Name: مما يدل على استخدامات مطياف الرواية قوة الجاذبية على التمدد وقياس البروتينات الليفية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: تعلم استخدام مطياف قوة الجاذبية لقياس القوى الجزيئية في علم الأحياء الفيزيائي والعصبي. يوضح هذا الفيديو خطوات التحضير والقياس بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

وتستند هذه المواد على العمل بدعم من مؤسسة العلوم الوطنية تحت رقم 0842736 المنحة.

<ol><li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li>
<li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li>
<li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li>
<li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin%27s+50+kDa+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li>
<li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+manipulating+individual+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+Physiol.+Meas%22%5BJournal%5D)">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li>
<li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments%3A+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li>
<li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li>
<li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li>
<li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li>
<li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

عند تحويل الفيلم إلى تمثيل thresholded رقميا ، من الأهمية بمكان بالنسبة لصورة thresholded للحفاظ على المنطقة نفسها في كل إطار من الفيديو. لأن الزوج في حبات الخرز التحرك بشكل مستقل عن بعضها البعض ، يمكن لأي انحراف في مجالات thresholded أيضا أن يسبب المسافات النسبية بين centroids من الخرز إلى الانحراف وإدخال خطأ كبيرا. السيطرة على المنطقة تخفيض عتبة الخطأ خمسة أضعاف في قياسات المسافة من 26 نانومتر إلى 5 نانومتر. فمن المهم أيضا للحصول على قياس دقيق لكل دائرة نصف قطرها الخرز والنسبة ب...

<table><tbody><tr><td>3-أمينو بروبيل ثلاثي إيثوكسي سيلان</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>أسيتون</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>بيريدين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-86-1</td><td></td></tr><tr><td>غلوتارالدهيد</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7776</td><td></td></tr><tr><td>جلايسين</td><td>Research Organics</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>تريس</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9682T</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>Amresco</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين المصل البقري (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMR-0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>التصوير المجهري بالمسح الضوئي (MSI)</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>نيتروسيليلوز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60443</td><td></td></tr><tr><td>إن-إن ثنائي ميثيل فورماميد</td><td>مستخلص من (Large New)</td><td>D4254</td><td></td></tr><tr><td>ميوزين II الهيكلي للأرانب</td><td>أرانب نيوزيلندية بيضاء (7-8)</td><td>لا يوجد نص متاح للترجمة. يرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في ترجمته.</td><td></td></tr><tr><td>الجسم المضاد MF30 (9-10)</td><td>بنك الهجين للدراسات التنموية</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>الجسم المضاد MF20 (6)</td><td>بنك الهجينوما</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مختبري</td><td>شمالي</td><td>WW57905M00</td><td></td></tr><tr><td>حامل استوائي</td><td>Celestron</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>كاميرا فيديو رقمية</td><td>شركة سوني (Sony Corporation)</td><td>XCDV60</td><td></td></tr><tr><td>تحرير الفرجار</td><td>كابيلاس</td><td>IA-415482</td><td></td></tr><tr><td>نابض ضغط</td><td>شركة جونز للنوابض (Jones Spring Co.)</td><td>723</td><td></td></tr><tr><td>زنبرك شد</td><td>شركة Jones Spring</td><td>770</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>المعاهد الوطنية للصحة</td><td>لا يوجد نص للترجمة.</td><td></td></tr><tr><td>برامج تشغيل Fire-i &amp;التطبيق </td><td>يونيبرين (Unibrain)</td><td>3.80</td><td></td></tr><tr><td>إكسل</td><td>Microsoft</td><td>لا يوجد نص مترجم.</td><td></td></tr></tbody></table>

مما يدل على استخدامات مطياف الرواية قوة الجاذبية على التمدد وقياس البروتينات الليفية

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

وقد أصبحت دراسة بنية الجزيئات الحاسمة أمام الكشف عن الآليات الجزيئية وظيفة. هناك العديد من bioinstruments محدودة ، ولكنها مهمة قادرة على الاعتماد على اختبار قوة من الميزات الهيكلية في البروتينات. وقد تم تحديد نطاق معلمة على مدى دقة يمكن للباحثين نظير في العالم ميكانيكية نانوية من الجزيئات ، مثل الأحماض النووية ، والانزيمات والبروتينات التي تؤدي المحركات إدامة الحياة عمل. يتم ضبطها جيدا قوة ذرية المجهر (AFM) لتحديد الهياكل الأصلية من البروتينات الليفية مع دقة المسافة على قدم المساواة مع المجهر الإلكتروني. ومع ذلك ، في الدراسات القوة فؤاد ، والقوات وعادة ما تكون أعلى بكثير من جزيء واحد قد تواجه 1 و 2. الفخاخ البصرية (OT) هي جيدة جدا في تحديد المسافة النسبية بين حبات المحاصرين ، ويمكن نقلها قوات صغيرة جدا 3. ومع ذلك ، فإنها لم تسفر أطوال المطلقة دقيقة من الجزيئات قيد الدراسة. المحاكاة الجزيئية تقديم معلومات داعمة لمثل هذه التجارب ، لكنها محدودة في القدرة على التعامل مع أحجام نفس الجزيئية كبيرة ، وأطر زمنية طويلة ، وإقناع بعض الباحثين في غياب الأدلة الداعمة الأخرى 2 و 4. قوة الجاذبية مطياف (GFS) يملأ مكانة حاسمة في ترسانة محقق من خلال تقديم مزيج فريد من قدراتهم. هذه الأداة هي قادرة على توليد قوى عادة مع 98 ٪ أو أفضل دقة من مجموعة إلى مجموعة femtonewton nanonewton. قياسات المسافة في الوقت الحاضر قادرة على حل طول المطلقة الجزيئية الى خمسة نانومتر ، والنسبية فصل الزوج حبة المسافات مع دقة مماثلة لاعتراض البصرية. أيضا ، يمكن أن تمتد أو تحديد GFS uncoiling حيث القوة بالقرب من التوازن ، أو توفير قوة متدرج لسيجمع ضد أية تغييرات هيكلية قياسه. فمن الممكن حتى لتحديد كيفية العديد من مخلفات الأحماض الأمينية ويشارك في فعاليات uncoiling تحت الأحمال القوة الفسيولوجية 2. خلافا لأساليب أخرى حيث هناك واسعة معايرة القوة التي يجب أن تسبق أي فحص ومعايرة GFS لا يتطلب مثل هذه القوة 5. من خلال استكمال نقاط القوة في أساليب أخرى ، فإن GFS سد الفجوات في فهم nanomechanics من البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى.

هذا هو خطوة خطوة دليل يبين الغرض ، والعملية ، والنتائج ممثل عن مطياف قوة الجاذبية الرواية.

لقد أصبحت دراسة البنية الجزيئية الكبيرة أمراً بالغ الأهمية لتوضيح الآليات والوظائف الجزيئية. هناك العديد من الطرق المحدودة، ولكن...

تتكون مواصفات قوة الجاذبية من قاعدة تثبيت علوية، ومجهر ضوئي عادي، وكاميرا رقمية، وجهاز كمبيوتر. ونستخدم هذا النظام لإجراء تحليل الجزيء الواحد. حيث يمكننا تسجيل توازن القوة أو توفير قوة متدرجة عن طريق التنقيط.للبدء، نحتاج إلى تحضير شريحة زجاجية دقيقة حتى يمكن إتمام هذا النوع من العمليات. لقياس حوالي 10 milligrams من الحبوب التي ستُستخدم، أقوم عادةً بتحضير 2K. لدينا هنا خمسة milliliters من مادة سنقوم بإجراء three triology بها.هنا سنقوم بتجهيز الأنبوب النهائي الأول. قم بخلط المزيج جيداً باستخدام الماصة، ثم انقل 2 mL من المزيج فوق حبيبات الـ bead cake. اترك حبيبات الـ bead cakes لمدة دقيقتين، ثم قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس (vortex) جيداً لمدة دقيقتين.أكل الأسفل الاثنين المبللين. تريد بيورين واحد في ماء مقطر مرتين. ربط عند pH 6.لذا، قم ببساطة بإضافة 5 mL من محلول الربط المنظم (coupling buffer) إلى كل خرزة، حيث يجعل هذا الربط الخرزات قابلة للالتصاق. بعد ذلك، يتم ربط الأجسام المضادة، ثم يتم الرج باستخدام جهاز الفورتكس (vortex) لمدة دقيقة واحدة. قم بتثبيتها لمدة خمس دقائق، وإذا كان المحلول المجمد عالي التركيز، فستقوم بتخفيفه من أي تركيز كان إلى 5% باستخدام محلول الربط المنظم.بعد ذلك، خذ 2 mL من هذا المحلول وأضفه، مما سيسمح لـ TER بالاقتران مع النهايات الموجودة بالفعل على جهاز الفورتكس

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

واستخدمت تقنيات الفحص المجهري ومعالجة الصور الفاصلة زمنيا لمراقبة وتحليل ضغط هلامي بوساطة الخلايا الليفية وإعادة تنظيم ألياف الفيبرين في مفاعل حيوي خاضع للرقابة البيئية على مدى فترة 48 ساعة.

مراقبة وقياس حجم فيبرين جل ضغط الخلايا الليفية بوساطة

&lt; p class = "jove_content" &gt; السليلوزومات عبارة عن مجمعات متعددة الإنزيمات مصممة لهضم السليلوز. تم استخدام SMFS المستند إلى AFM لدراسة الخواص الميكانيكية والتكوين القابل للطي لتجميعات البروتين المرتبطة بالسليلوزوم. نقدم سير عمل كامل لتثبيت البروتين ، والحصول على البيانات ، وتحليل البيانات لدراسة تفاعلات مجمعات المستقبلات الفردية المشاركة في تجميع السليلوزوم.

التحقيق في أنظمة مستقبلات الترابط في السليلوسوم باستخدام التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد القائم على AFM

نقدم في هذه المقالة منصة تمتد الرواية التي يمكن استخدامها لتحقيق استجابات خلية واحدة إلى مجمع متباين الخواص الميكانيكية تشوه ذو محورين وتحديد الخواص الميكانيكية للالأنسجة البيولوجية.

A منصة رواية تمتد للتطبيقات في الخلايا والأنسجة Mechanobiology

تحليل خصائص مقلص من البشرة كيميائيا، أو permeabilized، ألياف العضلات الهيكلية يوفر وسيلة قوية يمكن من خلالها تقييم وظيفة العضلات على مستوى الخلية عضلة واحدة. في هذه المادة ونحن الخطوط العريضة لتقنية صحيحة وموثوقة لإعداد واختبار permeabilized ألياف العضلات الهيكلية في المختبر.

قياس أقصى قوة متساوي القياس منشأ بواسطة ألياف العضلات Permeabilized الهيكل العظمي

نقدم بروتوكولا لتطبيق التحليل الطيفي لتشتت ضوء بريلوين على ألياف الكولاجين من النوع الأول المنقاة بالإيلاستين والتربسين للمصفوفة خارج الخلية لاستخراج خصائصها المرنة الكاملة.

إعداد ألياف البروتين خارج الخلية مصفوفة لBrillouin الطيفي

تم مؤخرا تطوير عدد من أجهزة الاستشعار الحيوية للقوة القائمة على FRET ، مما يتيح الدقة الخاصة بالبروتين للقوة داخل الخلايا. في هذا البروتوكول ، نوضح كيف يمكن استخدام أحد هذه المستشعرات ، المصمم لرابط البروتين المركب Nesprin-2G للهيكل النووي والهيكل الخلوي (LINC) لقياس قوى actomyosin على مركب LINC النووي.

بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

نحن وصف إجراءات مفصلة واستراتيجيات لقياس الخواص الميكانيكية والميكانيكية مسارات تتكشف من الجزيئات البروتينية مفرد باستخدام مجهر قوة ذرية. ونحن أيضا إظهار نتائج الممثل كمرجع للتحديد وتبرير لتسجيلات جزيء بروتين واحد جيد.

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

يصف هذا البروتوكول تجميد التساهمية من البروتينات مع سيلاني هيتيروبيفونكشونال اقتران وكيل للأسطح أكسيد السيليكون مصممة للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد مجهرية على أساس القوة الذرية الذي يتجلى تفاعل ررجا (تلميح الهياكل-1 أدهيسين من الرئوية س) مع فيبرونيكتين.

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

هنا، فإننا نقدم بروتوكول للاستخدام المتزامن لصدى فورستر الطاقة التوتر القائم على نقل أجهزة استشعار لقياس البروتين الأسفار وتحميل الانتعاش بعد فوتوبليتشينج لقياس ديناميات البروتين مما يتيح قياس حساسة للقوة ديناميات البروتين داخل الخلايا الحية.

قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت

التحليل الطيفي لقوة المجموعة (EFS) هو تقنية قوية للتكشف الميكانيكي والاستشعار في الوقت الفعلي لمجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية في المجالات الفيزيائية الحيوية والاستشعار الحيوي.

التحليل الطيفي لقوة المجموعة بواسطة قوى القص

تعلم استخدام مطياف قوة الجاذبية لقياس القوى الجزيئية في علم الأحياء الفيزيائي والعصبي. يوضح هذا الفيديو خطوات التحضير والقياس بدقة عالية.

مما يدل على استخدامات مطياف الرواية قوة الجاذبية على التمدد وقياس البروتينات الليفية

استكشف المزيد من الفيديوهات