يرتبط فخ كروموسوم لتحديد الحمض النووي تفاعلات طويلة المدى

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف وتحديد شركاء الحمض النووي المرتبطين بعيدي المدى. يتم تحقيق ذلك عن طريق التثبيت وتحلل الخلايا وهضم الحمض النووي بواسطة إنزيم التقييد الأول متبوعا بالربط لإنشاء حمض نووي خيميري يتكون من أجزاء من الجيلين المرتبطين. تتم إضافة الروابط التالية إلى الحمض النووي الخيمري بعد هضم التقييد الثاني لتسهيل تضخيمه ، يتم بعد ذلك تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات خاصة بالحمض النووي للرابط والطعم من أجل الحصول على كميات كافية من شظايا الحمض النووي المرتبطة بها ، ويتم الحصول على النتائج التي تظهر شركاء الحمض النووي المرتبطين بعيد المدى مع الحمض النووي للطعم بناء على تحليل تسلسل شظايا الحمض النووي المضخمة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التقاط تأكيد الكروموسوم أو ثلاثة C ، هي أنه يمكن استخدام A-C-T-S-A لتحديد شريك الحمض النووي المرتبط بعيد المدى بشكل فعال. في حين نشأت ثلاثة C للتحقق فقط من التفاعلات المشتبه بها سابقا. لبدء ثقافة البروتوكول هذه ، تم تزويد الخلايا البشرية في حاضنة ب 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى 80 إلى 90٪.

تستخدم خلايا سرطان الدم الحمضية البشرية لحفلة موسيقية في هذا العرض التوضيحي. اجمع الخلايا عن طريق سكبها في أنبوب NOC سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي بسرعة 1200 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط.

أضف خمسة ملليلتر من وسط الثقافة لإعادة تعليق كريات الخلية. بعد عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، خذ ما يقرب من 10 إلى الخلايا السابعة إلى حجم 40 ملليلتر مع RPMI 1640 ، وسط يحتوي على 10٪ FBS. ثم أضف 1.7 مل من 37٪ فورمالديهايد لإصلاح الكروماتين المخفف.

احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع رج لطيف. بعد الحضانة ، قم بإخماد التفاعل ب 2.4 مل من اثنين من الجلايسين المولاري. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 15 دقيقة عند 1200 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية.

بعد إزالة السوبر ناتين ، اغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام 40 مل من PBS المثلج البارد ثم قم بالطرد المركزي للعينة لاسترداد حبيبات الخلية المغسولة ، وأعد تعليق الحبيبات الناتجة في 40 مل من محلول تحلل الجليد البارد مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا و 0.1 مللي مولار PMSF يحتضن العينة في غرفة باردة مع دوران لمدة 90 دقيقة. أخيرا ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 2 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة وقم بإزالة السوبر ناتين والحصول على النوى المعزولة. أعد تعليق النوى في 0.5 مل من مخزن مؤقت XNEB واحد ثلاثة وأضف 15 ميكرولترا من 10٪ SDS.

احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع الرج. ثم أضف 45 ميكرولترا من 20٪ Triton X 100 لعزل SDS واحتضانه مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع الاهتزاز ونقل واحد في 10 إلى السادس. تستخدم النوى أو حوالي 15 ميكروغراما لهضم إنزيم تقييد 55 ميكرولترا من محلول النوى.

أضف 433 ميكرولترا من مخزن XNEB واحد ثلاثة و 12 ميكرولترا من BGL اثنين. لجعل حجم تفاعل الهضم الكلي 500 لتر ، احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بتعطيل إنزيم التقييد عن طريق إضافة 95 ميكرولتر من 10٪ SDS وتغيير طبيعة الإنزيم عن طريق التسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

في حمام مائي ، أضف سبعة ملليلتر من مخزن مؤقت ربط واحد و 360 ميكرولتر من 20٪ تريتون × 100. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اخفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية وأضف 50 ميكرولتر من 400 وحدة لكل ميكرولتر.

تي أربعة الحمض النووي Ligase. اسمح لتفاعل الربط بالحضانة عند 16 درجة مئوية لمدة أربع ساعات ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد اكتمال الربط ، أضف 300 ميكروغرام من البروتيناز K واحتضنه عند 65 درجة مئوية طوال الليل.

ثم أضف خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي الريبي واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تنقية الحمض النووي عن طريق استخراج الفينول الكلوروفورم وترسيب الحمض النووي في الأيزوبروبانول لإذابة الحمض النووي المترسب في 150 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. لإضافة روابط إلى الحمض النووي الخيمري ، قم أولا بهضم الحمض النووي عن طريق احتضان ميكروغرامين من الحمض النووي المنقى بخمس وحدات من MSP ، واحدة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى ست ساعات بعد الهضم ، وتعطيل MSP واحد عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم قم بترسيب الحمض النووي في الإيثانول بميكرولتر واحد من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر. يذوب الجليكوجين حنك الحمض النووي الناتج في 50 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. بعد ذلك ، امزج 50 ميكرولترا من MSP ، والحمض النووي المعالج مع ميكرولترين من قليل النوكليوتيد قليل النوكليوتيد 20 ميكرومولار L وميكرولتر واحد من 20 ميكرومولي قليل النوكليوتيد S ثم أضف ميكرولتر واحد من الماء المقطر المعقم وستة ميكرولترات من 10 XT أربعة DNA Ligase buffer.

غطي الخليط بالشمع السائل. قم بتغيير طبيعة قليل النوكليوتيدات عند 50 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة واتركها تبرد تدريجيا إلى 10 درجات مئوية في تدرج 0.5 درجة مئوية في الدقيقة. باستخدام جهاز تدوير حراري ، أضف ميكرولتر واحد من 400 وحدة لكل ميكرولتر T أربعة DNA ligase واحتضان التفاعل عند 15 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، قم بتنقية الحمض النووي المرتبط بالرابط باستخدام مجموعة تنقية سريعة من كايا PCR وقم بإزالتها في 50 ميكرولترا من الماء المقطر المعقم. اختر التمهيدي لمنطقة معينة من الحمض النووي ليتم فحصها بحثا عن تفاعلات بعيدة المدى. في هذا المثال ، سيتم استخدام هابيل كأساس أو طعم.

قم بإعداد الحمض النووي المنقى للجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال الجمع بين ميكرولتر واحد من الحمض النووي المنقى مع ميكرولتر واحد من 20 ميكرومولار قادر على أساس واحد محدد ، 46 56 ، وميكرولتر واحد من 20 ميكرومولار برايمر محدد 29 63. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من ثلاثة × ClinTech ، بوليميراز الحمض النووي كوكتيل واحد تم خلطه مسبقا مع 32 P-D-C-T-P وفقا للبروتوكول المكتوب ، متبوعا بثلاثة ميكرولترات من الماء المقطر المعقم. قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الدورة الحرارية لبدء التشغيل السريع PCR الموضحة في البروتوكول المكتوب بعد اكتمال دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

قم بتنقية منتجات PCR الجولة الأولى باستخدام مجموعة تنقية kaya Quick PCR Elute في 30 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. استخدم ميكرولتر واحد من أول منتج PCR مخفف 100 مرة لإجراء جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات متداخلة عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من 20 ميكرومولار قادر على أساس واحد محدد ، 46 26 ، وميكرولتر واحد من 20 ميكرومولار برايمر محدد للرابط. 29 61.

مرة أخرى ، أضف ثلاثة ميكرولترات من ثلاثة × ClinTech ، وبوليميراز الحمض النووي ، وكوكتيل واحد وثلاثة ميكرولترات من الماء المقطر المعقم. قم بتنفيذ الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام جدول دورة حراري مكون من 25 دورة بوزن 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية. 67 درجة مئوية لمدة 40 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، تليها امتداد عند 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

تصور منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تشغيل هلام صفحة اليوريا بنسبة 5٪ ثم مسح الشاشة المكشوفة في جهاز تصوير فوسفو. يمكن إعادة تدوير كل شريط PCR من الجل عن طريق إذابة شرائح الجل في أنبوب einor يحتوي على 60 ميكرولترا من الماء المقطر المعقم واحتضانه عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي. منتجات الجل الذائبة لفترة وجيزة عند 10 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان.

لجمع جميع العينات. قم بإزالة ميكرولتر واحد لاستخدامه كقالب DNA لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مع الإصلاح الرئيسي. 29 61 46 26.

باستخدام نفس الشروط كما هو موضح أعلاه ، يمكن إجراء تحليل التنقية والتسلسل بعد التنقية باستخدام أداة عبر الإنترنت لتحديد موقع الكروموسومات. بمجرد الوصول إلى موقع المعلوماتية الحيوية للجينوم ، انقر فوق blatt لإنشاء نافذة جديدة ولصق تسلسل الحمض النووي. بعد إرسال تسلسل الحمض النووي ، ستظهر نتائج بحث BLATT.

انقر فوق المتصفح على النتيجة بهوية 100٪ للكشف عن موقع تسلسل الحمض النووي. تم استخدام المنطقة القادرة كطعم لتحديد تفاعلات الحمض النووي بعيدة المدى. تم اختيار موقعين BGL وموقع BAM H واحد لمقايسة التصوير المقطعي المحوسب A في الجولة الثانية من مجموعة التمهيدي PCR ، تم استخدام 46 26 29 61 لتضخيم M1 46.30 29 61 للقدرة M اثنين و 46 ، 36 29 61 تم استخدامه ل M ثلاثة قادرين.

يكشف نمط الهلام النموذجي عن واحد إلى عدة نطاقات كما هو موضح هنا ل M1 القادر ، وقادر M اثنين ، وقادر على M ثلاثة هنا. يظهر تسلسل الحمض النووي للاستنساخ M1 لإثبات أن كل جزء من اختبار التصوير المقطعي المحوسب يتكون من جزأين مدمجين من الحمض النووي. جزء واحد مشتق من منطقة الحمض النووي للطعم بينما يأتي الجزء الثاني من الشريك المرتبط.

يتم ربط الأجزاء ببعضها البعض بواسطة تسلسل التعرف على إنزيم التقييد الأول. سيظهر تسلسل التعرف على الإنزيم الثاني في نهاية تسلسل الشريك المرتبط. يحتوي جزء M1 القادر على الاستنساخ على DNA من منطقة ABLE one الموجودة في الكروموسوم التاسع Q 32.4 ، ويقع الشريك المرتبط في الكروموسوم الثالث P ثلاثة ، والذي تم تحديده على أنه proc two.

وبالمثل ، تم توطين الشريك المرتبط ب M القادر على الكروموسوم الخامس Q 21.1 بينما تم تحديد استنساخ M three على أنه ارتباط داخل الكروموسومات بالقرب من موضع ABLE على عكس ثلاثة فحوصات C. ستحدد المنهجية الموضحة في هذا الفيديو التفاعلات طويلة المدى الأكثر انتشارا. ومع ذلك ، من خلال زيادة عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل R ، من الممكن تحديد ارتباطات إضافية أقل تواترا أيضا باستخدام منطقة البصمة والتحكم أو ICR في IGF اثنين من موضع H 19 كطعم للحمض النووي في خلايا الانفجار الليفي للفأر ، تم تطبيق برامج مختلفة لركوب الدراجات في الجولتين الأولى والثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل في اختبار التصوير المقطعي المحوسب.

يمكن أيضا استخدام اختبار التصوير المقطعي المحوسب لتحديد الاختلافات في الهندسة النووية والتفاعلات بعيدة المدى بين الخلايا الطبيعية والخلايا السرطانية. تم تجانس أنسجة القولون الطبيعية وأنسجة سرطان القولون وتم إجراء اختبار التصوير المقطعي المحوسب باتباع الإجراءات الموضحة هنا. يظهر هنا هيكل الحمض النووي لمنطقة ICR في IGF اثنين H 19 موضع و IGF اثنين من الجين dpn.

يتم تصنيف موقعين لمقايسة التصوير المقطعي المحوسب A على أساس البادئات المستخدمة في الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة أسهم وأرقام بألوان مختلفة. يمثل نمط الهلام لمقايسة التصوير المقطعي المحوسب A نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام التمهيدي 29 61 مع زوج التمهيدي 41 و 61 و 41 و 63 و 51 و 45 و 51 و 51 51. يتم تمييز العصابات الفريدة التي تظهر فقط في أنسجة القولون الطبيعية بأسهم صفراء ، وتلك العصابات التي ظهرت فقط في أنسجة سرطان القولون يتم تصنيفها بأسهم حمراء بعد تطورها.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السوق لاستكشاف العمارة النووية وتنظيم الجينات بطريقة ثلاثية الأبعاد.