ممكنا ، يمزج التحقيق حيث تم تقييم المنتجات التي لم يتم كشفها غير متوازن لتكون غير قابلة للاستمرار في حمل معترف بها ويحتمل أن يكون الانتشار المنخفض جدا قد يكون مقبولا (14). يمكن اختباره على metaphases اللمفاويات مثقف من كل من الشركاء الإنجابية. ينبغي النظر لا يقل عن عشرة ينتشر الطورية لخصوصية التحقيق ، وعبر أشكال متعددة من التهجين ، وحاملة لكروموسوم إعادة ترتيب ، لضمان أن التحقيقات هجن كما هو متوقع لقطاعات مختلفة من إعادة ترتيب. بالإضافة ، يجب أن لا يقل عن 100 سجل نواة الطور البيني من هذه الاستعدادات لتقييم نوعية الإشارة ، والسطوع ، والتحوط (14). Commeو rcial مجموعات التحقيق PGS المتاحة (مثل ابوت MultiVysion PB أو PGT) ، التي تستهدف في معظم الأحيان الكروموسومات جدت لتكون في المنتجات مختل الصيغة الصبغية من الحمل ، وتضم التحقيق كروموسوم واحد لكل المستهدفة. عادة ما قد يكون نواة التهجين الثاني مع تحقيقات إضافية للصبغيات توفير مقايسة للصبغيات 13 ، 15 ، 16 ، 18 ، 21 ، 22 ، وXY (14). القيمة التنبؤية لهذا الاختبار باستخدام تقنية FISH نشر وصفها هنا من المحتمل أن تكون منخفضة بشكل غير مقبول في أيدي معظم الناس وليس من المستحسن للاستخدام السريري الروتيني (7 ، 15). تقنيات مثل التهجين الجينومي المقارن (CGH) المطبقة على الخلايا وحيدة قادرة على اختبار لنسخة من كل عدد الكروموسومات (ويلتون وآخرون 2001) ، واستخدام أشكال متعددة من تركيبة واحدة (SNP) صفائف والتحليل الكمي (ويلز وآخرون . 2008) أو &quot;karyomapping&quot; التنميط الجيني (Handyside وآخرون 2009) واعدة تقنيات بديلة للكشف عن عدم توازن الصبغيات في الكروموسوم. ومع ذلك ، فإن قرار الحد من اختلال التوازن والدقة لشريحة لا تزال غير مؤكدة ، ومن المحتمل أن الأسماك سيستمر هذا الأسلوب المفضل لإعادة ترتيب الكروموسومات التي تنطوي على قطاعات صغيرة.

<table><tbody><tr><td>حمض الهيدروكلوريك، 2.5 لتر</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم، 5 كجم</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم، ٢٥٠ جم</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>أورثوفوسفات ثنائي الصوديوم الهيدروجينية اللامائية، 500 جرام</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين، 500 جرام</td><td>VWR international</td><td>10203 4ب</td><td></td></tr><tr><td>حبيبات هيدروكسيد الصوديوم، 500 جم</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20، 500 مل</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>إيثانول، 2.5 لتر</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>الرسوم مدفوعة</td></tr><tr><td>سترات ثلاثي الصوديوم، 5 كجم</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>صمغ البقر، 250 مل</td><td>شركة Cow Proofings المحدودة</td><td>لم يعد متاحاً</td><td>لا تزال المخزونات القديمة متوفرة في محلات بيع الأدوات الفنية</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES، 0.125&amp;mu;جم/مل، 500 ميكرولتر</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;قنينة تجميع العينات&amp;rsquo;الموردة مع كل مسبار Cytocell TEL</td></tr><tr><td>طلاء أظافر، 12 مل</td><td>أحذية واقية</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>شرائح مغلفة بالأمين، 25</td><td>جينيتيكس</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI، 0.1 مل</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield، ١٠ مللتر</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>تكساس-ريد-أفيدين، 0.001 مل</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>أفيدين مُترافق بـ FITC، 0.001 مل</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>ستربتافيدين Cy-5، 0.001 مل</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب طرد مركزي دقيقة، 1.75 مل، علبة تحتوي على 500 أنبوب</td><td>ثيسل ساينتيفيك (Thistle Scientific)</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب طرد مركزي دقيقة، 0.6 مل، علبة من 1000 أنبوب</td><td>ثيسل ساينتيفيك (Thistle Scientific)</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>حاويات عامة سعة 30 مل، عبوة من 400 قطعة</td><td>ستيريلين (Sterilin)</td><td>128B</td><td>متوفر من NHS Supply Chain، رقم الكتالوج KCP053</td></tr><tr><td>كتلة تسخين</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>موقد كحولي، مقبس موقد كحولي، فتيل موقد كحولي</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>المصّاصات الزجاجية المسدودة</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>مجهر التشريح</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مناديل ورقية، ١٠٠ علبة</td><td>سلسلة توريد هيئة الخدمات الصحية الوطنية (NHS)</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>صواني الاستنبات المعدنية</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>صوانٍ بلاستيكية من الميلامين</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>فرن</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>فوهة الماصة الفموية</td><td>شركة المستلزمات المختبرية العلمية المحدودة</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>الأنابيب</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مرشح حقنة، 0.2&amp;mu;حجم المسام م، بقطر 25 مم</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>قلم الماس</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>وحدة تسخين الشرائح (Hot Block)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>غرفة التهجين</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>لفافة نسيجية</td><td>سلسلة توريد هيئة الخدمات الصحية الوطنية (NHS)</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>وعاء شيفيرديكر (Schieferdecker Jar)</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>وعاء كوبلن</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>ملقط دقيق</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>ملقط غير مدبب</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>كأس زجاجي سعة 1000 مللتر</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>مجهر تباين الأطوار</td><td>أجهزة Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>بطاقات لطخة خالية من الألياف، علبة تحتوي على 100 بطاقة</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>شرائح مجهرية ذات طرف متجمد أزرق، علبة تحتوي على 100 شريحة</td><td>شركة التوريدات المختبرية العلمية المحدودة</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>أغطية شرائح، 18×18 مم، رقم 1، علبة تحتوي على 200 قطعة</td><td>شركة التوريدات المختبرية العلمية المحدودة</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> أغطية شرائح، 22×22 مم، رقم 0، علبة تحتوي على 200 قطعة</td><td>شركة المستلزمات المختبرية العلمية المحدودة</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>غطاءات شرائح، 22×50 مم، رقم 0، علبة تحتوي على 100 قطعة</td><td>شركة المستلزمات المختبرية العلمية المحدودة</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>محقنة سعة 1 مل، علبة تحتوي على 100 قطعة</td><td>سلسلة توريد هيئة الخدمات الصحية الوطنية (NHS Supply Chain)</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>رأس ماصة سعة 1 مل، 10 رفوف تحتوي كل منها على 1000 رأس</td><td>ثيستل ساينتيفيك (Thistle Scientific)</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>حضّانة</td><td>خلايا بطانة الأوعية الدموية المبطنة للرئة (LEEC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حمام مائي</td><td>معدات المنحة</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>ميزان حرارة كحولي</td><td></td><td></td><td>تتوفر مصادر متنوعة</td></tr><tr><td>مقياس الرقم الهيدروجيني (pH Meter)</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>قطب قياس الأس الهيدروجيني (pH)</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>قابس BNC مناسب لمقياس pH من نوع Jenway 3305</td></tr><tr><td>مقلب حراري</td><td>بيبي</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>ماصات باستور سعة 1 مل، علبة تحتوي على 500 قطعة</td><td>شركة التجهيزات المختبرية العلمية المحدودة</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>بارافيلم، 50 مم × 75 م</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

fish ما قبل انغراس التشخيص الوراثي

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

قبل انغراس التشخيص الوراثي (PGD) هو البديل الذي أنشئ لتشخيص ما قبل الولادة ، وينطوي على اختيار ما قبل زرع الأجنة من الأتراب التي تم إنشاؤها بواسطة تكنولوجيا المساعدة على الإنجاب (ART). قد تكون هناك حاجة لأن هذا الاختيار أحادي الجين العائلي للمرض (التليف الكيسي على سبيل المثال) ، أو لشريك واحد يحمل كروموسوم إعادة ترتيب (على سبيل المثال إزفاء متبادلة في الاتجاهين). PGD ​​متاحة للأزواج الذين لديهم أطفال المتأثرين السابقة ، و / أو في حالة إعادة ترتيب الكروموسومات والاجهاض المتكرر ، أو العقم. البويضات الملقحة ويستنشق التالية تحفيز المبيض من خلال الانغماس في المختبر في السائل المنوي (IVF) أو عن طريق حقن الحيوان المنوي داخل الهيولى من الفردية (ICSI). وتحتاج فحص ما قبل الزرع في مرحلة الانقسام الأجنة ، وعادة عن طريق إزالة من خلية واحدة في اليوم 3 بعد الإخصاب ، ويتم اختبار الخلايا تحتاج فحص لتحديد الوضع الجيني للجنين. مضان التهجين في الموضع (FISH) على نواة ثابتة من الخلايا تحتاج فحص مع هدف محدد تحقيقات الحمض النووي هو الأسلوب المفضل للكشف عن الخلل الصبغي المرتبطة إعادة ترتيب الكروموسومات ، واختيار الأجنة الإناث في الأسر التي لديها العاشر مرتبطة المرض الذي لا يوجد أي طفرة معينة الاختبار. كما تم FISH تستخدم لفحص الاجنة لعدم توازن الصبغيات في الكروموسوم عفوية (المعروف أيضا باسم أو PGS AS - PGD) من أجل محاولة تحسين كفاءة المساعدة على الإنجاب ، إلا أن القيمة التنبؤية لهذا الاختبار باستخدام تقنية FISH نشر وصفها هنا ومن المرجح أن تكون منخفضة بشكل غير مقبول في أيدي معظم الناس وليس من المستحسن للاستخدام السريري الروتيني. وصفنا اختيار تحقيقات مناسبة للأسماك وحيدة الخلية ، وتقنيات لنشر قسيم أرومي النوى ، والتهجين في الموقع وسجل إشارة ، تطبق على PGD في عملية إعداد سريرية.

توضح هذه المقالة اختيار تحقيقات مناسبة للأسماك وحيدة الخلية ، وتقنيات لنشر قسيم أرومي النوى ، والتهجين في الموقع وسجل إشارة ، تطبق على التشخيص الجيني قبل الزرع (PGD) في عملية إعداد سريرية.

FISH ما قبل انغراس التشخيص الوراثي

يعد التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) بديلاً راسخاً للتشخيص قبل الولادة، ويتضمن اختيار أجنة ما قبل الزرع من...

الهدف من هذا الإجراء هو استخدام تقنية التهجين الموضعي المتألق الثنائي لتحديد حالة الكروموسومات الجنسية أو الانتقالات الكروموسومية في الأجنة البشرية المستزرعة مختبرياً والمعرضة لخطر حدوث خلل جيني. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحلل خلية واحدة تم أخذ خزعة منها من جنين في اليوم الثالث على شريحة زجاجية وتجفيف النواة بالهواء. وتتمثل الخطوة الثانية في تغيير طبيعة الحمض النووي للنواة المستهدفة وتهجينه باستخدام مسابير حمض نووي مmarked بفلوروكرومات ذات ألوان مختلفة.بعد ذلك، يتم إزالة المسبار الزائد باستخدام غسيل صارم، وتُصبغ النواة بصبغة فلورية متخصصة للحمض النووي DNA. تتمثل الخطوة النهائية في فحص النواة باستخدام مجهر فلوري والتقاط صور رقمية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح عدد نسخ مناطق الكروموسومات المستهدفة من خلال المجهر الفلوري.بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه التقنية صعوبة لأنها تمثل الحد الأقصى لإمكانيات تقنية التهجين الموضعي المتألق (fluorescence in situ hybridization). قبل 24 ساعة، قم بتحضير منظم تحلل الخلايا (cell lysis buffer) لنشر الخلايا. قم بترشيح المحلول وتوزيع كميات قدرها 1 mL في 10 إلى 15 أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.7 mL، ثم أغلق الأنابيب وضع عليها الملصقات التعريفية قبل تجميدها عند -20 °C مباشرة قبل إجراء الخزعة.أذب محلول التحلل (lysis buffer) في درجة حرارة الغرفة. ارسم دائرة صغيرة يبلغ قطرها خمسة مليمترات تقريباً على الجانب السفلي لشريحة مطلية بالأمين باستخدام قلم ماسي، ثم قم بترميز الشريحة بـ BLO باستخدام قلم رصاص صلب من نوع 4H مع ارتداء قفاز لاتكس. لإزالة أي غبار من الجرافيت، استخدم شريحة منفصلة لكل مرآة من مرايا جهاز القذف (blaster mirror) وفقاً للترتيب الرقمي.ضع الآن حجماً صغيراً من محلول التحلل (lysis buffer) داخل الدائرة. انقل أداة تفتيت الخزعة (biopsy blaster) إلى محلول التحلل. أضف محلول التحلل حسب الضرورة لتحليل الخلية.راقب النواة للتأكد من بقائها داخل الدائرة وعدم فقدانها. إذا كانت الخلية لا تحتوي على نواة أو تحتوي على نوى متعددة، فقم بأخذ خزعة من خلية أخرى. اترك الشريحة لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.أولاً، يتم الغسل المسبق للعينات في أوعية كوبلان باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تُشطف العينات مرتين بالماء المقطر المعقم، ثم تُجفف باستخدام سلسلة من الإيثانول لمدة دقيقتين لكل تركيز في درجة حرارة الغرفة، ثم تُترك لتجف في الهواء. تأكد من غمر الشرائح بالكامل، وفي حال طفو أي غبار من الجرافيت على السطح، يتم امتصاصه باستخدام منديل نظيف.سجل موضع النواة داخل الدائرة عن طريق التصوير باستخدام مجهر تباين الطور. ثم قم بإزالة الماء من العينات باستخدام 100% ethanol لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة واتركها لتجف في الهواء. الآن ضع 2 µL من خليط المسبار وغطِّها بشريحة غطاء مقاس 9×9 mm.قم بإغلاق حواف غطاء الشريحة باستخدام المطاط السائل. قم بإجراء عملية المسعنة (denaturing) المرمزة. ضعها على كتلة تسخين عند 75 درجة Celsius لمدة خمس دقائق، ثم قم بإجراء التهجين طوال الليل في غرفة رطبة عند 37 درجة Celsius لكل وعاء اقتران.قم بموازنة 50 milliliters من محلول الغسيل الصارم SSC بتركيز 0.4 في حمام مائي عند درجة حرارة 71 degree Celsius. ضع زجاجة الغسيل الصارم وجرة الربط الفارغة في الحمام المائي في درجة حرارة الغرفة ثم سخنهما حتى 71 degrees Celsius، وقم بضبط pH محلول الغسيل الصارم ثم اسكبه في جرات كوشين. انتقل بعد ذلك إلى إزالة الأسمنت المطاطي بعناية من كل شريحة، واشطف غطاء الشريحة باستخدام 4 times SSC و0.05%tween 20 بـ pH سبعة في درجة حرارة الغرفة.اغسل العينات باستخدام غسول SSC الصارم بتركيز 0.4 مرة عند درجة حرارة 71 °C لمدة خمس دقائق، يليه غسول SSC بتركيز 4 مرات مع 0.05% Tween 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بالنسبة للمجسات الموصومة بشكل غير مباشر، قم بتصريف السائل الزائد من الشرائح وضع 20 µL من الأجسام المضادة الموصومة فلورياً تحت مربع بارافورم مقاس 20 by 20 mm. قم بالتحضين في غرفة رطبة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة.قم بإزالة غشاء البارافيلم وأجرِ عمليات الغسيل التالية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين: مرة واحدة في محلول SSC بتركيز 4× مع 0.05% tween 20، ومرتين لمدة دقيقتين في محلول PBS. بعد تصريف السوائل من الشرائح، ضع 6 µL من وسط التثبيت vector shield الذي يحتوي على DPI على شريحة غطاء مقاس 22 في 22 مليمتر.استخدم شريحة غطاء رقم صفر واقلب الشريحة فوق الغطاء. جفف الزوائد وقم بختم حواف شريحة الغطاء بورنيش أظافر شفاف. وأخيراً، قم بتحليل العينات باستخدام المجهر الفلوري.يتم تقييم كل نواة من قبل محللين مستقلين. كما يُستخدم برنامج تصوير لالتقاط صورة للنواة لتأكيد التشخيص البصري ولأرشفة الصور كجزء من ضمان الجودة في المختبر. يشير هنا انتشار طور استوائي ونواة في طور بيني تم تحضيرهما من ليمفاويات الدم المحيطية إلى حامل لانتقال متبادل بين الأذرع القصيرة للكروموسومين 5 و 9 مع نقاط كسر عند 5 P 14.3 و 9 P 24.1.توضح مجسات FISH كلاً من القطع المنتقلة والقطعة المركزية لإشارات الكروموسوم 9. وفيما يتعلق بنوى الأرومات الغاذية في المرحلة البينية من أجنة اليوم الثالث، يمكن التقاط الصور ثم دمجها لتكوين صورة مركبة. ويشير وجود إشارتين لكل مجس إلى وجود نسختين من كل موقع، وهو ما يتوافق مع تكامل طبيعي أو متوازن.بالنسبة للكروموسومات المنقولة، تشير الإشارات الملونة إلى وجود نسخة واحدة من القطعة المنقولة من الكروموسوم 5، وثلاث نسخ من القطعة المنقولة من الكروموسوم 9، ونسختين من القطعة المركزية من الكروموسوم 9. تتوافق هذه البيانات مع ناتج غير متوازن من التثليث الجزئي (monosomy) للمنطقة 5p14.3 إلى 5pt، والتثليث الصبغي (trisomy) للمنطقة 9p24.1 إلى 9pt. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل خلية واحدة تم أخذ خزعة منها من جنين بشري، وكيفية تحضير نواة واحدة باستخدام تقنية التهجين الموضعي المتألق (fluorescence in situ hybridization).يعد هذا الأمر مهماً لتحقيق نتائج اختبار مثالية وقابلة للتكرار لتحديد تكملة الكروموسومات الجنسية، أو حالة الانتقال الصبغي للجنين.

fish-for-pre-implantation-genetic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

ويمكن أن تحجب وظيفة الجين في خسارة وظيفة من التجارب اذا كان هناك تعويض آخر الجينات. نموذج الزرد يوفر نسبيا عالية الإنتاجية وسائل للكشف عن التكرار وظيفية من هذا القبيل في الأجنة الحية.

نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

يصف هذا البروتوكول طريقة فخ الجين إقحامي الطفرات باستخدام GAL4-VP16 كما مراسل الابتدائية وGFP / RFP كما صحفيين الثانوية في الزرد. حوالي واحد من كل عشرة عالية، معربا عن F0 محصول الأسماك الجين فخ ذرية المشترك، معربا عن GFP وطلب تقديم العروض. إجراءات الفحص يمكن زيادتها بسهولة للتكيف مع حجم المختبر أداء الشاشة الطفرات إقحامي.

الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد

يعتبر سمك الزرد نظاما نموذجيا قويا لعلم الأحياء التنموي وأبحاث الأمراض البشرية نظرا لتشابهها الجيني مع الفقاريات الأعلى. يصف هذا البروتوكول منهجية لإنشاء أجنة أحادية الصيغة الصبغية يمكن استخدامها لاستراتيجيات الفحص الأمامي لتحديد الطفرات المتنحية في الجينات الضرورية للتطور الجنيني المبكر.

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

التلاعب المعدلة وراثيا وتحرير الجينوم حاسمة لاختبار وظيفيا دور الجينات وعناصر -regulatory رابطة الدول المستقلة. هنا يرد بروتوكول حقن مكروي مفصل لتوليد التعديلات الجينوم (بما في ذلك بوساطة Tol2-بنيات فلوري مراسل التحوير، TALENs، وCRISPRs) للأسماك نموذج الناشئة، وأبو شوكة سمك شائك threespine.

Microinjection لTransgenesis والجينوم التحرير في Threespine أبو شوكة

ويقدم بروتوكول microinjection بسيطة وفعالة لتحرير الجينات في أجنة سمك السلور قناة باستخدام نظام كريسبر/Cas9. في هذا البروتوكول، دليل الكشف وكانت ميكروينجيكتيد Cas9 البروتين في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول بانقطاع قناة سمك السلور اثنين من الجينات المتصلة بجهاز المناعة.

Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

تحرير الجينوم المستهدفة في النظام النموذجي دانيو rerio (الزرد) إلى حد كبير مما يسر بظهور النهج المستندة إلى كريسبر. هنا، نحن وصف بروتوكول مبسطة وقوية لتوليد وتحديد الآليلات هراء المستمدة من كريسبر يتضمن المقايسة التنقل هيتيرودوبليكس وتحديد الطفرات باستخدام تسلسل الجيل القادم.

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

وقد استخدمت الزرد كالكائنات نموذج الوراثية الموثوقة في البحوث الطبية الحيوية، لا سيما مع ظهور تكنولوجيات تحرير الجينات. عندما تعمل اليرقات المتوقع، تحديد النمط الوراثي واستخراج الحمض النووي يمكن أن يكون تحديا. هنا، نحن تصف إجراء التنميط تتسم بكفاءة لليرقات الزرد، بقطع الذيل، أقرب وقت الإخصاب بعد 72-ح.

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

هنا، نقدم طريقة تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع لaneuploidy (PGT-A) مع مزايا وقت التحول القصير، وانخفاض التكلفة، والإنتاجية العالية.

تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع للأنوبلويدي

يعتمد التطور المبكر على المنتجات الموروثة من الأم ، ودور العديد من هذه المنتجات غير معروف حاليا. في هذا الصدد، وصفنا بروتوكولا يستخدم تقنية كريسبر-كاس9 لتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي في جيل واحد.

تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية

يعرض البروتوكول الإجراءات الشاملة داخل المختبر المطلوبة في الاختبارات الجينية قبل الزرع لاختلال الصيغة الصبغية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات. نقدم هنا الخطوات التفصيلية لتضخيم الجينوم الكامل ، واختيار جزء الحمض النووي ، وبناء المكتبة ، وإعداد القالب ، وتسلسل تدفق العمل مع نتائج تمثيلية.

الاختبار الجيني قبل الزرع لمرض الصبغيات العدلية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات

أحدثت تقنيات كريسبر-كاس ثورة في مجال تحرير الجينوم. ومع ذلك ، فإن العثور على تعديل الخط الجرثومي المطلوب وعزله لا يزال يمثل عنق الزجاجة الرئيسي. لذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لفحص الحيوانات المنوية لأسماك الزرد المحقونة ب F0 CRISPR بسرعة لإجراء تعديلات على الخط الجرثومي باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية وهضم التقييد والرحلان الكهربائي الهلامي.

فحص الحيوانات المنوية للعزل السريع لتعديلات الخط الجرثومي في الزرد

تعلم تقنية FISH للتشخيص الوراثي قبل الانغراس في الأجنة البشرية. يوضح هذا البروتوكول تحليل الخلايا المنفردة لتحديد التحويلات الكروموسومية والحالات الوراثية غير الطبيعية بدقة عالية.

FISH ما قبل انغراس التشخيص الوراثي

استكشف المزيد من الفيديوهات