Name: التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: تعلم تصوير أجنة C. elegans الحية باستخدام مجهر DIC والفلورسنت مع برمجيات مفتوحة المصدر. يوضح البروتوكول إعداد العينات ومعايرة البصريات لدراسة الديناميكيات الخلوية أثناء التطور المبكر.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بدعم الصناديق المؤسسية الداخلية والبيولوجي برنامج علماء العلوم في جامعة ميشيغان هذا العمل.

<ol><li>Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+a+stable+cohesin-chromatin+interaction+after+but+not+before+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication.</a> Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).</li>
<li>Nabeshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast%3A+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li>
<li>Heuvel, S. vanden <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle regulation.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li>
<li>Gonczy, P., Rose, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+cell+division+and+axis+formation+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Asymmetric cell division and axis formation in the embryo.</a> WormBook. , 1-20 (2005).</li>
<li>Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in C. elegans.</a> WormBook. , 1-13 (2005).</li>
<li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+temperature-sensitive+cell-division+mutants+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 149, 1303-1321 (1998).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans+%5Bsee+comments%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments].</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+by+chemical+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 17, 119-121 (1997).</li>
<li>Liu, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+Caenorhabditis+elegans+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants.</a> Genome Res. 9, 859-867 (1999).</li>
<li>Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NemaGENETAG+initiative%3A+large+scale+transposon+insertion+gene-tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetica. 137, 39-46 (2009).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+analysis+of+genes+expressed+in+the+ovary+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).</li>
<li>Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408, 331-336 (2000).</li>
<li>Sonnichsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-genome+RNAi+profiling+of+early+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 434, 462-469 (2005).</li>
<li>Mohler, W. A., Isaacson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Bembenek, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+granule+exocytosis+in+C.+elegans+is+regulated+by+cell+cycle+components+including+separase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase.</a> Development. 134, 3837-3848 (2007).</li>
<li>Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+actin+cytoskeleton+and+homotypic+membrane+fusion+in+ER+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).</li>
<li>Bianchi, L., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+C.+elegans+cells+for+electrophysiological+and+pharmacological+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses.</a> WormBook. , 1-15 (2006).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وهناك اعتبار رئيسي للتصوير مرور الزمن يعيش هو الحفاظ على سلامتها وسلامة الخلية والكائن في. دبي انترناشيونال كابيتال المجهري يوفر الفوائد التي لم يتم كشفها نموذج للأشعة فوق البنفسجية والحرارة المفرطة من مصدر الإضاءة. هي مناسبة تماما للكشف المجهري DIC الهجرة الخلية ويتغير شكل الخلية مثل الحرائك الخلوية والتعرف على بعض الهياكل التحت خلوية ، مثل مغزل الإنقسامية والغشاء النووي. التصوير مضان من البروتينات مراسل يكمل المجهري مدينة دبي للإنترنت عن طريق تحديد الأجزاء التحت خلوية إضافية والسماح التصور للبروتينات محددة. للتخفيف من أخطار وأضرار الضيائية إلى الجنين أثناء التصوير مضان ، ونحن عادة زيادة الربح من الكاميرا الرقمية للتعويض عن انخفاض كثافة الأشعة فوق البنفسجية ومدة الإضاءة. خافت المعدلة وراثيا للصحفيين الفلورسنت ، خوارزميات deconvolution إلى إعادة تعيين من خارج تركيز الضوء أو deblurring خوارزميات للحد من الخلفية يمكن تحسين جودة الصور الملتقطة. بينما المجاهر المتقدمة مثل نظم مبائر multiphoton أو في بعض الأحيان ضرورية ، وجدنا أنه يمكن للصحفيين الفلورسنت تصوير العديد من استخدام هذا الإعداد epifluorescent المجهر ، مما أسفر عن صور ذات جودة عالية. مدير الدقيقة (http://www.micro-manager.org) ، بالإضافة إلى كونها مجانية ، يحفظ الملفات مباشرة إلى تنسيق TIFF بدلا من تنسيقات الملفات الشخصية لكثير من حزم البرامج التجارية. هذا يبسط كثيرا من تحليلات البيانات المتوفرة لدينا من خلال القضاء على خطوة تحويل ملف اللازمة لقراءة ملفات الصور في ImageJ ، فوتوشوب وغيرها من برامج تحرير الصور.

اوليمبوس BX61 المجهر مع الكاميرا أوكرا - ER هاماماتسو. 10X فلوريت خطة (NA 0.3) وPlanAchromat 60x (NA 1.35) هدف العدسات مدير الدقيقة 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) صورة J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarose -- البيولوجيا الجزيئية / هلام الصف الكهربائي مجهر شرائح الصيادين Superfrost / بلاس (كتالوج # 12-550-15) مختبر الشريط (دليل فيشر # 15-901 السلسلة) 18 ملم x 18 ملم 1.5 # Coverslips M9 (242 ملي KH 2 ص 4 ، 40 مم نا 2 هبو 4 ، 9 ملم ز كلوريد الصوديوم ، و 19 ملي NH 4 الكلورين MgSO 4) (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). البيض العازلة (118 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 48 ملي بوكل ، CaCl 2 مم 2 ، 2 مم MgCl 2 و 25 HEPES ملم ، ودرجة الحموضة 7.3) 25. فازلين فرشاة / عصا شفرات حلاقة حرارة كتلة تشريح المجهر الديدان 22 سلك البلاتين اختيار 22 27G1 / 2 دقيقة الإنزلاق الإبرة (بيكتون ديكنسون) أو مشرط صغير بشفرة

التصوير c. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

العمليات الخلوية ، مثل العزل الصبغي ، والتجمع ، والحرائك الخلوية ، هي بطبيعتها ديناميكية. الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الحية ، وذلك باستخدام البروتينات الفلورية المسمى الصحفي أو الفرق المقابل تدخل (DIC) المجهري ، ويسمح لدراسة تطور الزمني لهذه الأحداث الديناميكية التي هي على خلاف ذلك يستدل من تحليل عينات 1،2 الثابتة. وعلاوة على ذلك ، ودراسة لوائح التنموية يتطلب إجراء العمليات الخلوية الوقت الفاصل بين التجارب على كائن حي سليمة خلال التنمية. الجنين ايليجانس Caenorhabiditis خفيفة وشفافة لها ، ثابتة السريع البرنامج الإنمائي مع خلية معروفة النسب 3 ، مما يوفر تجربة نموذج مثالي لدراسة المسائل في بيولوجيا الخلية والتنمية 4،5 6-9. جيم ايليجانس هو قابلة للتعديل الوراثي للتلاعب من قبل الوراثة إلى الأمام (على أساس الطفرات العشوائية 10،11) ، وعلم الوراثة العكسية لاستهداف جينات معينة (على أساس رني بوساطة التدخل واستهدفت الطفرات 12-15). بالإضافة ، يمكن بسهولة خلق حيوانات معدلة وراثيا في التعبير عن بروتينات أو الموسومة fluorescently صحفيين 16،17. هذه الصفات مجتمعة تجعل من السهل التعرف على المسارات الجينية التي تنظم العمليات الخلوية الأساسية والتنموية في الجسم الحي 18-21. في هذا البروتوكول نقدم أساليب التصوير المباشر لجيم ايليجانس أجنة باستخدام البصريات DIC أو مضان GFP على مجهر epifluorescent المجمع. نبدي السهولة التي يمكن أيضا المجاهر متاحة بسهولة ، وتستخدم عادة لتصوير نموذج ثابت ، تطبق على الوقت الفاصل بين التحليل باستخدام برمجيات المصدر المفتوح لأتمتة عملية التصوير.

و<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الجنين هو نظام قوي لدراسة بيولوجيا الخلايا والتنمية. نقدم بروتوكولا للتصوير حي ل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام أجنة البصريات مدينة دبي للإنترنت أو استخدام مضان المجاهر epifluorescent متاحة بسهولة والبرمجيات مفتوحة المصدر.

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

تتسم العمليات الخلوية، مثل تجميع الكروموسومات وفصلها وانقسام السيتوبلازم، بديناميكية متأصلة. ويسمح التصوير بالفاصل الزمني للخلايا الحية، باستخدام...

يوضح هذا البروتوكول كيفية تصوير الأحداث الديناميكية في أجنة *C. elegans* المبكرة باستخدام بصريات Norky DIC أو الفلورسنس، وذلك عن طريق الاستعانة بمجاهر متوفرة على نطاق واسع وبرمجيات مفتوحة المصدر. يبدأ البروتوكول بشرح كيفية تشريح أجنة *C. elegans* وتثبيتها للتصوير. بعد ذلك، يتم مراجعة الإعداد الصحيح لبصريات DIC nor masky لضمان الحصول على صور مثالية بأعلى درجة من التفاصيل.تتم أيضاً مراجعة معايرة الإضاءة والمجهر الفلوري العكسي واسع المجال لجمع بيانات صور فلورية جيدة بالتعاون مع برمجيات مفتوحة المصدر. يمكن للمجهرية الجيدة تصور الديناميكيات الخلوية في جنين نامٍ. وتعد التوضيحات المرئية لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن إعداد D iic Optics بشكل صحيح يعد أمراً صعباً نظراً لأن المصطلحات قد تكون مربكة والتقنية الصحيحة يصعب وصفها كتابياً.بالإضافة إلى ذلك، يجب على الباحثين توخي الحذر لتقليل التعرض للضوء عند إجراء التصوير الفلوري. ومن أجل الحد من السُميّة الضوئية والبهتان الضوئي، ولتحضير الأجنة للتصوير، قم أولاً بإعداد محلولين للتثبيت؛ أحدهما هو الفازلين المذاب، والآخر هو محلول agar بنسبة 2 إلى 3% في محلول منظم.يمكن تحضير أغاروز (arose) أكثر كثافة إذا كانت البنى المراد تصويرها هشة للغاية، مع الحرص على تجنب الغليان. يتم صهر كلا المحلولين المخزنين في الميكروويف ثم تخزينهما في صورة حصص مقدار كل منها من 4 إلى 5 مل. في يوم التصوير، يتم صهر حصة من محلول الفازلين في كتلة تسخين بدرجة حرارة 65 إلى 70 درجة Celsius وصهر حصة واحدة من محلول أغاروز في الميكروويف.مرة أخرى، يجب تجنب الغليان. ثم وللحفاظ على هذه المحاليل في حالة صهر، تُحفظ في كتلة تسخين. بعد ذلك، قم بتغطية الجزء العلوي والسفلي من شريحتين بزناق من شريط لاصق مختبري، ثم ضع شريحة نظيفة بين الشريحتين الملتصقتين.الآن، قم بوضع بضع قطرات من مادة Aros المصهورة باستخدام الماصة على شريحة نظيفة، ثم غطّها بشريحة نظيفة أخرى. ستنتشر مادة Aros لتشكل وسادة مربعة رقيقة، وبذلك تصبح وسادة الديدان جاهزة. استخدم مجهر تشريح وملقطاً من سلك البلاتين لنقل ديدان بالغة عددها اثنان إلى قطرة من المحلول المنظم بحجم 9 إلى 12 µL على غطاء شريحة مقاس 18 × 18 mm.ثم قم بالقص. افتح الديدان باستخدام إبرة أو مشرط لتحرير الأجنة مع جعل جهة الآجار للأسفل. ضع وسادة الديدان فوق غطاء شريحة مقاس 18 في 18 مليمتر واستخدم الشفرة لإزالة أي زوائد من الآجار.أخيرًا، لختم شريحة الغطاء، ضع محلول الفازلين المصهور على طول محيطها باستخدام فرشاة رسم أو عود أسنان. الخلايا الآن جاهزة للتصوير. عند وضع الشريحة على المجهر، تأكد من محاذاة المستقطبين بشكل متعامد مع بعضهما البعض.تأكد من أن كلًا من الحواجز والمنشورات خارج مسار الضوء. إذا لم يكن المجال مظلمًا، فقم بتدوير المستقطب الموجود أسفل المكثف حتى يصبح مظلمًا. حدد موقع الأجنة باستخدام الشيئية بقوة تكبير 10 مرات.ابحث بالقرب من أجسام الديدان عن مجموعات من الأجنة الصغيرة للحصول على عدة أجنة ضمن مجال التصوير. وتجنب الأجنة الموجودة داخل الدودة للحصول على أفضل الصور. وبمجرد تحديد موقع أفضل الأجنة، انتقل إلى عدسة شيئية ذات قوة تكبير أعلى.الآن قم بتحويل مكعب المرشح إلى وضع تباين التداخل التفاضلي (DIC). بعد ذلك، أدخل منشور والستون العلوي للعدسة الشيئية في مسار الضوء، وأدر القرص الموجود في المكثف لاختيار منشور والستون السفلي الذي يتوافق مع العدسة الشيئية. بعد وضع المنشورات في مكانها، اضبط المنزلق الموجود أسفل هذا البرج ليتناسب مع الفتحة العددية للعدسة.للحصول على إضاءة كولر المثالية، قم بتركيز المكثف حتى تظهر حافة حجاب المكثف بأقصى درجة من الوضوح. والوضوح الأقصى هو عندما تكون الحدود بين الضوء والسواد أكثر حدة أو دقة في التركيز. وللحصول على تباين مثالي، قم بضبط جدار التفاحة والمنشور عن طريق تدوير المقبض الموجود على المنزلق.أصبح المجهر الآن جاهزاً للاستخدام تقريباً. حان الوقت للتحكم في بارامترات التصوير الإضافية على الكمبيوتر باستخدام برنامج micro-manager والبرمجيات مفتوحة المصدر. ابدأ بضبط كسب الكاميرا (camera gain) على صفر.بعد ذلك، قم بتغيير إعدادات حفظ الملفات لتكون بتنسيق TIFF بـ 8 بت بدلاً من 16 بت. يمكن لاحقاً تحليل ملفات TIFF باستخدام برامج مفتوحة المصدر مثل Image J. بعد ذلك، اضبط مستوى الإضاءة بحيث تكون أسطع البكسلات أقل بقليل من مستويات التشبع. إذا تم تنفيذ كل شيء بشكل صحيح، ستبدو الصورة ثلاثية الأبعاد مع ظهور الضوء وكأنه يسقط بزاوية مائلة.بعد أن تصبح الصورة واضحة تماماً، اختر الأجنة التي ترغب في تصويرها وقم برسم منطقة الاهتمام. إذا كان المجهر مزوداً بمحرك تركيز، فاستخدمه لجمع مستويات بؤرية متعددة عند كل نقطة زمنية. افتح نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد وقم بتحديد المستوى العلوي والسفلي لمجموعة Z stack عن طريق ضبط مقبض التركيز للعثور على أول وآخر مستوى بؤري تظهر فيه بعض حبيبات المح،قم بتحديد حجم الخطوة. سيحدد هذا عدد المستويات البؤرية التي سيتم جمعها. الآن، قم بتحديد فاصل زمني يكون طويلاً بما يكفي لاقتناء جميع المستويات البؤرية.يمكن ضبط النقاط الزمنية القصوى لتكون عالية جداً بحيث يستمر البرنامج في التقاط الصور حتى يتم إيقافه يدوياً. اضبط البرنامج لعرض الصورة الأخيرة التي تم التقاطها فقط بحيث يمكن مراقبة العملية. الآن قم بتسمية ملفات الصور وابدأ في عملية التقاط الصور.ستتم مراجعة تحليل الصور بإيجاز في نهاية القسم التالي. إن إنشاء مقطع فيديو لبروتين GFP يشبه إلى حد كبير عمل أربعة مقاطع DIC لـ D nor Musky، ولكن يتم استخدام ملف تكوين يتضمن تحكماً برمجياً في التشتت الفلوري. بدلاً من ذلك، وبعد تحديد موقع الأجنة، تأكد من أن منشور walstone العلوي ليس في مسار الضوء وقم بتحويل مكعب المرشح إلى F-I-T-C-G-F-P.إذا لم يتم ضبط هذا الإعداد تلقائياً عند بدء التشغيل باستخدام البرنامج، فتأكد من ضبط كسب الكاميرا (camera gain) على 255. يتم تعيين ملف الصورة بتنسيق tiff 16 bit. الآن، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء النافذ وانقر على التصوير المباشر (live imaging).اضبط شدة مصدر ضوء UV ووقت التعرض لتحقيق نسبة إشارة إلى ضجيج جيدة لإشارة الفلوريسنس، ومع ذلك، حافظ على أقل قدر من التعرض للضوء للحفاظ على الخلايا. بعد ذلك، قم بتحديد الفاصل الزمني. حدد عدد النقاط الزمنية وعدد المستويات البؤرية، ثم ابدأ في عملية الحصول على الصور كما تم وصفها سابقاً.لتحليل مقاطع الفيديو، استخدم برنامجاً مفتوح المصدر؛ برنامج Image J مع تثبيت ملحق micromanager. كما يمكن استيراد مقاطع الفيديو الكبيرة جداً إلى Image J باستخدام ملحق loci. يظهر هنا جنين من النوع البري (wild type) تم تصويره باستخدام nor masky، وبصريات DIC.الجهة الخلفية تقع في أسفل اليمين، والجهة البطنية تقع في أسفل اليسار. يعرض المقطع تسلسلاً من الصور ذات المستوى البؤري الواحد التي تم جمعها كل 15 ثانية. تم ضبط التشغيل على 14 إطاراً في الثانية.يعبر هذا الجنين عن الفلورة أثناء الانقسام الجنيني الأول، حيث يقع الطرف الخلفي هنا في الأعلى وإلى اليمين. يعرض هذا المقطع التغييرات في مستوى بؤري واحد كل 10 ثوانٍ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير الأجنة الحية باستخدام كل من بصريات DIC Naski والفلورة فوق المجهرية (epi fluorescence) لدراسة الأحداث الديناميكية.نأمل أن يكون لديكم فهم أفضل لكيفية إعداد بصريات DIC Nomar للحصول على صور مثالية، وأن تدركوا أنه يمكنكم الحصول على بيانات فلورية عالية الجودة باستخدام إضاءة الفلورية فوق البؤرية (epi fluorescence)، وأنكم لستم معتمدين دائمًا على المجاهر الأكثر تقدمًا. كما يمكنكم تطبيق تقنيات التصوير هذه لفحص الأجنة التي تفتقر إلى وظيفة جين معين، وذلك لمزيد من الاستقصاء حول المتطلبات الجينية لأحداثكم المفضلة أثناء انقسام الخلايا أو نموها.

imaging-c-elegans-embryos-using-an-epifluorescent-microscope-open

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

توضح هذه المقالة تقنية لتصور الأحداث المبكرة من التطور الجنيني في...

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

وفرة من المستقبلات العصبية تتجمع في نقاط الاشتباك العصبي تؤثر تأثيرا قويا قوة متشابك. هذا الأسلوب الكمي المستقبلات العصبية fluorescently المسمى في ثلاثة أبعاد مع قرار واحد في...

الآلي الكمي من الإسفار متشابك في<em&gt; C. ايليجانس</em

يصف هذا البروتوكول كيفية تقسيم الصورة الخلايا داخل الأنسجة في انواع معينة ايليجانس الأجنة. بينما العديد من البروتوكولات تصف كيفية انقسام الخلايا في صورة الجنين في وقت مبكر، ويصف هذا البروتوكول كيفية صورة انقسام الخلايا داخل الأنسجة النامية خلال منتصف أواخر مرحلة التطور الجنيني.

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

يصف هذا البروتوكول الإعداد المجهر رقة الضوء وتنفيذها لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة.

إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل<em&gt; في توتو</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; التنمية

أصبح تصوير التشكل للأجنة الحشرات مع ضوء على أساس ورقة مضان المجهر الدولة من الفن. ويحدد هذا البروتوكول ويقارن ثلاث تقنيات التركيب المناسبة للأجنة خنفساء الدقيق الحمراء، ويدخل اثنين من رواية خطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب مناسبة تماما لتصوير العيش، ويناقش ضوابط الجودة الأساسية ويشير إلى القيود التجريبية الحالية.

مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة<em&gt; خنفساء الدقيق الحمراء</em&gt; الأجنة

هنا ، نقدم نهج التوافقية باستخدام المجهر عاليه الدقة ، والاداات الحسابية ، ووضع العلامات خليه واحده في الاجنه c. ايليجنس المعيشة لفهم ديناميات خليه واحده اثناء النمو العصبي.

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد وتركيب أجنة Caenorhabditis elegans ، وتسجيل التطور تحت مجهر 4D وتتبع سلالة الخلايا.

4D المجهري: كشف Caenorhabditis elegans التطور الجنيني باستخدام المجهر نومارسكي

وقد تم تقديم بروتوكول لتصوير microtubules الحيوية في الجسم الحي باستخدام البروتين ملزمة نهاية المسمى fluorescently. وصفنا أساليب لتسمية, صورة, وتحليل microtubules الحيوية في الخلايا العصبية الميكروتبول الجانبي الخلفي (PLM) من C. elegans.

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

يصف هذا البروتوكول التصوير بفاصل زمني قائم على الموائع الدقيقة C. ايليجانس عبر تطور ما بعد الجنين بأكمله.

تصوير C. ايليجانس عالي الدقة عبر جميع مراحل اليرقات

نقدم هنا إرشادات حول الاستخدام الفعال ل SegElegans ، وهو نظام تعلم عميق طورناه للتجزئة التلقائية للديدان الفردية في صور الفحص المجهري واسع المجال ، للاستخدام اللاحق في برامج تحليل الصور مثل ImageJ. نحن نقدم طرقا لاستخدام النظام عبر الإنترنت وغير متصل.

التحليل الآلي لصور التألق C. elegans باستخدام SegElegans

تعلم تصوير أجنة C. elegans الحية باستخدام مجهر DIC والفلورسنت مع برمجيات مفتوحة المصدر. يوضح البروتوكول إعداد العينات ومعايرة البصريات لدراسة الديناميكيات الخلوية أثناء التطور المبكر.

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

استكشف المزيد من الفيديوهات