خلفية رفض الإسفار في الرنين وMicrospectroscopy رامان العفوي

يهدف هذا الإجراء إلى إنشاء بوابة بصرية بالكامل تسمح بمرور الضوء المشتت بطريقة رامان مع حجب إشارات الفلورة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إثارة تشتت رامان واستقطابه. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تجهيز شعاع الضخ لتشغيل البوابة.

ثالثاً، يجب ضبط المضخة والرام والنبضات بحيث تكون متداخلة. والخطوة النهائية من الإجراء هي الحصول على أطياف محددة زمنياً. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر التكميم والتصنيف البيوكيميائي من خلال تحليل إشارات رامان بنسب إشارة إلى ضوضاء عالية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الإزالة البرمجية للخلفية الفلورية، في تقليل ضجيج الطلقة (shot noise) الناتج عن الفلورة بشكل كبير. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجالات البيولوجية والطبية الحيوية، مثل التوصيف غير الجراحي للتركيب الكيميائي للفلور الداخلي في الخلايا البكتيرية والأنسجة، وفهم العمليات الخلوية والأمراض مثل السرطان، أو الأمراض الوعائية، أو الأمراض التنكسية العصبية باستخدام العلامات الجوهرية. كما قد تساعد هذه الطريقة في تطوير مجسات جديدة يمكن استخدامها كعلامات فلورية وعلامات RAM في آن واحد، وكذلك في تطوير مستشعرات طبية غير جراحية لتحليل الدم.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الأنظمة البيولوجية للهندسة الطبية الحيوية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في مجالات أخرى مثل الوقود الحيوي، أو الأبحاث، أو صناعة الاتصالات. وعادةً ما توضع العينات البيولوجية على شريحة غطاء ذات سمك رقم واحد مثبتة في غرفة خلية ATO Fluor.

توضع العينات السائلة، لا سيما تلك السامة للبشر، في زجاجة صغيرة ذات غطاء زجاجي مُثبت عند الفتحة بواسطة إيبوكسي السيليكون، ثم تُقلب للقياس. توضع العينات على المنصة الثانوية المثبتة أعلى منصة المجهر، والتي تمتلك تحكماً مستقلاً في التركيز لالتقاط أطياف رامان ذات البوابة الزمنية. أولاً، يجب تحضير شعاع الإثارة بشكل صحيح؛ حيث يبدأ الضوء المنبعث من ليزر sapphire نبضي قابل للضبط بقدرة 2.4 watt. يجب أن تحتوي كل نبضة في سلسلة النبضات ذات التردد 80 megahertz على طاقة قدرها 30 nano joules، وعرض زمني يبلغ 140 femtosecond، وطيفاً مركزه 808 nanometers مع عرض نطاق طيفي يبلغ حوالي 6 nanometers. ولمنع الانعكاسات الخلفية من إعادة الدخول إلى تجويف الليزر، يجب تمرير الضوء عبر عازل فاراداي (Faraday isolator)، مع وضع لوحة نصف موجية قبل عازل فاراداي للسماح بالضبط المستمر لإجمالي القدرة المرسلة إلى النظام.

نظراً لأن عرض النطاق البالغ 6 نانومتر واسع جداً بحيث لا يمكنه تحليل معظم أنماط رامان، يتم تمرير الشعاع عبر مرشح تمرير نطاق ضيق للغاية. اضبطه عند 808 نانومتر. بعد ذلك، استخدم عدسة ثنائية اللون لتركيز الضوء على بلورة بيتا باريوم بورات بقطر 5 مليمتر.

استخدم بلورة مضاعفة التردد لتحويل نصف الطول الموجي من 808 nanometers إلى 404 nanometers. ضع بلورة beta barium borate في حامل مزود بعناصر تحكم في الميل والإمالة (tip and tilt) ومثبت على منصة إزاحة. ولتحقيق أقصى قدر من كفاءة تحويل الطول الموجي، يجب وضع البلورة بدقة وبشكل متماثل حول بؤرة العدسة المزدوجة، مع محاذاة محور البلورة مع استقطاب الحزمة الواردة.

بما أن كفاءة تحويل الطول الموجي تعتمد على الاستقطاب، فإنه يمكن التحكم في كمية الضوء المرسلة إلى العينة عن طريق وضع لوح نصف موجي ثانٍ بعد العازل الفارادي. ومن خلال تدوير هذا اللوح الموجي، يمكن ضبط شدة الضوء المرسلة إلى العينة بشكل مستقل عن الشدة المرسلة في شعاع الضخ. بعد ذلك، يتم إعادة موازاة الضوء المحول طولياً بواسطة عدسة ثنائية اللون (achromatic doublet) ثانية مختارة بحيث يكون الشعاع المثير كبيراً بما يكفي لملء الفتحة الخلفية لعدسة المجهر الشيئية، ثم يتم توجيهه إلى مجهر مقلوب بواسطة مرآتي توجيه.

تحدد عدسة microscope objective المحور البصري لمحاذاة شعاع الإثارة مع هذا المحور. ضع مرآة في مستوى العينة الخاص بالمجهر. بعد ذلك، يتم ضبط مرآتي التوجيه بشكل تكراري أثناء مراقبة شعاع الليزر المنعكس عكسياً على كاميرا CCD متصلة بفتحة التصوير في المجهر.

بافتراض أن الصورة على الكاميرا تتوسط مجال الرؤية في المجهر، فإن الشعاع يكون على المحور. ويكون ذلك عندما تتوسط البقعة البؤرية شريحة المجهر ولا تؤدي إزاحة الشيئية على طول المحور Z إلى أي تغيير. وتحدث نقطة المركز لتشتت رامان للشعاع غير المركّز عندما توضع العينة في مستوى العينة ويتم تشعيعها بضوء الليزر.

يعمل مرشح ثنائي اللون (dichroic filter) موضوع أسفل عدسة المجهس الشيئية على فصل ضوء رامان (Raman) المشتت والمزاح موجياً عن حزمة الإثارة، حيث يوجه ضوء رامان المشتت نحو المنفذ الجانبي للمجهر. وقد تم تعديل المجهر لإزالة أي عدسات ضمن هذا المسار، بحيث يخرج ضوء الإشارة من المجهر دون عوائق لأن حزمة الإشارة الخارجة من المجهر تكون أكبر من الفتحة الصافية للغدة.

تُستخدم مستقطبات ثومسون، وتلسكوب بمقدار 0.47 مرة مكون من عدستين عطرية مزدوجة لتقليص الحزمة. ثم يتم استقطاب ضوء الإشارة بواسطة مستقطب ثومسون ذي حاشية موجه عند صفر درجة بالنسبة للمحور الرأسي في إطار المختبر، ويوجه إلى مرآة ثنائية اللون حيث يتم دمجه مرة أخرى مع حزمة الضخ. تُرسل حزمة الضخ إلى خط تأخير يتكون من مرآتين متعامدتين، كلتاهما موضوعتان على منصة إزاحة خطية يمكن ضبطها لضمان التداخل الزمني لنبضات الضخ والإشارة.

بعد خط التأخير، يتم إرسال الحزمة عبر صفيحة نصف موجية ومستقطب موجه بزاوية 45 درجة بالنسبة للمحور الرأسي في إطار المختبر. يضمن ذلك الحالة الصحيحة لاستقطاب حزمة الضخ عند وصولها إلى الوسط غير الخطي. بعد ذلك، ينعكس الضوء عن مرآتي توجيه، إحداهما مزودة بعناصر تحكم كهرضغطية، والتي يجب استخدامها لضبط الموضع النهائي لحزمة الضخ بحيث تتداخل مكانيًا مع حزمة الإشارة.

لتحقيق هذا التداخل، يراعى رصد حزمتي الضخ والإشارة في موقعين، أحدهما قريب والآخر بعيد عن المرآة ثنائية اللون حيث يتم دمج الحزمتين؛ وذلك باستخدام مرآة التوجيه الأولى لمطابقة الحزمتين في النقطة القريبة، ومرآة البيزو لمطابقتهما في النقطة البعيدة، وبذلك يمكن جعل حزمة الضخ على خط استقامة تام مع حزم الإشارة. بعد ذلك، يجب إعداد نظام التجميع والتجعيد لزيادة الإشارة المجمعة المحددة زمنياً إلى أقصى حد. وللقيام بذلك، يتم تمرير حزمتي الضخ والإشارة أولاً عبر مرشح ثنائي اللون بكثافة بصرية OD تبلغ ستة عند 404 nanometers لمنع أي ضوء استثارة متبقٍ من إثارة وتشتيت الضوء داخل الوسط غير الخطي.

يتم بعد ذلك تركيز حزمتي الضخ والإشارة بواسطة عدسة مزدوجة كروية في خلية كوارتز بطول مسار يبلغ سنتيمتر واحد تحتوي على المادة غير الخطية؛ حيث يمكن استخدام أي مادة غير خطية ذات معامل انكسار غير خطي مرتفع بما يكفي واستجابة زمنية قصيرة بما يكفي. في هذه التجارب، استخدمنا ثاني كبريتيد الكربون. ثم يتم إعادة موازاة الضوء بواسطة عدسة مزدوجة ثانية ذات طول بؤري مطابق للعدسة الأولى.

تمر الأشعة بعد ذلك عبر محلل غلاند-طومسون (gland Thompson analyzer) مثبت على حامل دوار، ثم عبر مجموعة من مرشحات الامتصاص والتداخل التي تبلغ كثافتها الضوئية (OD) مجتمعة 10 عند 808 نانومتر. وأخيرًا، يتم تركيز ضوء الإشارة بواسطة عدسة ثنائية الكروم (aromatic doublet) داخل ليف بصري متعدد الأنماط بقطر 50 ميكرون، حيث يتم تثبيت الليف في منصة تسمح بالإزاحة في محاور X و Y و Z. يتم بعد ذلك توصيل الليف بمطياف تصوير تجاري مزود بكاميرا CCD لمحاذاة نظام التجميع بما يضمن أقصى قدر من الإشارة المجمعة، وضبط المحلل على صفر درجة، ووضع عينة اختبار من التولوين في مستوى العينة، وتحسين إشارة رامان المجمعة عن طريق ضبط عناصر التحكم في X و Y و Z لحامل الليف لضمان التداخل المكاني والزماني الصحيح بين أشعة الضخ والإشارة. ضع مرآة في مستوى العينة بالمجهر.

بعد ذلك، قم بإزالة مرشح 404 nanometer من النظام. قم بتدوير المحلل إلى 90 درجة بحيث يتم توجيه حزمة 404 nanometer المنعكسة رجعيًا إلى المطياف، مع ضبط الشدة بحيث لا تتسبب في إشباع الكاميرا. الآن، مع إيقاف حزمة الضخ، قم بتدوير المحلل لتقليل إشارة 404 nanometer المرسلة إلى أدنى حد.

بعد ذلك، قم بتشغيل شعاع المضخة مرة أخرى واضبط مرحلة التأخير ببطء حتى يبدأ نفاذ الضوء بطول موجي 404 nanometer في الزيادة. بعد ذلك، قم بتدوير مرحلة التأخير، والمرآة الكهرضغطية (piezoelectric)، وعناصر التحكم X و y و Z للألياف بشكل تكراري لزيادة الإشارة إلى أقصى حد، وذلك لأن شعاع 404 nanometer المنعكس رجعيًا والضوء المشتت بطريقة رامان قد يسلكان مسارات مختلفة قليلاً عبر النظام. قم بإجراء التعديلات النهائية بوضع مادة قوية التشتت بطريقة رامان مثل toluene على منصة العينة، واستبدال مرشح رامان، وإجراء تعديلات طفيفة على المحاذاة عن طريق تغيير مرحلة التأخير والمرآة الكهرضغطية وعناصر التحكم X و Y و Z للألياف لتحسين إشارة رامان.

أصبح النظام الآن جاهزاً لجمع الأطياف. يتطلب ذلك أولاً الحصول على عدة منحنيات خلفية لتصحيح الشوائب الناتجة عن النظام. أولاً، يتم ضبط المحلل على صفر درجة، مع تشغيل شعاع الإثارة وإيقاف شعاع الضخ.

احصل على طيف غير مُقيد (ungated spectrum)، ثم اضبط المُحلل عند زاوية 90 درجة واجمع طيف خلفية يمثل الضوء الشارد المتسرب عبر المستقطبات. بعد ذلك، ومع بقاء المُحلل عند زاوية 90 درجة، أوقف تشغيل شعاع رامان وشغّل شعاع الضخ. اجمع طيف خلفية ثانٍ يمثل كمية ضوء الضخ المتسرب عبر المرشحات ثنائية اللون (dichroic filters).

أخيرًا، ومع إطفاء جميع الليزرات، قم بجمع طيف مظلم مرجعي يمثل مستوى التيار المظلم للكاميرا والإلكترونيات. وفي النهاية، قم بتشغيل جميع الحزم وجمع طيف محكوم ببوابة. وللحصول على الطيف الحقيقي للضوء المار عبر البوابة فقط، يجب طرح طيفي الخلفية الاثنين والطيف المظلم من هذا الطيف المحكوم ببوابة.

نرى هنا مخططاً بيانياً لنظام التجعيد. يظهر مسار حزمة الضخ كخط أحمر متصل، بينما يظهر مسار SHG كخط كحلي متصل. أما المسار الذي يتداخل فيه تشتت رامان والفلورة فيظهر باللون الأخضر.

بينما يظهر المسار الذي تم فيه تصفية الفلورية مؤقتاً باللون الأصفر. ونرى هنا الأطياف الخام للكومارين المذاب في زيت الغمر. يوضح المنحنى الأحمر الطيف الذي تم التقاطه مع إبقاء البوابة مفتوحة، بينما يوضح المنحنى الأسود الطيف الذي تم التقاطه مع ضبط المحلل لتحقيق أدنى نفاذية مع تطبيق شعاع الضخ.

يظهر المنحنى الأزرق الطيف الذي تم التقاطه مع ضبط المحلل عند الحد الأدنى من النفاذية وبدون تطبيق شعاع الضخ، بينما يظهر المنحنى الأخضر الطيف الذي تم التقاطه عند تطبيق شعاع الضخ فقط. وقد تم تنعيم جميع الأطياف باستخدام مرشح KY gole من الدرجة الثالثة بـ 11 نقطة. وتشير الخطوط المتقطعة باللون الأرجواني إلى المنطقة الطيفية الموضحة في الرسم البياني التالي.

نرى هنا أطياف الكومارين المذاب في زيت الغمر بعد طرح خلفية الفلورة. يمثل المنحنى الأحمر الطيف عند بقاء البوابة مفتوحة، بينما يمثل المنحنى الأزرق الطيف المطبق عليه نظام البوابة. ويظهر الطيف المطبق عليه نظام البوابة بوضوح التواء رقم الموجة العالي، وهي قمة مميزة للزيوت.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الليزر يجب أن يمتلك أولاً طاقة نبضة كافية لتشغيل الـ ga، وأن النظام يتطلب تداخلاً مكانياً وزمنياً دقيقاً للغاية بين النبضتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو وقراءة البروتوكول المرفق، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل شعاع الليزر إلى شعاع إثارة وشعاع منحنى، وكيفية جعل هذين الشعاعين متداخلين، مكانياً وزمنياً على حد سواء.

كيفية تسجيل إشارة رامان عبر المطياف وC وc وD، وكذلك كيفية تصور إشارة رامان وتحليلها. لا تنسَ أن العمل باستخدام الليزر قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء نظارات واقية من الليزر أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء. تنطبق قواعد سلامة إضافية عند استخدام المواد غير الخطية وعند استخدام عينتك المحددة.