واحد المجهر الإلكتروني التعمير الجسيمات مجمع Exosome باستخدام أسلوب عشوائي الخيمة المخروطية
March 28th, 2011
توضح هذه المقالة أسلوب قياسي للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء الجزيئات البيولوجية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ السلبية (EM). في هذا البروتوكول ، ونشرح كيفية الحصول على هيكل 3D من exosome السكيراء مجمع البيرة في قرار عشوائي المتوسطة باستخدام أسلوب إعادة الإعمار الميل المخروطية (RCT).
الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على الهيكل ثلاثي الأبعاد لمركب الإكسوسوم باستخدام طريقة الميل المخروطي العشوائي. يتم تحقيق ذلك عن طريق ترسيب طبقة رقيقة من طبقة الكربون أولا على شبكة الكربون المقدسة لعمل الركيزة الداعمة لمركب البروتين والبقعة كخطوة ثانية. يتم تطبيق العينة والبقعة على الشبكة ، والتي تدفن العينة في أملاح المعادن الثقيلة.
ثم يتم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني للحصول على أزواج إمالة من الصور المجهرية للعينة. أخيرا ، يتم الحصول على نتائج توضح التركيب ثلاثي الأبعاد لمركب الإكسوسوم بناء على تحليل الصور باستخدام طريقة الميل المخروطي العشوائي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه في بعض الأحيان يكون الإعداد الجيد للعينة لطريقة الإمالة المخروطية العشوائية أمرا صعبا بالإضافة إلى إجراء معالجة الصور الذي يتبع العرض.
يعدعرض هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات إعداد الدرجة والعينة بدون توضيح لتقييم العينة. يتطلب مبدأ طريقة الميل المخروطي العشوائي أخذ زوج من الصور المجهرية لنفس المنطقة من العينة داخل المجهر الإلكتروني. يتم التقاط صورة واحدة للعينة في وضع غير مائل ، ويتم التقاط الصورة الأخرى للعينة المائلة بزاوية تتراوح بين 50 و 70 درجة باستخدام الكمبيوتر ، يتم وضع زوج الميكروغراف الرقمي جنبا إلى جنب ويتم تحديد الصور من نفس الجسيمات في هذا الرسم التوضيحي.
يتم تمييز هذه الصور بأرقام في إحداثيات ثلاثية الأبعاد. ترتبط صور الجسيمات غير المائلة وشركائها المائل ببعضها البعض من خلال اتجاه محور الميل وزاوية الميل. إن محاذاة صور الجسيمات غير المائلة تجلب صور الجسيمات المائلة إلى ما يقابلها كمواقع بغل باستخدام صور متعددة للجزيئات المائلة التي تملأ مساحة السمت ، ويمكن إعادة بناء الهيكل ثلاثي الأبعاد للجزيء باستخدام خوارزمية الإسقاط الخلفي لتصنيع الشبكات أولا ، وإعداد محلول VAR بنسبة 0.5٪ عن طريق إضافة 0.45 جرام من راتنج بولي فينيل رسمي ، و 90 مل من الكلوروفورم إلى دورق زجاجي سعة 100 مل.
في غطاء الدخان ، قم بتغطية الدورق بورق الألمنيوم وقم بإذابة راتنج var. مع ثمانية من شريط التحريك الصغير والتقليب المغناطيسي ، يستغرق الراتنج حوالي 15 دقيقة ليذوب. وفي الوقت نفسه ، قم بتنظيف شرائح زجاج الفحص المجهري التي تم تنظيفها مسبقا في الميثانول ومناديل كيم.
بعد النموذج فار الراتنج يذوب بالكامل. في الكلوروفورم ، أضف ملليلتر واحد من 50٪ جلسرين إلى سطح المحلول. يؤثر ضبط حجم الجلسرين المضاف على كثافة الثقوب الموجودة في الكربون المقدس.
قم بتمرير طرف الموجات فوق الصوتية في المحلول. على عمق حوالي بوصة واحدة ، استخدم الطاقة القصوى للصوتنة لمدة دقيقة واحدة ، مما سيجعل مستحلب قطرات الجلسرين في شكل حلنا. سيؤدي صوتنة أطول إلى حجم أصغر من الثقوب في الكربون المقدس.
يصبح المحلول حليبي بعد هذه الخطوة. مباشرة بعد تراجع الصوت ، ينزلق الزجاج النظيف عموديا في المستحلب. لمدة ثانية واحدة ، أخرجها وامسح الجزء السفلي من الشرائح باستخدام ورق الترشيح لتشكيل طبقة بلاستيكية رقيقة على سطح الشرائح.
بعد أن يتبخر الكلوروفورم ، تحقق من كثافة وحجم الثقوب الموجودة في الفيلم تحت المجهر الضوئي. يجب أن تنتج حالة التحضير الموضحة هنا من 10 إلى 20 ثقبا في كل مربع من شبكة 400 بأقطار تتراوح بين ثلاثة وأربعة ميكرومترات. بمجرد أن تجف الشرائح الزجاجية ، قم بقص حافة الفيلم البلاستيكي على سطح الشريحة.
قم بتعويم الفيلم على سطح الماء المقطر عن طريق غمس الشريحة عموديا في الماء. يمكن ملاحظة الطبقة الرقيقة الموجودة على سطح الماء بزاوية خاطفة مقابل انعكاس الضوء. ضع 400 شبكة نحاسية شبكية على الفيلم ، واحدة تلو الأخرى بحيث يكون السطح الأملس للشبكة متجها لأسفل.
التقط الفيلم البلاستيكي مع الشبكات عليه باستخدام قطعة من الورق. اقلب الورقة واتركها تجف. في طبق بتري ، انقع الورق في الميثانول لإزالة الجلسرين المتبقي في الثقوب والسماح للورق بالجفاف في الهواء.
استخدم مبخر الكربون لتغطية الشبكات بطبقة من الكربون بسمك 20 نانومتر تقريبا. استخدام وقت التبخر للتحكم في السماكة المطلوبة. يمكن تحديد السماكة من خلال اللون الرمادي للكربون مقارنة باللون الرمادي لطبقة الكربون ذات السماكة المعروفة.
انقع الشبكات ذات طبقات الكربون مع الكلوروفورم في طبق بتري زجاجي لمدة نصف ساعة لإزالة النموذج var form ، متبوعا بتجفيف الشبكات ينتج عنه شبكات كربون مقدسة محلية الصنع. بعد ذلك ، تبخر طبقة رقيقة من الكربون بسماكة حوالي خمسة نانومتر على سطح الميكا المشقوق حديثا. ثم ضع شبكات الكربون المقدسة بعناية على قطعة من ورق الترشيح تحت الماء المقطر.
في جهاز محلي الصنع ، قم بتعويم الكربون الرقيق من سطح الميكا على سطح الماء وقم بإيداعه ببطء على شبكات الكربون المقدسة. التقط ورق الترشيح مع الشبكات واتركه يجف. في غطاء الدخان ، ابدأ في التلوين السلبي لمركب الإكسوسوم عن طريق صنع محلول فورمات مبولة جديد بنسبة 2٪.
كما هو موضح في الإجراء المكتوب ، قم بتغطية أنبوب المحلول بقطعة من رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء ، يجب استخدام المحلول بنفس الطريقة. يقوم توهج النهار بتفريغ كربون رقيق واحد فوق شبكة كربونية بالكامل باستخدام جهاز تفريغ التوهج. بعد ذلك ، ضع قطعة من العطر النظيف على ماصة المقعد ثلاث قطرات سعة 50 ميكرولتر من محلول صبغة فورمات المبولة أعلى البيرفيل ، وقم بتخفيف مركب الإكسوسوم إلى تركيز حوالي 50 نانومولار باستخدام ماصة عازلة مخففة أربعة ميكرولترات من البروتين المخفف حتى يتم تفريغ شبكة التوهج.
اترك العينة على الشبكة لمدة دقيقة واحدة ، ثم امسح المحلول المتبقي بقطعة من ورق الترشيح باستخدام الملقط. اقلب الشبكة على الفور فوق قطرة البقعة الأولى واشطف الشبكة عن طريق تحريكها ذهابا وإيابا عدة مرات لمدة 10 ثوان تقريبا. كرر هذه العملية لكل قطرة من قطرات البقع الثلاثة بعد الشطف الأخير ، اترك البقعة على الشبكة لمدة دقيقة إضافية.
ثم امسح البقعة بقطعة من ورق الترشيح. احتفظ بطبقة رقيقة من محلول البقع على سطح الشبكة واترك الشبكة تجف في غطاء الدخان. ضع شبكة العينة في حامل العينة ثم ضع الحامل في مجهر إلكتروني FEI TE تسعة 12.
تحقق من شبكة العينة بتكبير منخفض للعثور على أفضل المربعات الملونة. يبدو أن المربع الجيد يحتوي على عشرات الثقوب بأبعاد تتراوح من واحد إلى ميكرومتر ومناطق ملطخة داكنة فيها. قم بتشغيل وضع الجرعة المنخفضة لواجهة مستخدم FEI وقم بمحاذاة تركيز البحث وعرض الموضع في وضع الجرعة المنخفضة.
اضبط البحث في وضع الكسر بطول الكاميرا 1.5 متر. اضبط التركيز البؤري على تكبير 150 كلفن واضبط التعريض الضوئي على تكبير 50 كلفن مع قياس وقت التعريض الضوئي لمدة ثانية واحدة. عادة ، يتم استخدام ميزة يمكن التعرف عليها على الشبكة في كل من وضع البحث والتعرض لإجراء المحاذاة.
ابحث عن الثقوب ذات التلطيخ الجيد في وضع البحث واحفظ المواقع. التقط صورة CCD للمربع. قم بإمالة العينة إلى 55 درجة والتقط صورة أخرى.
قارن بين الصورتين وحدد الثقوب المقترنة في الصورين المجهريتين. قم بإمالة المسرح مرة أخرى إلى درجة الصفر. استخدم مجموعة الجرعات المنخفضة لالتقاط صور لكل ثقب تم تحديده في وضع البحث بتكبير عال مع إلغاء التركيز البؤري بحوالي 0.7 ميكرومتر تحت الصفر.
بعد التقاط صور لجميع الثقوب ، قم بإمالة المرحلة إلى 55 درجة باستخدام نفس التكبير. خذ صور مجهرية للعينة المائلة مع إلغاء التركيز البؤري حوالي 1.2 ميكرومتر تحت الصفر. حدد زوج الإمالة المقابل من الصور المجهرية بناء على الأنماط الموجودة في الصور المجهرية ذات التكبير المنخفض باستخدام النمط غير المنتظم لشبكات الكربون المقدسة محلية الصنع.
للمساعدة في الارتباط ، اختر أزواج إمالة المجهر مع جزيئات التوزيع المتساوية وبدون هالات حول الجسيمات. يجب التخلص من تلك الصور المجهرية التي تحتوي على هالات بقع واضحة حولها لمعالجة البيانات. ابدأ بإعداد البرنامج في الإجراء.
سيتم عرض معالجة الصور باستخدام العملية 2D في حزمة Eman. لتغيير تنسيق الصورة ، فإن حزمة iMagic الخمسة للقيام بمحاذاة 2D وحزمة العنكبوت. لإجراء إعادة بناء 3D وتحسينها ، قم بتحويل صورة DM three Gatan الرقمية إلى تنسيق صورة العنكبوت.
باستخدام الأمر process 2D ، اختر أزواج الجسيمات. باستخدام برنامج الويب الموزع في حزمة برنامج العنكبوت ، يقوم البرنامج تلقائيا بحفظ إحداثيات صندوق الجسيمات من جميع الجسيمات المحددة باستخدام البرنامج النصي العنكبوتي. يحفظ البرنامج النصي مكدسات الجسيمات المائلة وغير المائلة.
تحويل الجسيمات المائلة للأمم المتحدة إلى تنسيق IMAG الخمس. باستخدام تمرير نطاق برنامج EM اثنين EM ، قم بتصفية وإخفاء الجسيمات المائلة للأمم المتحدة باستخدام أمر InCorp prep في IMAG five وتوسيط الجسيمات المقنعة التي تمر بها باستخدام الأمر المركزي. في imag five ، قم بمحاذاة الجسيمات وتصنيفها بشكل متكرر إلى فئات متجانسة باستخدام برنامج نصي دفعي يقوم تلقائيا بتنفيذ برامج IMAG الخمسة.
بعد ذلك ، استخدم الأمر MSA names in class في IMAG five لإنشاء جدول بحث الفئة للجسيمات ، وإنشاء ملف مؤامرة لقيم الترجمة والتدوير للمحاذاة لكل جسيم باستخدام أمر الرأس. في iMagic five ، قم بتحويل الجسيمات المحاذاة إلى تنسيق العنكبوت باستخدام برنامج EM two EM. ثم قم بتغيير جدول البحث عن الفئات إلى ملفات مستندات العنكبوت.
يتم أيضا تحويل قيم الترجمة والدوران للمحاذاة لكل جسيم إلى مرشح تمرير نطاق ملف مستند عنكبوتي ، وإخفاء وتوسيط الجسيمات المائلة تماما كما هو الحال بالنسبة للجسيمات غير المائلة في IMAG خمسة ، وإنشاء مجموعة بيانات جديدة للجسيمات المائلة المركزية. قم بإنشاء ملفات مستندات زاوية من مستندات المحاذاة المرجعية المتعددة التي تم إنشاؤها من IMAG five وملفات DCB التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج الويب. استخدم البرنامج النصي للإسقاط الخلفي في العنكبوت للحصول على نموذج أولي واحد لكل متوسط فئة.
أخيرا ، قم بإجراء تحسين الإسقاط للمجلد الأولي باستخدام البرنامج النصي العنكبوتي مقابل جميع الجسيمات غير المائلة للحصول على الحجم النهائي باستخدام RCT. تم الحصول على حوالي 50 عملية إعادة بناء للإكسوسوم. يتم إنشاء الأحجام من الجسيمات المائلة المقابلة لكل جسيم في 50 فئة من الجسيمات غير المائلة.
باستخدام الإسقاط الخلفي الذي تم تنفيذه في حزمة العنكبوت ، تم إجراء صقل مطابقة الإسقاط باستخدام هذه الأحجام كنماذج أولية وتم إنشاء الحجم ثلاثي الأبعاد المعروض للإكسوسوم بدقة إضافية تبلغ حوالي 18 نغ ، يمكننا بعد ذلك التغلب في النماذج الذرية لأجزاء مختلفة من المجمع في الخريطة ثلاثية الأبعاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام RCT للحصول على عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد من إنشاء شبكة سردية جيدة من العينة إلى الصور المجهرية من نظير إلى نظير ، وأخيرا للحصول على إعادة البناء باستخدام تقنيات تحليل الصور. إلى جانب البروتوكول الذي وصفناه هنا ، هناك عدة طرق للحصول على عمليات إعادة البناء النهائية في تحليل الصور.
الخطوةالأكثر أهمية للحصول على إعادة بناء صحيحة موثوقة هي العمل مع عينة معدة جيدا.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة قياسية للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد (3D) للجزيئات الحيوية الكبيرة باستخدام مجهر إلكتروني بصبغة سلبية (EM). يركز على الحصول على البنية ثلاثية الأبعاد لمعقد إكسوسوم Saccharomyces cerevisiae بدقة متوسطة باستخدام طريقة إعادة البناء المائلة المخروطية العشوائية (RCT).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الجزيئات الحيوية الكبيرة
- مجهر إلكتروني
- البيولوجيا البنيوية
الخلفية
- معقد الإكسوسوم مهم لمعالجة الحمض النووي الريبي وتدهوره.
- البصوغ السلبية في المجهر الإلكتروني هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لتصور المجمعات الجزيئية الكبيرة.
- تتيح إعادة البناء المائلة المخروطية العشوائية إنشاء هياكل ثلاثية الأبعاد من صور ثنائية الأبعاد.
- تحضير العينات أمر حاسم للحصول على تصوير ناجح.
غرض الدراسة
- لإظهار طريقة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد لمعقد الإكسوسوم.
- لتوفير بروتوكول للباحثين الجدد في تقنيات المجهر الإلكتروني.
- لتسليط الضوء على التحديات في تحضير العينات ومعالجة الصور.
الطرق المستخدمة
- ترسيب طبقة رقيقة من فيلم الكربون على شبكة كربون مقدسة.
- تطبيق العينة والصبغة على الشبكة لتضمين العينة في أملاح المعادن الثقيلة.
- إجراء تصوير إلكتروني لالتقاط أزواج ميل من الصور المجهرية.
- تحليل الصور باستخدام طريقة الميل المخروطي العشوائي لإعادة البناء الهيكل ثلاثي الأبعاد.
النتائج الرئيسية
- الحصول الناجح على أزواج ميل لمعقد الإكسوسوم.
- تم إعادة البناء الهيكل ثلاثي الأبعاد لمعقد الإكسوسوم بدقة متوسطة.
- تم تحديد التحديات في تحضير العينات.
- تمت مناقشة تقنيات معالجة الصور لتحليل فعال.
الاستنتاجات
- طريقة الميل المخروطي العشوائي فعالة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد للمجمعات الجزيئية الكبيرة.
- التحضير المناسب للعينات ضروري للحصول على نتائج عالية الجودة.
- يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين في تصور الهياكل المعقدة في علم الأحياء.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single particle electron microscopy (EM) reconstruction using the random conical tilt (RCT) method enables structural elucidation of large macromolecular complexes without the need for crystallization, addressing a key bottleneck in early discovery. This approach supports predictive confidence in target validation by providing 3D structural data from minimal sample quantities. Its integration into discovery pipelines enhances mechanistic understanding and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of macromolecular complexes to clarify structural hypotheses.
- Supports functional target validation by revealing 3D architecture at medium resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing structural context for complex assemblies.
- Improves predictive confidence for downstream biological interrogation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated structural models for use in structure-guided screening campaigns.
- Standardizes specimen preparation and imaging workflows for reproducibility.
- Generates quantitative 3D outputs to benchmark assay performance.
- Enables reliable evaluation of molecular interactions in screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant complexes for translational continuity.
- Supports preclinical model development by informing on complex assembly and function.
- Provides mechanistic insights that guide risk-adjusted advancement decisions.
- Enhances predictive de-risking for candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The RCT-based EM reconstruction method fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational structural data for hypothesis testing and target validation.
- Discovery Biology: Delivers 3D reconstructions that clarify macromolecular organization and support hypothesis-driven research.
- Screening: Supplies reproducible structural templates for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Produces quantitative volumetric data and class averages for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by aligning structural findings with functional models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for structural interrogation of diverse complexes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes specimen preparation and image processing for scalable implementation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM specimen preparation and image analysis workflows.
- Demands access to transmission electron microscopy and computational infrastructure for 3D reconstruction.
- Necessitates cross-team standardization of grid preparation and data processing protocols.
- Adaptation may be needed for complexes of varying size or symmetry.
- Resolution is limited for asymmetric or small complexes, as supported by the method's constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Principle of the Random Conical Tilt Method
2:10
Preparation of Holey Carbon Grids Covered with Thin Carbon
5:08
Negative Staining of the Exosome Complex
6:23
Electron Microscopy of the Exosome Complex
8:10
Image Processing of the Data
10:55
Representative Results for Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method
11:29
Conclusion
