مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

مرحبا ، اسمي لوم وأنا حاليا أحصل على درجة الدكتوراه في معهد BE IDI للقلب والسكري تحت إشراف الدكتور توم كاريان ، رئيس مختبر الطب الجيني. في هذا الفيديو ، سأعرض الإجراء المعروف باسم Clon Genic Survival Assay. هذه تقنية عمرها 50 عاما ، والتي تمكن من تقييم تأثير العلاجات المختلفة مثل التعرض للإشعاع أو العوامل الكيميائية على صلاحية التكاثر الخلوي.

مقايسة البقاء على قيد الحياة هي تقنية مركزية في بيولوجيا الإشعاع لتقييم حساسية الإشعاع لخطوط الخلايا المختلفة واختبار فعالية مركبات الحماية الإشعاعية أو الحساسة للإشعاع المختلفة. عند استخدام خط الخلية الملتصقة A ، يتكون اختبار البقاء المبرد من ثلاث مراحل. أولا ، علاج طبقة أحادية من الخلايا الملتصقة.

ثانيا ، تحضير تعليق خلية واحدة وطلاء عدد معروف من الخلايا والأطباق المطلية ، وثالثا ، التلوين ، والعد ، والمستعمرات التي تشكلت بعد فترة من الحضانة. في هذا الفيديو ، سأستخدم خلايا موقع cino البشرية الخالدة لتوضيح كيف يمكن استخدام مقايسة الكتاب المقدس متعددة الجينات لتحديد خصائص الحماية الراديوية لمضادات الأكسدة الطبيعية. يتم زرع 1225 M flas من الخلايا في خمسة ميل من الوسائط مسبقا ، بحيث يوجد في يوم التجربة 1 مليون خلية لكل قارورة.

يضاف 50 ميكرولتر من الدواء بتركيزات مختلفة إلى خمسة ميلل من الوسائط في كل قارورة مصنفة بشكل مناسب لتحقيق التركيز المطلوب ، ويتم استخدام خمسة تركيزات بالإضافة إلى تحكم واحد في السيارة في هذه الحالة ، PBS. بعد إضافة الدواء ، يتم تحضين الخلايا لمدة ساعة في الظروف المناسبة لخط الخلية المستخدم بعد الحضانة. يتم تشعيع التدفق ، باستثناء المجموعة الضابطة ، بالجرعة المختارة ، والتي تكون في هذه الحالة أربعة رمادية تنتجها مصدر السيزيوم الصادر عن أشعة جاما.

بعد التشعيع ، تسكب الوسائط ويتم غسل كل قارورة بملتين من PBS لمدة خمس دقائق. بعد صب PBS ، تتم إضافة ملين من 0.05٪ تريبسين إلى كل قارورة لفصل الخلايا الملتصقة A عن القارورة. ثم يضاف خمسة ملليلتر سفلي من DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني إلى كل قارورة لإلغاء تنشيط التربسين.

ثم يتم نقل المحتويات الكاملة للفاسك إلى أنابيب صقر 10 ملليلتر. بمجرد اكتمالها ، يتم طرد هذه الأنابيب لمدة خمس دقائق ، وبعد ذلك يتم التخلص من المستلق بعناية دون إزعاج الحنك ، ويضاف خمسة ميل من وسائط الكريسي إلى كل أنبوب. يتم حساب تركيز الخلايا لكل عينة ب ENC بالإضافة إلى الحجم المطلوب لكل عينة لتحقيق التركيز النهائي للخلايا المراد طلاؤها في خمسة أطباق بتري لكل عينة مع خمسة ملليلتر من الوسائط لكل عينة.

على سبيل المثال ، بالنسبة للمجموعة الضابطة ، يتم طلاء 100 خلية لكل طبق ، لذلك يتم حساب الحجم المطلوب لتحقيق 500 خلية لكل 25 مل للعينات الأكثر تركيزا ، وإجراء إما تخفيف 10 مرات أو تخفيف تسلسلي 100 مرة لتقليل الخطأ عند استخدام أحجام أقل من 100 ميكرولتر. الآن يتم إعداد الحجم المحسوب مسبقا في أنبوب فالكون يحتوي على 25 مل من الوسائط لكل عينة. يمكن الآن نقل العينات إلى الأطباق المسماة مسبقا ، مع إضافة خمسة ملليلتر إلى كل طبق لتسهيل التعامل معها والنقل.

قم بتخزين الأطباق في وعاء كبير أو معقم أو معقم. ثم توضع الأطباق في حاضنة مرطبة في الظروف المناسبة وتحتضن لمدة ثمانية أيام. في حالة استخدام الخلايا الكيراتينية بعد ثمانية أيام ، قم بإزالة الأطباق بعناية من الحاضنة ووضعها جميعا واحدة تلو الأخرى داخل غطاء الدخان.

احرص على التعامل مع المكان برفق حتى لا يتم إزعاج أي مستعمرات تشكلت. قم بإزالة الأغطية وأضف خمسة مل من محلول ملحي 0.9٪ إلى كل طبق لغسلها. صوب طرف التحضير في زاوية الطبق وتجنب لمس قاع الطبق حتى لا يتم كشط أي مستعمرات عن طريق الخطأ.

بعد خمس دقائق ، استنشق المحلول الملحي بعناية. الآن ، يتم إصلاح المستعمرات بثلاثة ملليلتر من 4٪ صيغة ، ويجب استبدال الخيوط لتجنب التبخر. بعد 15 دقيقة إلى نصف ساعة ، يتم شفط التركيبة والتخلص منها بشكل مناسب.

المستعمرات جاهزة الآن للتلطيخ ب 0.1٪ بنفسجي كريستالي ، ويضاف خمسة ملليلتر إلى كل طبق ويتم استبدال الأغطية بعد نصف ساعة إلى ساعة واحدة. ثم يتم غسل الصبغة بالماء المقطر ويتم قلب الأطباق وتركها تجف طوال الليل. المستعمرات جاهزة الآن للعد.

يمكن عد المستعمرات يدويا باستخدام مجهر تشريح. تعتبر أي مجموعة من الخلايا تحتوي على 50 خلية أو أكثر مستعمرة. وهذا يختتم عرضنا لمقايسة البقاء على قيد الحياة.

الميزة الرئيسية لهذا الاختبار على التقنيات الأخرى هي أنه حساس بشكل لا يصدق ويمكنه اكتشاف البقاء على قيد الحياة على نطاق واسع حتى بعد ستة سجلات لقتل الخلايا. هذا ، يتم تحقيق هذه الحساسية عن طريق طلاء أعداد خلايا أكبر. يمكن استخدام هذا المقال بسهولة لأغراض أخرى ، مثل الاختبار ، مثل اختبار السمية الخلوية.

شكرا للمشاهدة.