عد الخلايا الجذعية العصبية البشرية
أغسطس 22, 2007
مطلوب معرفة العدد الدقيق للخلايا قابلة للحياة لكثير من التلاعب زراعة الأنسجة. هذا البروتوكول يصف كيفية التفريق بين الخلايا الحية والميتة وتحديد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. على الرغم من أنه يصف العد الجذعية العصبية البشرية / السلائف الخلايا (hNSPCs) ، ويمكن استخدامه لأنواع الخلايا الأخرى.
الآن سأوضح لكم كيفية حساب الخلايا السليفة العصبية البشرية وستقوم بحساب خلاياك عندما تريد وضعها في الكيمياء المناعية أو عندما تريد إجراء تعداء باستخدام آلة العامل النووي. أستخدم مقياس الخلوي الدموي المتباين الطور الذي يحتوي على شبكة حافة ونستخدم أيضا صبغة تسمى الرحلة والأزرق. والصبغة مفيدة لأنها يمكن أن تفرق بين الخلايا الحية والميتة.
تمتص الخلايا الميتة أو المحتضرة هذه الصبغة وتظهر باللون الأزرق. عندما تنظر إلى الخلايا الموجودة في الدم، فإن مقياس الخلايا الخلوية والخلايا الحية قادرة على استبعاد هذه الصبغة وهم لا يظهرون باللون الأزرق. وبهذه الطريقة يمكنك تحديد جدوى الخلايا الخاصة بك لإعداد حل رحلة والأزرق والوسائط.
سأضيف 20 ميكرولترا من المصيدة والمحلول الأزرق إلى أنبوب epi سعة 0.5 مل. ثم سأضيف 25 ميكرولترا من الوسائط. بهذه الطريقة لدي الآن 45 ميكرولترا من محلول المصيدة الأزرق والوسائط بحيث عندما أضيف خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية ، سأحصل على تخفيف من واحد إلى 10.
والآن سأضيف خمسة ميكرولترات من معلق الخلية. أولا سأتأكد من تعليق الخلايا جيدا عن طريق دوامة الأصابع. لذا أريد الآن التأكد من أن هذا الحل مختلط جيدا.
لذلك سأضع السرير لأعلى ولأسفل عدة مرات. وأخيرا سأقوم بتحميل حوالي 12 ميكرولترا من معلق الخلية هذا في مقياس الخلوي الدموي. يحتوي على منفذين ويمكنك استخدام أي منهما.
لذلك كل ما عليك فعله هو تقديم الحل في هذا المنفذ وسيتم امتصاص السائل من خلال عمل شعري. والآن أنا مستعد للعد. فيما يلي نظرة على مقياس الخلوي الدموي عند 10 x وهنا لدينا ربع يحتوي على 16 مربعا.
وكما ترون ، يمكننا أن نلاحظ هنا الخلايا الحية والميتة. هنا لدينا خلايا حية مثل هذه وهذه وهذه. ولدينا أيضا بعض الخلايا الميتة مثل هذه.
إذا لاحظت ، تظهر الخلية الميتة زرقاء داكنة ، في حين أن الخلايا الحية بها نوع من البرد حولها. لذا سأقوم الآن بحساب جميع الخلايا الحية. لذلك سأذهب من اليسار إلى اليمين ومن أعلى إلى أسفل.
1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 33 ، 1 32 ، 33 ، 34 ، 3 5 ، 3 6. إذن، لدينا ثلاث خلايا ستية في هذا الربع. لذلك عندما أرى الخلايا الموجودة على الخط الحدودي للربع ، مثل هذا الخط هنا ، لكي تكون متسقة ، أحسب الخلايا الموجودة على الحد الأيسر وعلى الحد العلوي.
وأنا أحسب باستمرار الخلايا على تلك الحدود لجميع الأرباع الموجودة على مقياس الخلوي الدموي. والآن سنحسب عدد الخلايا التي لدينا لكل ميكرولتر. وللقيام بذلك سآخذ متوسط الخلايا لكل رباع، وهو 38 واضربه في 10، وهو عامل تحدده أبعاد الحجرة.
وسنضرب أيضا في 10، وهو عامل التخفيف في هذه الحالة. وفي النهاية، سنحصل على عدد الخلايا لكل ميكرولتر. في هذه الحالة لدينا 3،800 خلية لكل ميكرولتر.
وبما أننا قمنا بتعليق منصة الخلية الخاصة بنا في 500 ميكرولتر من المحلول ، يمكنك حساب عدد الخلايا الإجمالية لديك. ونحن جميعا جاهزون.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لعد الخلايا الجذعية العصبية البشرية / السليفة (hNSPCs) باستخدام عداد الخلايا الدموية. يؤكد على أهمية التمييز بين الخلايا الحية والميتة لتطبيقات متنوعة في زراعة الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- زراعة الأنسجة
الخلفية
- عد الخلايا الحية أمر بالغ الأهمية لعمليات زراعة الأنسجة.
- يمكن للخلايا الحية استبعاد بعض الأصباغ، بينما لا تستطيع الخلايا الميتة ذلك.
- عداد الخلايا الدموية هو أداة قياسية لعد الخلايا.
- صبغة تريبّان الزرقاء تُستخدم عادةً لتقييم حيوية الخلية.
هدف الدراسة
- توفير طريقة موثوقة لعد الخلايا الجذعية العصبية البشرية.
- التمييز بين الخلايا الحية والميتة بشكل فعال.
- مساعدة الباحثين في التحضير لتجارب أخرى مثل المناعة الكيميائية أو التنقل الجيني.
الطرق المستخدمة
- استخدام عداد الخلايا الدموية ذو التباين الطور.
- استخدام صبغة تريبّان الزرقاء لتمييز حيوية الخلية.
- عد الخلايا تحت المجهر.
- تحضير محلول من صبغة تريبّان الزرقاء والوسط.
النتائج الرئيسية
- التمييز الناجح بين الخلايا الحية والميتة.
- التقدير الدقيق لخلايا الخلايا الجذعية العصبية البشرية.
- برهنة فعالية صبغة تريبّان الزرقاء.
- التحقق من صحة عداد الخلايا الدموية كطريقة موثوقة للعد.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول نهجًا مباشرًا لعد الخلايا.
- يمكن تطبيقه على أنواع خلوية مختلفة غير الخلايا الجذعية العصبية البشرية.
- فهم حيوية الخلية ضروري لنجاح تجارب زراعة الأنسجة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of viable human neural stem/precursor cells (hNSPCs) is essential for reproducible tissue culture workflows in neuroscience drug discovery. This protocol enables reliable cell viability assessment and concentration measurement, supporting consistent experimental seeding for downstream applications such as immunocytochemistry and transfection. By standardizing live/dead discrimination using Trypan blue and hemacytometer-based counting, the method enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise seeding of hNSPCs for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in cell-based assays by ensuring consistent input of viable cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, reproducible cell concentration data critical for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable preparation of cell suspensions for high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular input consistency across discovery-to-preclinical transition stages.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cell counting practices.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting reliable cell preparation from target validation through assay optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Ensures accurate cell dosing for target validation experiments involving hNSPCs.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable cell inputs necessary for reproducible assay performance.
- Analytics: Generates viable cell concentration and total count outputs used to normalize experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity in cell handling between in vitro discovery and preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a transferable, low-complexity capability applicable across multiple cell types and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by minimizing variability in cell-based experimental inputs.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and teams.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions through reliable assay foundations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by ensuring data quality in early efficacy screening.
Implementation Considerations
- Requires basic tissue culture technique and microscopy proficiency.
- Dependent on hemacytometer availability and proper cleaning to avoid contamination.
- Necessitates consistent operator training for unbiased quadrant selection and border-counting rules.
- Limited by manual counting throughput; not suited for high-throughput automation without adaptation.
- Relies on correct dilution and mixing to ensure representative sampling of cell suspension.
