واحد المجهر الإلكتروني التعمير الجسيمات مجمع Exosome باستخدام أسلوب عشوائي الخيمة المخروطية

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على البنية ثلاثية الأبعاد لمعقد الإكسوسوم باستخدام طريقة الإمالة المخروطية العشوائية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترسيب طبقة رقيقة من غشاء الكربون على شبكة الكربون المثقبة لتكون الركيزة الداعمة للمعقد البروتيني، وفي خطوة ثانية يتم وضع الصبغة. ثم يتم وضع العينة والصبغة على الشبكة، مما يؤدي إلى غمر العينة في أملاح المعادن الثقيلة.

يتم بعد ذلك إجراء الفحص بالمجهر الإلكتروني للحصول على أزواج مائلة من الصور المجهرية للعينة. وفي النهاية، يتم الحصول على نتائج تظهر البنية ثلاثية الأبعاد لمعقد الإكسوسوم بناءً على تحليل الصور باستخدام طريقة الميل المخروطي العشوائي. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تحضير العينة بشكل جيد لطريقة الميل المخروطي العشوائي يكون صعباً في بعض الأحيان، وكذلكما هو الحال بالنسبة لإجراءات معالجة الصور التي تلي ذلك View.

يعد استعراض هذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات تحديد الدرجة وتحضير العينة يصعب تعلمها دون توضيح لعملية تقييم العينات. يتطلب مبدأ طريقة الإمالة المخروطية العشوائية التقاط زوج من الصور المجهرية لنفس المنطقة من العينة داخل المجهر الإلكتروني. يتم التقاط صورة واحدة للعينة في وضع غير مائل، ويتم التقاط الصورة الأخرى للعينة مائلة بزاوية تتراوح بين 50 و70 درجة. وباستخدام الكمبيوتر، يتم وضع زوج الصور المجهرية المرقمنة جنباً إلى جنب، ويتم اختيار الصور الخاصة بالجسيمات نفسها في هذا التوضيح.

تتميز هذه الصور بعلامات رقمية في إحداثيات ثلاثية الأبعاد. وترتبط صور الجسيمات غير المائلة وشركاؤها المائلون ببعضهم البعض من خلال اتجاه محور الميل وزاوية الميل. إن محاذاة صور الجسيمات غير المائلة تنقل صور الجسيمات المائلة إلى مواقعها المقابلة كـ asMule، وباستخدام صور متعددة للجسيمات المائلة التي تملأ الحيز السمتي، يمكن إعادة بناء البنية ثلاثية الأبعاد للجزيء باستخدام خوارزمية الإسقاط الخلفي. ولتصنيع الشبكات أولاً، قم بتحضير محلول VAR بتركيز 0.5% عن طريق إضافة 0.45 غرام من راتنج بولي فينيل فورمال و 90 ملليلتر من الكلوروفورم إلى دورق زجاجي سعة 100 ملليلتر.

داخل خزانة استخلاص الغازات، غطِّ الكأس بورق ألومنيوم وأذب راتنج form var. وباستخدام قضيب تحريك صغير وجهاز تحريك مغناطيسي، يستغرق الراتنج حوالي 15 دقيقة ليذوب. وفي هذه الأثناء، نظف شرائح المجهر الزجاجية التي سبق تنظيفها باستخدام الميثانول ومناديل Kim wipes.

بعد ذوبان راتنج form var تماماً في الكلوروفورم، أضف 1 mL من الجلسرول بتركيز 50% إلى سطح المحلول. يؤثر ضبط حجم الجلسرول المضاف على كثافة الثقوب في الكربون المثقب.

أدخل رأس جهاز الموجات فوق الصوتية في المحلول. وعند عمق يبلغ حوالي بوصة واحدة، استخدم أقصى قدرة لإجراء عملية الموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة واحدة، مما سيؤدي إلى تكوين مستحلب من قطيرات الجلسرين في شكل المحلول الخاص بنا. ستؤدي زيادة مدة عملية الموجات فوق الصوتية إلى تصغير حجم الثقوب في الكربون المثقوب.

يصبح المحلول حليبياً بعد هذه الخطوة. مباشرة بعد الغمس في جهاز السونيكاتور، تُغمس الشرائح الزجاجية النظيفة رأسياً في المستحلب. لمدة ثانية واحدة، تُخرج الشرائح ويُجفف الجزء السفلي منها باستخدام ورق ترشيح لتكوين غشاء بلاستيكي رقيق فوق سطح الشرائح.

بعد تبخر الكلوروفورم، افحص كثافة وحجم الثقوب في الغشاء تحت المجهر الضوئي. يجب أن تؤدي ظروف التحضير الموصوفة هنا إلى تكوين من 10 إلى 20 ثقباً في كل مربع من شبكة ذات 400 مش، وبأقطار تتراوح بين ثلاثة وأربعة ميكرومترات. وبمجرد جفاف الشرائح الزجاجية، قص حافة الغشاء البلاستيكي الموجود على سطح الشريحة.

اجعل الغشاء يطفو على سطح الماء المقطر عن طريق غمس الشريحة رأسيًا في الماء. يمكن ملاحظة الغشاء الرقيق على سطح الماء عند النظر بزاوية مائلة مقابل انعكاس الضوء. ضع شبكات نحاسية ذات مسامية 400 mesh على الغشاء، واحدة تلو الأخرى، بحيث يكون السطح الأملس للشبكة متجهًا للأسفل.

ارفع الغشاء البلاستيكي الذي يحتوي على الشبكات باستخدام قطعة من الورق. اقلب الورقة واتركها حتى تجف. في طبق بتري، اغمر الورقة في الميثانول لإزالة الجلسرين المتبقي في الثقوب، ثم اترك الورقة لتجف في الهواء.

استخدم مبخر كربون لطلاء الشبكات بطبقة من الكربون بسمك 20 nanometers تقريبًا. استخدم وقت التبخير للتحكم في الوصول إلى السمك المطلوب. يمكن تحديد السمك من خلال اللون الرمادي للكربون بمقارنته باللون الرمادي لطبقة كربون ذات سمك معروف.

انقع الشبكات ذات الطبقات الكربونية في الكلوروفورم داخل طبق بتري زجاجي لمدة نصف ساعة لإزالة مادة الفارميفار (form var)، ثم يؤدي تجفيف الشبكات إلى الحصول على شبكات كربونية مثقبة مُحضرة منزلياً. بعد ذلك، قم بتبخير طبقة رقيقة من الكربون بسماكة تبلغ حوالي 5 nanometer على سطح ميكا حديث الانفصام. ثم ضع الشبكات الكربونية المثقبة بعناية على قطعة من ورق الترشيح تحت ماء مقطر.

في جهاز مُصنع منزلياً، قم بتعويم الكربون الرقيق من سطح الميكا فوق سطح الماء، ثم رسبه ببطء على شبكات الكربون المثقبة. ارفع ورق الترشيح الذي يحتوي على الشبكات واتركه ليجف. وفي خزانة استخلاص الغازات، ابدأ عملية الصبغ السلبي لمعقد الإكسوسومات عن طريق تحضير محلول فورمات اليورانيوم بتركيز 2% حديث التحضير.

كما هو موضح في الإجراء المكتوب، قم بتغطية أنبوب المحلول بقطعة من ورق الألمنيوم. ولمنع التعرض للضوء، يجب استخدام المحلول في نفس اليوم. قم بإجراء تفريغ توهجي لطبقة رقيقة من الكربون فوق شبكة كربونية بالكامل باستخدام جهاز التفريغ التوهجي. بعد ذلك، ضع قطعة من البارافيلم النظيف على المنضدة، وباستخدام الماصة، ضع ثلاث قطرات بحجم 50 µL من محلول صبغة فورمات اليورانيل فوق البارافيلم. خفف معقد الإكسوسوم إلى تركيز يقارب 50 nM باستخدام محلول التخفيف المنظم، ثم استخدم الماصة لوضع 4 µL من البروتين المخفف فوق الشبكة التي خضعت للتفريغ التوهجي.

اترك العينة على الشبكة لمدة دقيقة واحدة، ثم جفف المحلول المتبقي باستخدام قطعة من ورق الترشيح بواسطة الملاقط. اقلب الشبكة فوراً فوق قطرة الصبغة الأولى واغسل الشبكة بتحريكها ذهاباً وإياباً عدة مرات لمدة 10 ثوانٍ تقريباً. كرر هذه العملية لكل قطرة من قطرات الصبغة الثلاث، وبعد الغسلة الأخيرة، اترك الصبغة على الشبكة لمدة دقيقة إضافية واحدة.

بعد ذلك، قم بتجفيف الصبغة باستخدام قطعة من ورق الترشيح. حافظ على وجود طبقة رقيقة من محلول الصبغة على سطح الشبكة واترك الشبكة لتجف داخل خزانة استخلاص الغازات. ضع شبكة العينة في حامل العينات، ثم أدخل الحامل في مجهر إلكتروني من طراز FEI TE nine 12.

افحص شبكة العينة بتكبير منخفض للعثور على المربعات الأفضل صبغاً. يظهر المربع الجيد وكأنه يحتوي على اثني عشر ثقباً بأبعاد تتراوح من 1 إلى 2 µm ومناطق مصبوغة داكنة بداخلها. قم بتفعيل وضع الجرعة المنخفضة (low dose mode) في واجهة مستخدم FEI، ثم قم بمحاذاة بؤرة البحث وموضع التعريض في وضع الجرعة المنخفضة.

اضبط البحث على وضع التجزئة بطول كاميرا 1.5 meter. اضبط التركيز على تكبير 150 K، واضبط التعريض على تكبير 50 K مع زمن تعريض مقاس قدره ثانية واحدة. عادةً، يتم استخدام سمة مميزة على الشبكة في كل من وضعي البحث والتعريض لإجراء المحاذاة.

حدد الثقوب ذات الصبغ الجيد في وضع البحث واحفظ مواقعها. التقط صورة باستخدام CCD للمربع. أمل العينة بزاوية 55 درجة والتقط صورة أخرى.

قارن بين الصورتين وحدد الثقوب المتقابلة في المجهريتين. أعد إمالة المنصة إلى صفر درجة. استخدم مجموعة الجرعة المنخفضة لالتقاط صور لكل ثقب تم تحديده في وضع البحث بتكبير عالٍ ومع إزاحة بؤرية تبلغ حوالي 0.7- micrometers.

بعد التقاط صور لجميع الثقوب، قم بإمالة المنصة بزاوية 55 درجة باستخدام نفس التكبير. التقط صوراً مجهرية للعينة المائلة مع إزاحة بؤرية (defocus) تبلغ حوالي minus 1.2 micrometers. حدد زوج الصور المجهرية المائل المقابل بناءً على الأنماط الموجودة في الصور المجهرية ذات التكبير المنخفض، وذلك باستخدام النمط غير المنتظم لشبكات الكربون المثقبة المصنعة محلياً.

للمساعدة في عملية الارتباط، اختر أزواج إمالة الصور المجهرية التي تتميز بتوزيع منتظم للجزيئات وخالية من الهالات المحيطة بها. يجب استبعاد الصور المجهرية التي تظهر حولها هالات صبغية واضحة عند معالجة البيانات. ابدأ بإعداد البرنامج في الإجراء.

سيتم عرض معالجة الصور باستخدام عملية 2D في حزمة Eman. ولتغيير تنسيق الصورة، استخدم حزمة iMagic five لإجراء المحاذاة ثنائية الأبعاد (2D alignment) وحزمة spider. ولإجراء إعادة البناء ثلاثية الأبعاد (3D reconstruction) والتحسين، قم بتحويل الصورة الرقمية DM three Gatan إلى تنسيق صور spider.

باستخدام الأمر process 2D، قم باختيار أزواج الجسيمات. وباستخدام البرنامج الشبكي الموزع ضمن حزمة برنامج spider، يقوم البرنامج تلقائياً بحفظ إحداثيات الجسيمات واستخراج جميع الجسيمات المختارة باستخدام نص spider البرمجي. يقوم النص البرمجي بحفظ مجموعات الجسيمات المائلة وغير المائلة.

قم بتحويل الجسيمات غير المائلة من تنسيق UN إلى تنسيق IMAG five. باستخدام برنامج EM two EM، قم بتطبيق مرشح تمرير النطاق (band pass filter) وقناع على الجسيمات غير المائلة باستخدام أمر prep InCorp في برنامج IMAG five، ثم قم بتوسيط الجسيمات المقنعة بمرشح تمرير النطاق باستخدام أمر center. في برنامج IMAG five، قم بمحاذاة الجسيمات وتصنيفها بشكل تكراري إلى فئات متجانسة باستخدام نص برمجياً (batch script) يقوم بتنفيذ برامج IMAG five تلقائياً.

بعد ذلك، استخدم الأمر names in class في برنامج IMAG five لإنشاء جدول بحث للفئات الخاصة بالجسيمات، ثم أنشئ ملف رسم بياني لقيم الإزاحة والدوران الخاصة بالمحاذاة لكل جسيم باستخدام الأمر header. في برنامج iMagic five، قم بتحويل الجسيمات المحاذات إلى صيغة spider باستخدام برنامج EM two EM. ثم قم بتحويل جدول بحث الفئات إلى ملفات مستندات spider.

يتم أيضاً تحويل قيم الإزاحة والدوران الخاصة بمحاذاة كل جسيم إلى ملف مستند spider، ثم يتم تطبيق مرشح تمرير نطاقي (band pass filter) وقناع (mask) وتوسيط الجسيمات المائلة تماماً كما هو الحال مع الجسيمات غير المائلة في IMAG five، لإنشاء مجموعة بيانات جديدة للجسيمات المائلة الممركزة. قم بإنشاء ملفات مستندات زاوية من مستندات المحاذاة متعددة المراجع الناتجة عن IMAG five ومن ملفات DCB الناتجة عن البرنامج الويب. استخدم نص برمجية الإسقاط الخلفي (back projection script) في spider للحصول على نموذج أولي واحد لكل متوسط فئة.

أخيرًا، قم بإجراء تحسين للإسقاط (projection refinement) للحجم الأولي باستخدام سكربت spider مقابل جميع الجسيمات غير المائلة للحصول على الحجم النهائي باستخدام RCT. تم الحصول على حوالي 50 إعادة بناء للإكسوسوم. وتنشأ هذه الأحجام من الجسيمات المائلة المقابلة لكل جسيم في الفئات الخمسين للجسيمات غير المائلة.

باستخدام الإسقاط الخلفي المُنفذ في حزمة spider، تم إجراء تحسين مطابقة الإسقاط باستخدام هذه الأحجام كنماذج أولية، وتم إنشاء الحجم ثلاثي الأبعاد المعروض للإكسوسوم بدقة تبلغ حوالي 18 angstrom، ومن ثم يمكننا إدراج النماذج الذرية لأجزاء مختلفة من المعقد في الخريطة ثلاثية الأبعاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام RCT للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد، بدءاً من توليد شبكة نموذجية جيدة للعينة وصولاً إلى المخططات المجهرية، وأخيراً الحصول على إعادة البناء باستخدام تقنيات تحليل الصور. وبالإضافة إلى البروتوكول الذي وصفناه هنا، هناك عدة طرق للحصول على عمليات إعادة البناء النهائية في تحليل الصور.

تتمثل الخطوة الأكثر أهمية للحصول على إعادة بناء صحيحة وموثوقة في العمل باستخدام عينة مُحضرة جيداً.