التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

يوضح هذا البروتوكول كيفية تصوير الأحداث الديناميكية في أجنة CL egan المبكرة باستخدام بصريات Norky DIC أو التألق من خلال الاستفادة من المجاهر المتاحة على نطاق واسع والبرامج مفتوحة المصدر. يبدأ البروتوكول بوصف كيفية تشريح أجنة CL gans وتركيبها للتصوير. ثم تتم مراجعة الإعداد الصحيح ل DIC أو البصريات المقنعة لضمان الصور المثلى بأعلى التفاصيل.

تتم أيضا مراجعة معايرة فلورسنت epi والإضاءة واسعة المجال لجمع بيانات صور الفلورسنت الجيدة جنبا إلى جنب مع البرامج مفتوحة المصدر. يمكن للفحص المجهري الجيد أن يتصور الديناميكيات الخلوية في الجنين النامي. تعد الرسوم التوضيحية المرئية لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن إعداد D iic Optics بشكل صحيح أمر صعب لأن المصطلحات يمكن أن تكون مربكة ويصعب وصف التقنية المناسبة في شكل مكتوب.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب على الباحثين توخي الحذر لتقليل التعرض للضوء عند إجراء التصوير الفلوري. من أجل الحد من السمية الضوئية والتبييض الضوئي لإعداد الأجنة للتصوير ، أولا ، قم بعمل حلين متصاعدين. أحدهما عبارة عن فازلين ذائب والآخر من اثنين إلى 3٪ من المخزن المؤقت

يمكن عمل أروس أكثر كثافة إذا كانت الهياكل المراد تصويرها هشة للغاية ، مع الحرص على تجنب الغليان. يتم إذابة كلا المحاليل في الميكروويف ثم تخزينها على شكل أربعة إلى خمسة ملليلتر. في يوم التصوير ، قم بإذابة كمية من محلول الفازلين في كتلة حرارية من 65 إلى 70 درجة مئوية وإذابة قطعة واحدة من المحلول المنشأ في الميكروويف.

مرة أخرى ، تجنب الغليان. ثم للحفاظ على هذه المحاليل منصهرة ، قم بتخزينها في كتلة حرارية. بعد ذلك ، قم بتغطية الجزء العلوي والسفلي من شريحتين بشريط من شريط المختبر وقم بوضع شريحة نظيفة بين الشريحتين المسجلتين.

الآن ضع بضع قطرات من الآروس المنصهرة على الشريحة النظيفة وقم بتغطيتها بشريحة نظيفة أخرى. ينتشر Aros في وسادة مربعة رفيعة مع تحضير وسادة الدودة. استخدم منظار تشريح واختيار سلك بلاتيني لنقل ديدتين بالغتين إلى قطرة من المخزن المؤقت من تسعة إلى 12 ميكرولتر على زلة غطاء مقاس 18 × 18 ملم.

ثم قطع. افتح الديدان بإبرة أو مشرط لتحرير الأجنة مع وضع جانب الأجارو لأسفل. ضع الوسادة الدودية على زلة الغطاء مقاس 18 × 18 ملم وقم بشفرة أي أجار متدلية.

أخيرا ، لإغلاق زلة الغطاء ، ضع محلول الفازلين المنصهر على طول محيطه بفرشاة طلاء أو عود أسنان. الخلايا جاهزة الآن للتصوير. عند وضع الشريحة على المجهر ، تأكد من محاذاة المستقطبين بشكل عمودي مع بعضهما البعض.

تأكد من أن كلا من الجدران والمنشورات خارج مسار الضوء. إذا لم يكن الحقل مظلما ، فقم بتدوير المستقطب أسفل المكثف حتى يصبح الآن. أوجد الأجنة باستخدام الهدف 10 مرات.

انظر بالقرب من أجسام الديدان بحثا عن مجموعات من الأجنة الصغيرة من أجل الحصول على أجنة متعددة داخل مجال التصوير. تجنب الأجنة داخل الدودة للحصول على أفضل الصور. مع وجود أفضل الأجنة ، قم بالتبديل إلى هدف قوة أعلى.

الآن قم بتبديل مكعب المرشح إلى DIC. بعد ذلك ، أدخل منشور حجر الحجر العلوي في مسار الضوء وقم بتدوير التورتة على المكثف لتحديد منشور حجر الولب السفلي الذي يطابق الهدف. مع وضع المنشورات في مكانها، اضبط شريط التمرير الموجود أسفل هذا البرج ليتناسب مع فتحة العدسة العددية للعدسة.

للحصول على إضاءة Kohler المثلى ، ركز على المكثف حتى تظهر حافة الحجاب الحاجز المكثف بشكل أكثر وضوحا. الأكثر وضوحا هو عندما يكون الحد بين الأسود الفاتح أكثر وضوحا أو في التركيز. للحصول على التباين الأمثل ، اضبط جدار التفاح والمنشور عن طريق تدوير المقبض الموجود على شريط التمرير.

الآن المجهر جاهز تقريبا للاستخدام. حان الوقت للتحكم في معلمات التصوير الإضافية على الكمبيوتر باستخدام micromanager والبرامج مفتوحة المصدر. ابدأ بضبط كسب الكاميرا على الصفر.

ثم قم بالتبديل إلى حفظ الملفات بثمانية بت ، وليس 16 بت tiffs. يمكن تحليل ملفات TIFF لاحقا بواسطة برنامج مفتوح المصدر مثل Image J.Next ، اضبط مستوى الضوء إلى حيث تكون وحدات البكسل الأكثر سطوعا أقل بقليل من مستويات التشبع. إذا تم كل شيء بشكل صحيح ، فستبدو الصورة ثلاثية الأبعاد مع الضوء الذي يبدو وكأنه يلمع بزاوية.

الآن بعد أن بدت الصورة رائعة ، حدد الأجنة التي تريد تصويرها وارسم منطقة اهتمام. إذا كان المجهر يحتوي على محرك تركيز بؤري ، فاستخدمه لجمع مستويات بؤرية متعددة في كل مرة. افتح نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد واضبط المستوى العلوي والسفلي لمكدس Z عن طريق ضبط مقبض التركيز للعثور على المستوى البؤري الأول والأخير مع بعض حبيبات النير في التركيز.

اضبط حجم الخطوة. سيحدد هذا عدد المستويات البؤرية التي تم جمعها. الآن ، قم بتعيين فاصل زمني طويل بما يكفي للحصول على جميع المستويات البؤرية.

يمكن ضبط الحد الأقصى للنقاط الزمنية عالية جدا بحيث يلتقط البرنامج الصور حتى يتم إيقافه يدويا. اضبط البرنامج لعرض آخر صورة تم الحصول عليها فقط بحيث يمكن مراقبة العملية. الآن امنح الصور اسم ملف وابدأ في الحصول على الصور.

سيتم مراجعة تحليل الصور بإيجاز في نهاية القسم التالي. يشبه إنشاء فيلم GFP إلى حد كبير صنع أربعة D أو Musky DIC ، ولكن يتم استخدام ملف تكوين يتضمن التحكم في البرامج لتحطيم الفلورسنت. بدلا من ذلك ، مع وجود الأجنة ، تأكد من أن منشور حجر الظهر العلوي ليس في مسار الضوء وقم بتبديل مكعب المرشح إلى F-I-T-C-G-F-P.

إذا لم يتم تعيين هذا تلقائيا عند بدء التشغيل باستخدام البرنامج، فتأكد من ضبط كسب الكاميرا على 255. يتم تعيين ملف الصورة على تنسيق tiff 16 بت. الآن قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء المرسل وانقر فوق التصوير المباشر.

اضبط شدة مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ووقت التعرض لتحقيق نسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء لإشارة التألق ، ومع ذلك ، حافظ على التعرض للضوء عند الحد الأدنى للحفاظ على الخلايا. بعد ذلك ، قم بإعداد الفاصل الزمني. يمضي عدد النقاط الزمنية وعدد المستويات البؤرية الآن في الحصول على الصور كما هو موضح سابقا.

لتحليل الأفلام ، استخدم برنامجا مفتوح المصدر. الصورة J مع المكون الإضافي micromanager المثبت يمكن أيضا استيراد أفلام كبيرة جدا إلى الصورة J باستخدام المكون الإضافي loci. هذا جنين من النوع البري تم التقاطه باستخدام بصريات DIC مقنعة.

الخلفي إلى أسفل اليمين والبطني إلى أسفل اليسار. يعرض الفيلم سلسلة من صور المستوى البؤري الفردي التي يتم جمعها كل 15 ثانية. تم ضبط التشغيل على 14 إطارا في الثانية.

يعبر هذا الجنين عن التألق أثناء الانقسام الجنيني الأول هنا الخلفي إلى أعلى اليمين. يعرض هذا الفيلم التغييرات في مستوى بؤري واحد كل 10 ثوان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير الأجنة الحية باستخدام كل من بصريات DIC Naski و epi Fluorescence لدراسة الأحداث الديناميكية.

نأمل أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية إعداد بصريات DIC Nomar للحصول على الصور المثلى وإدراك أنه يمكنك الحصول على بيانات فلورية عالية الجودة باستخدام إضاءة مضان epi ، ولا تعتمد دائما على مجاهر أكثر تقدما. يمكنك أيضا تطبيق تقنيات التصوير هذه لفحص الأجنة التي تفتقر إلى وظيفة جينية محددة لمزيد من التحقيق في المتطلبات الجينية للأحداث المفضلة لديك أثناء انقسام الخلية أو تطورها.