إجراء 1.5 ساعة لتحديد معوي أنواع الثقافات مباشرة من الدم

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحديد السريع لأنواع المكورات المعوية (enterococcus species) من زجاجات مزارع الدم الإيجابية باستخدام التهجين الفلوري لحمض النووي الببتيدي (PNA-FISH). وبمجرد تحضير مزارع الدم وإجراء اختبار صبغة جرام للتأكد من وجود مستنبتات المكورات المعوية، يتم تثبيت العينات على شرائح مجهرية مخصصة لـ PNA-FISH. ثم يتم تحضين الشرائح مع مجسات PNA متخصصة للكائنات الحية المستهدفة.

بمجرد تهجين المسابر، يتم إجراء عمليات غسيل صارمة لإزالة المسابر الزائدة غير المهجنة. تُضاف وسائط التثبيت إلى الشرائح، ثم تُغلق باستخدام أغطية شرائح. ويمكن تحديد أنواع enterococcus الموجودة في العينة عن طريق المجهر الفلوري.

يعد بروتوكول تحديد الهوية باستخدام تقنية PNA Fish فريداً من نوعه في توفيره لطريقة سريعة ومحددة لتحديد بكتيريا enterococcus من الشلل. عينات زراعة دم المريض: قم بتحضين زجاجتين من زراعة الدم، إحداهما هوائية والأخرى لاهوائية، تحتويان على دم وريدي من مريض يُشتبه بإصابته بتسمم الدم، وذلك في جهاز آلي لزراعة الدم عند درجة حرارة 35 °C. وبمجرد أن يشير الجهاز إلى اكتشاف نمو ميكروبي، قم بإزالة الزجاجة، ورج زجاجات زراعة الدم بلطف لإعادة تعليق البكتيريا بشكل متجانس.

ثم باستخدام حقنة وإبرة معقمة، انقل بطريقة معقمة حوالي 5 milliliters من الدم من كل زجاجة إلى أنبوب منفصل ذو غطاء لولبي. بمجرد توزيع جميع العينات، استخدم ماصة معقمة لنقل قطرة من الدم من كل أنبوب إلى شريحة مجهرية زجاجية منفصلة. اترك الشريحة لتجف في الهواء لمدة 15 minutes تقريباً.

بعد ذلك، وبمجرد جفاف الشريحة تماماً، اغمر الشريحة في الميثانول لتثبيت العينة. وبعد تثبيت الشرائح، اغسلها وأجرِ صبغة جرام القياسية لتحديد مورفولوجيا الكائنات الموجودة في كل مزرعة دم. افحص الشرائح المصبوغة باستخدام مجهر مزود بعدسة شيئية زيتية غامرة.

سوف تظهر أنواع الكوكسي المختارة على شكل مكورات إيجابية الجرام، وعادة ما تكون متجمعة في أزواج أو سلاسل قصيرة. ضع قطرة واحدة من محلول التثبيت في بئر شريحة مجهرية. اخلط أنبوب مزرعة الدم المراد فحصه برفق.

ثم انقُل 10 µL من المزرعة إلى قطرة محلول التثبيت، وقم بسحب السائل للأعلى والأسفل بواسطة الماصة لاستحلاب العينة. ضع الشرائح على لوح تسخين عند 55 °C لمدة 20 دقيقة لتثبيت المسحات في كل اختبار. تأكد من تضمين شرائح ضابطة موجبة وسالبة لتقييم جودة المقايسة.

يمكن شراء شرائح التحكم في الكالوس من شركة Van DX أو تحضيرها باستخدام مستنبتات مرجعية. وبمجرد أن تصبح اللطخة جاهزة، ضع قطرة واحدة من EFI callous O-E-P-N-A في البئر الذي يحتوي على عينة مزرعة الدم، وكذلك في آبار التحكم الإيجابي والسالب. ولتجنب تلوث المحلول المخزون للمسبار، تأكد من عدم السماح لطرف زجاجة القطارة بلمس لطخة الدم.

ضع غطاءً شرائحياً فوق العينة، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات هوائية. ثم قم بحضن الشريحة على كتلة تسخين عند 55 °C لمدة 30 دقيقة. وللسماح لـ PNA بالتهجين بعد عملية الحضن، ضع الشرائح في حامل شرائح.

اغمر حامل الشرائح المحمل في وعاء صبغ يحتوي على محلول غسيل مسخن مسبقاً إلى 55 درجة Celsius. لإزالة حمض PNA الزائد عن العينة، انزع الغطاء الزجاجي برفق عن طريق تحريك الشريحة في المحلول المنظم أو باستخدام الملاقط. حضن الشريحة عند 55 درجة Celsius في محلول الغسيل لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، أخرج الشريحة من وعاء الصبغ واتركها تجف في الهواء. وبمجرد جفاف الشريحة، أضف قطرة واحدة من وسط التثبيت في درجة حرارة الغرفة إلى الشريحة، ثم ضع غطاء الشريحة بعناية فوق العينة. افحص الشرائح باستخدام مجهر فلوري مع استخدام مرشح ثنائي النطاق في غضون ساعتين من التحضير.

باستخدام هذه الطريقة، يمكن تمييز iffy و callous، الموضحين باللون الأخضر على اليسار، عن eum باللون الأحمر. وفي اللوحة الوسطى في أقصى اليمين تظهر نتيجة سلبية. ومن الأشياء الثلاثة التي يجب تذكرها لتحقيق نتائج ناجحة هي ضرورة الحفاظ على درجات حرارة الجهاز عند درجات الحرارة المحددة.

يجب اتباع إجراءات الصبغ بدقة شديدة كما هو موضح في النشرة المرفقة بالعبوة. وأخيرًا، يجب الاستعانة بفاحص خبير يقوم بقراءة دقيقة للشريحة. يعد هذا البروتوكول مفيدًا في اتخاذ القرارات العلاجية لعلاج إنتان الدم الناجم عن enterococcus.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.