الزخرفة على خلايا شفافة بصريا أقطاب إنديوم أكسيد القصدير

مرحبا ، أنا إيشا. أنا طالب دراسات عليا في السنة الثانية في مختبر الدكتور زين. نحن هنا في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة كاليفورنيا ديفيس.

سأريكم اليوم التحكم في إيان على أقطاب أكسيد الإنديوم 10 الشفافة المصنوعة بصريا في هندسة الأنسجة وقد بذلت جهود التجديد لتقليد البيئة المكروية للعضو. من أجل إنشاء هذه البيئة المكروية في المختبر ، من الضروري عزل الخلايا مكانيا وزمانيا على الركيزة. نحن مهتمون بتصميم الأسطح حيث يمكننا التحكم في موقع أنواع خلايا الكبد المختلفة.

في تجربة اليوم ، سوف نستخدم تعديل السطح والتصنيع الدقيق والكيمياء الكهربائية لتشكيل سطح يمكن تحويله من خلية غير لاصقة إلى لاصقة خلية. الخطوة الأولى هي الطباعة الحجرية الضوئية. فيما يلي مخطط تدفق لكيفية عمل هذه العملية.

الأزرق هو الضوء الزجاجي ، والأخضر هو أكسيد الإنديوم 10 المطلي فوق الضوء الزجاجي. أولا ، ما سنفعله هو مقاومة صورة معطف الدوران باللون الأحمر الموضح هنا أعلى ضوء الزجاج المطلي بأكسيد الإنديوم 10. ثم سنقوم بتمرير ذلك من خلال قناع الصور إلى الأشعة فوق البنفسجية وسيتم تطوير المناطق المكشوفة في حل متطور.

ستتم إزالة مناطق ITO غير المحمية بمقاومة الصور في تكنولوجيا المعلومات. ثم أخيرا ، ستتم إزالة جميع مقاومة الصور المتبقية في الأسيتون لتشكيل أقطاب ITO الخاصة بنا. فيما يلي مخطط التدفق للخطوات الثلاث المتبقية.

أولا ، سنقوم بتعديل السطح بالكامل باستخدام أسطوانة الوتد. سيؤدي ذلك إلى جعل السطح غير قاذورات ولن ترتبط به أي خلايا أو بروتينات. بعد ذلك، سنستخدم الكيمياء الكهربائية لامتصاص سيلين الوتد من القطبين I اللذين صنعناهما سابقا.

وأخيرا ، سنقوم باحتضان الخلايا الليفية فوق السطح وسوف ترتبط بشكل انتقائي فقط بمناطق الشريط. لذلك نحن الآن مستعدون لبدء تجربتنا. تتضمن الخطوة الأولى التصوير الصخري الضوئي ، والذي سيتم إجراؤه في غرفة نظيفة.

لذلك دعونا نمضي قدما وندخل إلى الغرفة النظيفة. حتى الآن نحن هنا في غرفتنا النظيفة. قبل أن نبدأ تجربتنا ، ما سنفعله هو خبز أكسيد القصدير الإنديوم أو عينات الطلاء ITO عند 200 درجة مئوية في فرننا.

بهذه الطريقة يمكننا تجفيف جميع أسطحنا. وبعد خبزها عند 200 درجة مئوية ، سنضعها على تقنية الدوران الخاصة بنا ونطبق بالفعل مقاومة الصور. لذلك بعد تجفيف ركيزة ITO الخاصة بنا ، سنأخذها ونضعها على ظرف تقنية الدوران.

هذا الظرف كبير بما يكفي لاستيعاب ربع ضوء زجاجي. ثم سنقوم بتطبيق الفراغ. بعد ذلك ، نطبق نغمة إيجابية ، مقاومة للصور على الركيزة.

بعد تطبيق مقاومة الصورة ، نمضي قدما ونبدأ. هذا ينطوي على خطوتين. الأول هو الانتشار ، والثاني هو طلاء الدوران في خطوة الانتشار.

يدور الظرف بسرعة 800 دورة في الدقيقة وهذا ينشر بشكل موحد مقاومة الصورة على السطح بالكامل. ومع ذلك ، فإن الخطوة التالية هي خطوة الدوران ، والتي تبلغ 4,000 دورة في الدقيقة وعند 4,000 دورة في الدقيقة ، فإنها تشكل طبقة رقيقة حقا. أعني برقيقة حوالي ميكرون واحد.

إذا قمت بتفكيك كلمة صورة ، ومقاومة ، فإنها تتحول إلى صورة ومقاومة. يتم تنشيطه بالضوء. ومن ثم ، فإننا نعمل في غرفة نظيفة ونستخدم ضوءا مفلترا حتى لا يتم تنشيط مقاومة باب الصورة الخاص بنا بواسطة الضوء ويكون مقاوما للأصول ، والتي سنقوم بها في الخاصية التي سنستخدمها لاحقا عندما نقوم بالنقش.

لقد انتهينا الآن من طلاء الدوران ، ومقاومة الصور على السطح ، وسنقوم فقط بإخراجها والانتقال إلى خطوتنا التالية. لذلك بعد خبز العينة لمدة دقيقة واحدة و 45 ثانية ، سنأخذها من اللوح الساخن وننقلها إلى بطانة قناع المدفع الخاصة بنا. هنا نأخذ القناع الذي نحتاجه ثم نضع القناع في الأعلى فوق الركيزة الخاصة بنا من أجل الحصول على طباعة تلامس بين الركيزة الخاصة بنا مع مقاومة المنفذ والقناع ، نضعها برقاقة زجاجية بحجم أربعة بوصات فقط لإضافة الوزن إليها.

وبمجرد أن ننتهي من ذلك ، نعيد تشغيل الغالق ثم نعرض العينة للأشعة فوق البنفسجية. بمجرد اكتمال التعريض الضوئي ، نقوم فقط بتحريك الغطاء بعيدا بترتيب عكسي. نخرج الرقاقة الزجاجية الخاصة بنا ، ونخرج قناعنا ، ثم نزيل الركيزة الخاصة بنا ونأخذها للتطوير.

بعد تعريض العينة ، نضعها في حل مطور. عندما تعرضت العينة لضوء الأشعة فوق البنفسجية ، كان هناك شكل أيون الهيدروجين ، والذي تم تحييده بالقاعدة ومحلول المطور ويتم إزالته بالفعل من السطح. لذا فأنت الآن تريد التأكد من أنك عندما تقوم بأخذ العينة ، فأنت تنحرف باستمرار عن الركيزة.

وعندما تفعل ذلك ، يمكنك أن ترى في الدقيقة أو الدقيقة والنصف الأولى تقريبا ، يتم تطوير المناطق المكشوفة السابقة وإزالتها من السطح. ولكن لكي يحدث التطوير الكامل ، تركناه في حل المطور لمدة خمس دقائق تقريبا. بعد اكتمال التطوير ، سنقوم بإخراجه ، وغسله وغسله بالماء ثم تجفيفه باستخدام مسدس النيتروجين.

بمجرد أن نجفف العينة ، سنأخذها ونصورها تحت المجهر. نحن هنا ننظر إلى العينة تحت المجهر. لقد أخرجناها للتو بعد تطويرها لمدة خمس دقائق.

هناك منطقتان يمكنك رؤيتهما هنا ، منطقة أغمق مغطاة بمقاومة الصور والمنطقة الأخف حيث تمت إزالة مقاومة الصورة. فيما يتعلق بالقناع الذي استخدمناه سابقا، كانت المناطق الداكنة على القناع هي المناطق الداكنة التي نراها الآن تحت المجهر، في حين أن المناطق الصافية التي نراها هنا كانت شفافة على القناع. أحد التصميمات الموضحة هنا هو مجرد مصفوفات بأحجام مختلفة تتراوح من 500 إلى 50 ميكرون ، في حين أن التصميم الآخر عبارة عن دائرة 1000 ميكرون مترابطة فقط.

إذن لدينا هنا تصميم مختلف تم إجراؤه باستخدام نفس الإجراء. هنا لدينا أقطاب كهربائية قابلة للعنونة بشكل فردي. ما أعنيه بذلك هو أن مناطق مختلفة من ITO مترابطة ويمكن تنشيطها بشكل مختلف.

على سبيل المثال هنا ، المناطق الدائرية المركزية ، يتم توصيلها بوسادة كهربائية واحدة هنا ، في حين أن المناطق المستطيلة الخارجية ، متصلة بوسادة كهربائية مختلفة. بهذه الطريقة يمكننا تحفيز هذين السطحين المختلفين في نقاط زمنية مختلفة. بعد النظر إلى عيناتنا ، فإن الخطوة التالية التي ننتقل إليها هي حفر العينة.

مهما كانت المناطق غير المحمية بالصور سيتم حفرها في نقش ITO. قبل القيام بذلك ، علينا التأكد من أننا نرتدي الملابس المناسبة لأن نقش ITO يحتوي على أحماض. والآن بعد أن أرتدي ثوبي الواقي من الحمض ، وأضع واقي وجهي ، سأسكب بعض النقش ITO في دورق زجاجي.

يتكون نقش ITO من 20٪ كلوريد الهيدروجين ، و 5٪ حمض النيتريك ، والباقي من ماء DI. ثم أحضر عينتي وضعها في النقش. في وقت سابق من المجهر ، رأينا أن هناك بعض المناطق التي لم تكن محمية برفع الصور.

هاجمت الأحماض الموجودة في نقش ITO تلك المناطق وتسببت في حفر ITO من تلك المناطق. عندما يتحلل ITO ببطء من السطح ، يتغير لونه. هنا يمكنك أن ترى أنه تغير من تغيير مزرق كان عليه في الأصل إلى هذا التغيير الأرجواني وهو الآن ينتقل إلى التبادل الأصفر.

التغيير في اللون إلى أن ITO يتم حفره بعيدا. والآن نحن هنا في 15 دقيقة. كل ITO ، محفور تماما.

وما الذي تراه الآن هو أن الصور محمية في مناطق ITO. لذلك بعد اكتمال النقش ، لا تزال هناك بعض الأحماض المتبقية على السطح. لإزالة هذه الأحماض، سنضعها في محلول كربونات الصوديوم، وهو ما سيعمل على تحييد كل الحمض.

بعد تحييد الأحماض ، سنقوم بإخراجها وتنظيفها بماء DI ثم تجفيفها بالنيتروجين. والآن انتهينا من النقش بالحمض. لا مزيد من الحمض ، لقد نفدت ثوبي الساخن.

سنقوم بإخراجها ونقلها وتصورها تحت المجهر. والآن نراقب العينة تحت المجهر. هذا بعد أن أجرينا نقش ITO.

في هذه الحالة ، تكون المناطق الداكنة عبارة عن مناطق زجاجية حيث تم حفر ITO بعيدا. والمناطق الأخف وزنا هي ITO المحمية بمقاومة الصور في هذه الحالة. مرة أخرى ، هذه هي المصفوفات من 500 إلى 50 ميكرون وفي الحالة الأخرى لدينا دوائرنا المترابطة التي يبلغ عدد منها ألف ميكرون.

لذلك نظرنا للتو تحت المجهر ورأينا أن هناك مناطق زجاجية ومناطق ITO ، لكن مناطق ITO كانت محمية بمقاومة الضوء. الآن نحن بحاجة إلى إخراج هذا المقاوم الضوئي. لذا كل ما سنفعله هو أخذ الركيزة الخاصة بنا ، ووضعها في الأسيتون ، ثم وضعها في الصوتنة وصوتنة لمدة 10 دقائق.

هذا يضمن أن كل مقاومة الصورة خلع ، يمكنك استخدامها كنغمات من تلقاء نفسها ، ولكن عن طريق الضرب الصوتي ، والذي يستخدم الموجات الصوتية للضرب ويضمن إزالة مقاومة الصورة بشكل صحيح. بعد إخراجه من الهواء الصوتي ، يتم غسله بماء DI ، وتجفيفه مرة أخرى بالنيتروجين ، والآن يمكنك رؤية الأنماط بوضوح على الركيزة الزجاجية. كانت هذه هي الأنماط التي كانت محمية في البداية بواسطة مقاومة الصورة.

الآن بعد أن نظرنا إلى عيناتنا ووجدنا أو صنعنا أنماط ITO الخاصة بنا ، سنبدأ مرحلتنا الثانية من التجربة. تتضمن هذه المرحلة تعديل السطح باستخدام طبقة أحادية التجميع ذاتيا من PEG cycline. لكن قبل القيام بذلك ، علينا التأكد من أن السطح تفاعلي.

للقيام بذلك ، نضعه في منظف البلازما. هذا يقدم مجموعات الهيدروكسيل على السطح وبالتالي يجعلها تفاعلية. للقيام بذلك ، نضع عينتنا في منظف البلازما ثم نقوم بتشغيل مضخة التفريغ الخاصة بنا.

نقوم بتشغيل الأكسجين ، ونقوم بتشغيل الطاقة الرئيسية. تستخدم هذه الطاقة لتحويل غاز الأكسجين إلى بلازما ، والتي يتم إدخالها بعد ذلك وبالتالي تشكل أخاديد الهيدروكسيل. وبمجرد تشغيل الطاقة ، نمضي قدما ونضغط على البدء.

والآن بعد اكتمال العملية ، نخرج الركيزة الخاصة بنا ونخزنها في طبق ونتوجه خارج الغرفة النظيفة de ثوب وننتقل إلى الخطوة التالية. والآن بعد أن خرجنا من الغرفة النظيفة وانتهينا من الزخرفة المثالية ، سنقوم بتعديل السطح الذي قمنا بتصميمه للتو بالبولي إيثيلين جلايكول أو CYLIN أو PEG Cylin. من المهم معرفة أن peg cylin يتفاعل مع الرطوبة.

ومن ثم ، يجب أن يكون كل ما نستخدمه من الخشب خاليا من الرطوبة. الأواني الزجاجية التي استخدمناها هنا ، أطباق الأليفة ، تم خبزها في درجة حرارة مائة درجة مئوية طوال الليل. والتون الذي سنستخدمه كمذيب هو أيضا اللامائي

لا يحتوي على رطوبة. لذا سأقوم الآن بصب التون ، التولو اللامائي في كل من هذه السماعات الزجاجية ، أحدهما يحتوي على عينتنا. الآن علينا استخدام طبقين من أطباق بتري لأن أحدهما هو المكان الذي سنقوم فيه بالتعديل.

والآخر الذي سنستخدمه لاحقا عندما ينتهي التعديل لغسل الركيزة بالفعل. لذلك بعد وضع أطباق البيتزا الزجاجية الخاصة بنا ، سأقوم فقط بأخذها ونقلها إلى غرفة غرفة غرفة معادلة الضغط الخاصة بنا هنا في صندوق القفازات. بعد إغلاق غرفة غرفة معادلة الضغط ، سنقوم بإدخال النيتروجين في الغرفة.

الآن الغرفة الرئيسية هنا مليئة بالفعل بالنيتروجين. ومن ثم لا نريد فتح هذه الغرفة إلا إذا كانت مملوءة بالنيتروجين. بمجرد أن تصبح كلتا الغرفتين من النيتروجين ، سنقوم بنقل جميع عيناتنا مع ماصة.

لدينا الوتد والملاقط التي سنستخدمها لاحقا لنقل العينات. لذلك سنلبس قفازاتنا ، ونفتح الغرفة هنا ونخرج ببطء وبعناية كل ما لدينا في غرفة معادلة الضغط الخاصة بنا ونضعه في الغرفة الرئيسية. هذا هو طبق بتري مع الركيزة الخاصة بنا وطبق بتري فقط مع التولوين الذي سنستخدمه للغسيل.

تم تعبئة pxi الموجود تحت النيتروجين ويجب ألا تفتح هذه الزجاجة إلا إذا كنت في بيئة من النيتروجين. ومن ثم ، بمجرد أن تريد إخراج العينة ، تعيدها إلى الحقيبة. إذن تخرج السيلين والتركيز الذي سنستخدمه هو 2٪ في التولوين.

لذلك تخرجه ، تضعه في الطول ، نخلطه. حسنا ، قم أيضا بالغرفة وتأكد من خلطها جيدا ثم اترك العينة تحتضن في Toin لمدة ساعتين. والآن بعد مرور ساعتين ، كانت عينتنا في Pxi ، سنقوم بإخراج العينة ونقلها إلى محلول جديد حيث سنقوم بغسلها لفترة وجيزة ، وتحريفها ، ونقلها إلى غرفة غرفة غرفة معادلة الضغط الخاصة بنا.

بمجرد أن تصبح في غرفة غرفة معادلة الضغط الخاصة بنا ، سنقوم ببساطة بفتح غرفتنا وإخراج سطحنا المعدل ويمكننا القيادة باستخدام مسدس النيتروجين. نضعها في طبق بتري نظيف وجاف مرة أخرى ونذهب ونضعها في فرن على حرارة مائة درجة مئوية لمدة ساعتين أخريين. والآن بعد أن تم خبز العينات في الفرن عند مائة درجة مئوية لمدة ساعتين، سنأخذ الأسلاك ونعلق بها الأقطاب الكهربائية التي أعددناها.

نقوم بذلك عن طريق صنع مزيج فردي من الايبوكسي الفضي وعامل معالجة. إذن هذا هو الإيبوكسي الفضي ، والآن نضيف نفس الكمية من المعالجة إليه. نريد خلطها جيدا، ثم سنأخذها ونستخدمها لتوصيل الأسلاك.

إذن، نضع السلك على الأقطاب الكهربائية التي نريد استخدامها، ثم نقوم بترميزه. لا يعمل اللحام على ITO ، وبالتالي يتعين علينا استخدام الايبوكسي الفضي وعامل المعالجة. ثم نخبز بحيث تتم إزالة كل عامل المعالجة الذي استخدمناه سابقا ويتصلب ويمكننا استخدامه كقطب كهربائي.

والآن بعد أن انتهينا من مرحلتين، سنبدأ المرحلة الثالثة من التجربة، وهي تنفيذ جزء الكيمياء الكهربية. لفعل ذلك، سنأخذ عينة ونضعها في الخلية الكهروكيميائية. بعد وضعها في الخلية الكهروكيميائية، سنضع فوقها حلقة O.

سيؤدي ذلك إلى عزل المنطقة التي ستحدث فيها الكيمياء الكهربية ، وبعد ذلك سنقوم فقط بإغلاق الخلية. لذلك وضعت عينتي مع السلك المتصل في الخلية الكهروكيميائية. الآن أنا مستعد لاستخدام الإحصائيات المحتملة لتطبيق الجهد.

إذن السلك الأبيض، سأرفقه هنا بالقطب المرجعي، والقطب الأحمر، والقطب المضاد، ثم أخيرا السلك الأخضر الذي سأرفقه بالقطب الكهربائي العامل. بمجرد توصيل كل هذه الأقطاب الكهربائية ، سأضيف محلول x واحد من محلول ملحي عازل فوسفات الفوسفات أو PBS إلى الكهروكيميائية نفسها. الآن فقط لتوضيح ذلك ، الطريقة التي ستعمل بها هي أن السطح بأكمله حتى الآن ، تم تعديله باستخدام pxi.

لذلك يتم تعديل جميع الأقطاب الكهربائية ، بما في ذلك المناطق الزجاجية المحيطة بها ، باستخدام pxi. بمجرد أن أقوم بتطبيق الجهد في كل مكان ، حيث يوجد ITO ، وهي تصميمات الأقطاب الكهربائية التي صنعناها ، فإن جزيرة الوتد ستنفجر فقط من تلك السطحات ولن يتأثر أي شيء في المناطق المحيطة. ومن ثم ، نقوم بإزالة جزيرة الوتد بشكل انتقائي من الركيزة الخاصة بنا.

والآن سأضغط على تشغيل، وسيبدأ ذلك ويطبق جهد يساوي سالب 1.4 فولت على القطب الكهربائي العامل. عند تطبيق الجهد ، يكون هناك تغيير في اللون يمكنك رؤيته على الأقطاب الكهربائية. يتغير من اللون الأزرق المخضر الشفاف الذي كان علينا أن نتحول إلى اللون البني.

نشك في أنه قد يكون هناك تفاعل أكسدة قد يحدث في الأقطاب الكهربائية مما يؤدي إلى تحولها إلى اللون البني. هذا أيضا أحد المؤشرات التي تشير إلى أن pxi من السطح قد تم تجريده بالفعل من السطح. ومرة أخرى ، أينما رأيت اللون البني ، هذا هو المكان الذي تمت إزالة جزيرة الوتد منه.

ولا تزال المناطق الزجاجية المحيطة بها PXI مجمعة عليها. إذن، نطبق جهد سالب 1.4 واط لمدة 60 ثانية. هذا يعطي وقتا كافيا لإزالة جميع pxi التي كانت موجودة على الأقطاب الكهربائية.

يمكننا أيضا استخدام هذه الطريقة لتجريد الأقطاب الكهربائية التي يتم تناولها بشكل فردي. في هذه الحالة ، كانت هناك ثلاثة صفوف من الدوائر التي سيتم تجريدها. يمكننا تحديد ما الذي نريد تجريده باستخدام الأقطاب الكهربائية الثلاثة المختلفة.

لقد انتهينا الآن بنجاح من الجزء الثالث من الكيمياء الكهربية حيث أزلنا سيلينغ PG بشكل انتقائي من أقطاب ITO. قمت بغسلها لفترة وجيزة بماء PBS و DI ، وأزلت السلك ووضعت العينات في ستة أطباق آبار عادية فقط. الآن سننتقل إلى الخلايا المزروعة على هذه الأقطاب الكهربائية.

والآن نحن هنا في غرفة زراعة الأنسجة. في المرحلة الأخيرة من التجربة، سنستخدم الخلايا الليفية اليوم، ثلاث خلايا تائية ثلاثية. يتراوح التركيز الذي نستخدمه لبذر الخلايا بين 0.5 إلى 1.5 مليون خلية لكل مل.

بعد زرع الخلايا ، نترك الخلايا في عينتنا لمدة 20 دقيقة تقريبا. سيتيح لها ذلك متسعا من الوقت لإرفاقها بالمناطق المجردة. لذلك سنضعها في الحاضنة.

لقد مرت الآن 20 دقيقة ونحن مستعدون للنظر في الخلايا التي تم تصميمها على المناطق المجردة من ITO ، المناطق البنية التي رأيناها سابقا ، ولن ترتبط فقط على وجه التحديد بتلك المناطق ولن ترتبط في أي مكان خارج تلك المناطق. هنا يمكنك أن ترى أن المناطق البنية كانت مناطق ITO التي تم تجريدها من pxi. باستخدام الكيمياء الكهربية ، ترتبط الخلايا بهذه المناطق البنية فقط وليس المناطق الزجاجية المحيطة.

في هذا الإطار الآخر ، مرة أخرى ، نرى سيلتز يرتبط بالمناطق المجردة. هذه هي المناطق البنية ، ولكن فوق تلك المناطق البنية بالكاد يمكنك رؤيتها ولم يتم تجريد تصميم ITO PEG من تصميم ITO هذا ، وبالتالي لا توجد خلايا مرتبطة به. حسنا ، هذا كل شيء.

لقد انتهينا من البروتوكول والخلايا لها نمط على أقطاب ITO وهذا بالضبط ما أردناه. لقد أوضحت لكم للتو التحكم في التصاق الخلية على أقطاب أكسيد الإنديوم 10 الشفافة بصريا المصنوعة جزئيا. أوضحت لك اليوم كيفية تصميم ثلاثة خلايا ليفية على هذه الأقطاب الكهربائية.

لقد استخدمنا أيضا نفس الإجراء لتصميم خليتين من Hep G وخلايا الأقمار الصناعية والخلايا الأولية للفئران. تسمح تقنيات زخرفة الخلايا الحالية فقط بتجميع نوعين من الخلايا على السطح. ستسمح مرونة هذه التقنية بتجميع أنواع متعددة من الخلايا على السطح معزولة مكانيا في المستقبل.

نخطط لاستخدام هذه التقنية لعزل مكاني ثلاثة أنواع مختلفة من خلايا الكبد على ركيزة ITO من أجل تقليد البيئة المكروية في الجسم الحي. من خلال القيام بذلك ، يمكننا عزل الخلايا غير الناضجة أو الخلايا الجذعية مكانيا جنبا إلى جنب مع الخلايا الناضجة والخلايا الداعمة. سيخلق هذا بيئة مفيدة للخلايا غير الناضجة لتنمو وتتمايز.