ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

يهدف هذا الإجراء إلى جمع صور متسلسلة من خلال منطقة محددة من أنسجة الدماغ باستخدام حزمة الأيونات المركزة والمجهر الإلكتروني الماسح. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تقسيم الدماغ إلى شرائح يتم صبغها ثم غمرها في الراتنج. وتتمثل الخطوة الثانية في قص المنطقة المستهدفة من مقطع الدماغ المغمور وتثبيتها على كتلة راتنج فارغة.

تتمثل الخطوة الثالثة في تهذيب كتلة الراتنج باستخدام الميكروتوم الفائق (ultra microtome) واستخدام الحزمة الأيونية للمجهر لعزل المنطقة المراد تصويرها فقط. وتتمثل الخطوة النهائية في تصوير وجه كتلة الراتنج بشكل تسلسلي باستخدام الحزمة الأيونية لإزالة طبقات رقيقة بشكل متكرر قبل التقاط كل صورة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر صوراً تسلسلية عبر منطقة الاهتمام.

تُجمع سلسلة الصور تلقائياً، وعادةً ما تحتوي مجموعة البيانات على فوكسلات متساوية القياس (isotropic voxels) بحيث يمكن عرض بنيات الصور من أي زاوية في المكدس. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر الإلكتروني النافذ للمقاطع المتسلسلة في قدرتها على تحقيق دقة أعلى بكثير في المحور Z. ومقارنة بالتصوير المقطعي الإلكتروني، فهي قادرة على تصوير أحجام أكبر بكثير بدقة مثالية للعينات المغمورة في الراتنج.

تبدأ العملية بتشريح الدماغ المثبت من جرذ مخدر تم إجراء تروية له. يوضع الدماغ في قالب بلاستيكي يحتوي على 5% aeros دافئ، ويتم توجيه الدماغ إلى الزاوية الصحيحة قبل أن يتصلب الـ aeros، ثم تُثبت كتلة الـ aeros التي تحتوي على الدماغ على حامل عينات باستخدام جهاز vibrato slice. تُقطع مقاطع إكليلية بسمك 80 micron، ويتم قطع عدد المقاطع اللازم ليشمل المنطقة ذات الصلة.

بعد ذلك، ضع العينات في قوارير زجاجية عازلة سعة 20 milliliter. ضع ما يصل إلى 10 مقاطع في كل قارورة. اشطف العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام K coate buffer بتركيز 0.1 molar.

بعد ذلك، تُصبغ العينات بـ 1.5% potassium cyanide و 1% osmium tetroxide في محلول K coate buffer بتركيز 0.1 molar لمدة 30 دقيقة. ويستمر صبغ العينات بـ 1% osmium Tetroxide في محلول K coate buffer بتركيز 0.1 molar لمدة 30 دقيقة. عقب ذلك، تُشطف العينات مرة واحدة بالماء المقطر مرتين لمدة ثلاث دقائق، ثم تُصبغ بـ 1% al acetate في ماء مقطر مرتين لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، اغسل المقاطع لمدة خمس دقائق في ماء مقطر مزدوج، ثم قم بتجفيفها باستخدام سلسلة كحولية متدرجة، مع ترك دقيقتين لكل عملية تغيير. الخطوة التالية هي طمر المقاطع في تركيزات متزايدة من راتنج Duran الممزوج بالكحول، مع ترك 30 دقيقة بين كل تغيير. ابدأ بنسبة 50 إلى 50 من الإيثانول إلى الراتنج، ثم 30 إلى 70، ثم 10 إلى 90، وأخيراً ضع المقاطع في راتنج بتركيز 100% لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، استبدل الوسط براتنج duran طازج بنسبة 100%. قم بالرج ببطء لمدة ساعة واحدة على الخلاط الدوار. بعد عملية الطمر، استخدم عود خشبياً لوضع المقاطع على شرائح مجهرية زجاجية تم طلاؤها مسبقاً بعوامل فصل القوالب.

ضع أكبر عدد ممكن من المقاطع على الشرائح، ولكن احذر من تكدير الشرائح بشكل مفرط. تأكد أيضاً من وضع ملصق تعريف بين شرائح المجهر. ضع الشرائح في فرن عند درجة حرارة 65 degree Celsius لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي، أخرج العينات من الفرن. ادفع شفرة حلاقة برفق بين شرائح المجهر الزجاجية، ثم أزل طبقة الراتنج التي تحتوي على العينات من بين الشرائح مع الإمساك بطبقة الراتنج بأصابعك. اغسل العينة برفق تحت الماء الجاري.

لإزالة أي عوامل فصل للقوالب، ضع العينة تحت مجهر تشريحي مزود بإضاءة نافذة باستخدام عدسة شيئية منخفضة القوة. حدد المنطقة المراد دراستها باستخدام إبرة دقيقة. استخدم شفرة حلاقة لقص مربع صغير بمقاس 3 mm في 3 mm حول المنطقة المراد دراستها.

استخدم غراء الأكريليك لتثبيت كتلة الراتنج الصغيرة فوق كتلة راتنج فارغة. بعد ذلك، قم بتثبيت الكتلة في حامل الميكروتوم فائق الدقة. ومن خلال النظر عبر المجهر الستيريو الملحق، استخدم شفرة حلاقة للتشذيب حول المنطقة المراد دراستها حتى لا يتبقى سوى هرم صغير من المادة.

اقطع حافة القالب بالقرب من المنطقة المستهدفة بزاوية مائلة بالنسبة للسطح العلوي للقالب باستخدام سكين زجاجية مثبتة في الميكروتوم الفائق (ultra microtome). قم بتهذيب القالب بشكل أكبر بحيث يمكن تحديد موقع المنطقة المستهدفة بدقة بالنسبة لأبعاد سطح القالب. انزع القالب من الميكروتوم الفائق وضعه تحت مجهر الضوء النافذ.

قم بتصوير المنطقة المراد دراستها. استخدم منشار مجوهرات لقطع الكتلة المقلمة بعيداً عن قاعدة الراتنج المتبقية باستخدام طلاء الكربون. قم بتثبيت الكتلة المقطوعة (SA off block) على حامل عينات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ووجهها بحيث يكون الجانب المراد تصويره مواجهاً للحافة الخارجية.

بعد جفاف الغراء، انقل التحضير إلى نظام التبخير الفراغي والطلاء، وقم بتغطية القالب بطبقة رقيقة من الذهب تزيد عن 20 nanometers. أصبح قالب النسيج المضمن في الراتنج الآن جاهزاً للتصوير باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ذو الحزمة الأيونية المركزة. أدخل العينة في حاملها داخل المجهر بتكبير منخفض، وباستخدام تصوير الإلكترونات الثانوية، قم بتوجيه القالب بحيث تكون المنطقة المراد دراستها والجانب المراد تصويره من القالب في مواجهة العدسة.

يقوم المشغل بتوجيه الكتلة بحيث يكون الوجه المراد تصويره موازياً لحزمة الطحن. ويؤدي ذلك إلى توجيه حزمة الإلكترونات بزاوية 54 درجة بالنسبة لهذا الوجه باستخدام تيار حزمة أيونية يتراوح من 13 إلى 27 nano amps، وبجهد 30 kilovolts.

قم بإزالة شريط ضيق من الراتنج من مقدمة المنطقة المراد تصويرها. بعد ذلك، انتقل إلى وضع التصوير بالتشتت المرتد لمعاينة الوجه المبرد الذي يعلو المنطقة المستهدفة. وباستخدام الصورة المرجعية بالمجهر الضوئي التي تم التقاطها مسبقاً وصورة الوجه المبرد، حدد المنطقة الدقيقة على الكتلة التي سيتم بردها وتصويرها باستخدام نظام حقن الغاز في المجهر.

قم بترسيب طبقة واقية من الكربون أو المعدن بسمك ميكرون واحد تقريباً على سطح الكتلة فوق المنطقة المراد دراستها باستخدام تيار قدره 700 picoamps. وأخيراً، قم بطحن منطقة الكتلة التي سيتم التقاط الصور النهائية منها. اترك شعاع الطحن يطحن وجه هذه الصورة تماماً حتى تختفي جميع آثار الطحن من على الوجه.

حدد معاملات المجهر للتصوير المتسلسل للوجه. المعاملات النموذجية هي جهود تتراوح بين 1.2 إلى 2 kilovolts مع أحجام بكسل تتراوح بين 4 إلى 20 nanometers. يجب أن يكون زمن بقاء البكسل حوالي 10 microseconds بحيث يكون الوقت الإجمالي لعملية طحن الوجه والحصول على صورة واحدة أقل من دقيقتين.

اترك المجهر لمدة ساعتين على الأقل حتى تستقر أي تغيرات حرارية. ولتبديد ذلك، ابدأ عملية الطحن والتصوير للحصول على صور متسلسلة عبر المنطقة المستهدفة. يوضح هذا الشكل صورة تشتت عكسي بتباين معكوس لوجه القطعة، مما يظهر البنية الفائقة ضمن منطقة من الدماغ الملتف.

تظهر جميع الأغشية بوضوح، بالإضافة إلى البنى الجزيئية الضخمة. يتكون هذا الشكل من إجمالي 1,600 صورة تم جمعها بتباعد قدره خمسة نانومتر، مما نتج عنه مكدس صور ذو فوكسلات متماثلة المناحي. ويمكن تصوير هذا المكدس في أي مستوى وبنفس الدقة.

لذا، بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أنسجة الدماغ للتصوير المتسلسل باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ذو الشعاع المركّز.