دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص الديناميكيات التشكيلية لبروتينات الغشاء باستخدام وسم الفلورة الموجه موقعياً على سطح الخلايا المفردة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحويل البقايا الموجودة عند الواجهة بين المجالات خارج الخلوية وعبر الغشائية بشكل فردي إلى سيستين، كما هو موضح بالحرف C باللون الأحمر. ومن ثم، يلزم تحديد ما إذا كان يمكن وسم هذه البقايا باستخدام فلوروفور يتفاعل مع السيستين. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في فحص ما إذا كان تحويل السيستين، أو الطفرات، و/أو وسم الفلوروفور يؤثر على حركية و/أو الحالة التشكيلية للبروتين.

يتم تنفيذ ذلك باستخدام الإعداد الموضح. تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في مقارنة ومقابلة التغيرات في شدة الفلورة مع المعاملات الحركية للبروتين المستهدف. يظهر هنا مخطط تتبع فلوري نموذجي.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في وسم أزواج السيستين الطافرة إما بمانحات Fluor fours أو بمانحات ومستقبلات Fluor fours لقياس معدلات التدمير الضوئي بالتزامن مع قياسات تثبيت الجهد لتحديد قيود المسافة. يوضح هذا الشكل معدلات التدمير الضوئي للمانح في غياب المستقبل باللون الأسود، بينما يظهر التدمير الضوئي للمانح في وجود المستقبل باللون الأحمر. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تبين أن التغيرات في شدة الفلورة، الناتجة عن التغيرات التشكيلية للبروتين، يمكن ربطها بوظيفة بروتين الغشاء من خلال قياس الفلورة بتثبيت الجهد.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال نقل الأيونات عبر الغشاء، مثل كيفية تسهيل التغيرات في الحالة التشكيلية للبروتين لنقل الجزيئات الصغيرة والأيونات عبر الغشاء البلازمي. ابدأ الإجراء باستنساخ مضخة الصوديوم والبوتاسيوم في ناقل مناسب للتعبير في بويضات Xenopus laevis. الخطوة التالية هي إحداث طفرات السيستين في الثمالات الواقعة عند الواجهة بين النطاقات العابرة للغشاء والنطاقات خارج الخلوية كما هو موضح في المقال المصاحب.

عند الانتهاء، تحقق من إدراج الطفرة عن طريق تسلسل DNA بعد نسخ DNA البلازمي إلى mRNA كما هو موضح في المقال المصاحب، وقم بقياس كمية إنتاج mRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي قبل الجراحة. يجب جعل الضفدع يصوم لمدة 12 ساعة لمنع القيء أثناء العملية. لبدء الجراحة في اليوم التالي، اغمر الضفدع في المحلول المخدر حتى يصبح الضفدع غير مستجيب لقرصة الإصبع.

أخرج الضفدع من المحلول المخدر وضعه بحيث يكون ظهره للأسفل على الجانب الماص من وسادة حفاض. ضع منشفة ورقية مبللة فوق الضفدع للحفاظ على رطوبته. كذلك، إذا كانت عينا الضفدع مفتوحتين، فحافظ على رطوبتهما باستخدام محلول ملحي.

أجْرِ شقاً صغيراً بدقة على أحد جانبي الخط الناصف للضفدع. حدد موقع المبيض وأخرجه إلى خارج جسم الضفدع، مع تجنب ملامسة المبيض للجلد.

قم بإزالة المبيض ووضعه في طبق بتري يحتوي على محلول رينجر. تحقق من عدم وجود نزيف في الأنسجة المتبقية قبل إعادتها إلى تجويف البطن. في حالة حدوث نزيف، قم بتطبيق ضغط باستخدام مسحة قطنية (Q-tip) معقمة حتى يتوقف النزيف.

أنهِ الجراحة بخياطة الشق باستخدام نمط الغرز المنفصلة. أعد الضفدع إلى مسكنه للتعافي من التخدير باستخدام المقص. قسّم الفص المبيضي المعزول إلى أجزاء أصغر.

انقل الكتل إلى محلول رينجر المضاف إليه الكالسيوم مع الكولاجيناز. بعد ذلك، رج محلول الهضم بلطف لمدة ساعتين عند 18 درجة مئوية. وعندما تنفصل معظم الخلايا البيضية، اغسل الخلايا البيضية بمحلول رينجر الخالي من الكالسيوم.

بعد ذلك، تُحضن الخلايا البيضية لمدة 10 دقائق في محلول رينجر الخالي من الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة. عند هذه النقطة، تُغسل الخلايا جيداً وبشكل شامل في محلول رينجر المضاف إليه الكالسيوم. ثم تُنقل الخلايا البيضية إلى محلول رينجر المضاف إليه الكالسيوم لتخزينها قبل عملية الحقن.

في الخطوة التالية، استخرج mRNA المُصنّع من المجمد عند درجة حرارة -20 °C. أضف 25 nanograms من mRNA إلى حجم نهائي قدره 50 nanoliters. ثم احقن mRNA في الخلايا بعد عملية الحقن.

ضع البويضات في محلول رينجر مع 1 mg/mL من الجنتاميسين، واحضنها عند 18 °C في الظلام لمدة تتراوح من ثلاثة إلى سبعة أيام. يسمح ذلك بتعبير مضخة الصوديوم والبوتاسيوم داخل الغشاء البلازمي للبويضة. وفي يوم التجربة، أخرج البويضات من الحاضنة وضعها في محلول التحميل لمدة 45 دقيقة، ثم في محلول ما بعد التحميل لمدة 45 دقيقة.

يؤدي هذا إلى زيادة تركيز الصوديوم داخل الخلايا لتسهيل قياس مضخة الصوديوم والبوتاسيوم. بالنسبة لقياسات الفلورة، يتم تحضين الخلايا في محلول منظم بعد التحميل يحتوي على 5 µM من الفلوروفور المطلوب، مثل TMRM أو FM، لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في الظلام. وبعد عملية الوسم بالفلوروفور، تُغسل الخلايا البيضية جيداً باستخدام المحلول المنظم الماص بعد التحميل والخالي من الصبغة.

احتفظ بالبويضات في الظلام لمنع التبييض الضوئي. وللتحضير لقياسات تثبيت الجهد باستخدام قطبين كهربائيين، ابدأ بملء الأقطاب الكهربائية الدقيقة بـ 3 molar potassium chloride واختبار المقاومة. يجب أن تكون المقاومة بين 0.5 و 1.5 mega ohms.

بالنسبة لتجارب مسح السيستين، قم بتجهيز المجهر الفلوري بمرشح إثارة 5 35 DF 50، ومرشح انبعاث 5 65 EFLP، ومرآة ثنائية اللون 5 70 DRLP. بعد ذلك، ضع الأخطبوط في غرفة RC 10 على منصة المجهر الفلوري. ثم أدخل كلا القطبين الكهربائيين الدقيقين برفق في الأخطبوط باستخدام المضخم للحفاظ على جهد الغشاء عند قيمة ثابتة.

قم بقياس التدفق الأيوني عبر الغشاء عن طريق تنشيط البروتين باستخدام تقنية مناسبة مثل تبادل المحاليل أو تغيير جهد الغشاء. ولإجراء قياسات الفلورة المتزامنة، استخدم مصدر ضوء تنجستن بقدرة 100 وات لإثارة الفلوروفور المانح وتثبيت 0 2 2, A photo DDE للكشف عن التغيرات في شدة الفلورة من أجل الوسم الفلوري. وذلك بعد إجراء مسح السيستين.

قم بقياس التغير في شدة الفلورة عند التيار الثابت باستخدام خطوات جهد يتم التحكم فيها بواسطة برنامج P clamp 10. يتضمن الجزء الثاني من البروتوكول إجراء قياسات anes atropy جنبًا إلى جنب مع قياسات المسافة. ولحساب نطاق قيم كابا تربيع (kappa squared)، تقيس anes atropy الحركية النسبية للفلوروفور الناتجة عن الدوران.

راجع المقال المصاحب للحصول على تفاصيل الحسابات. لقياس قيود المسافة، استخدم إنزيم holo، والذي يحتوي على بقايا سيستين خارج خلوية يمكن الوصول إليها ويمكن وسمها بالفلوروفورات. أضف محلول تحميل منظم يحتوي على 1 µM من FM و 4 µM من TMRM.

هذا هو المانح والمستقبل. بالنسبة لمجموعة من البويضات بنسبة فلوروفور 4 إلى 1، يتم إضافة 1 µM من FM فقط. هذا هو الفلوروفور المانح فقط.

أضف أربعة إلى دفعة أخرى من البويضات، ثم قم بحضن كلتا الدفعتين من البويضات على الثلج لمدة 30 دقيقة في الظلام. يتيح ذلك إجراء قياسات للإنزيمات المهلجنة المحددة بفلوروفور مستقبل أو بدونها. بعد ذلك، قم بتجهيز المجهر بمرشح إثارة 475 DF 40، ومرشح انبعاث 530 DF 30، ومرآة ثنائية اللون 505 DRLP.

بعد ذلك، ضع البويضة في الحجرة الموجودة على منصة مجهر الفلورة. وقم بقياس الاعتماد الزمني لعملية تبييض المانح في وجود وغياب الفلورة المستقبلة، مع الحفاظ على تدفق مستمر للمحلول. رابعاً. يمكن استخدام هذه النتائج لحساب المسافة بين الثمالتين على مضخة الصوديوم والبوتاسيوم باستخدام طريقة فورستر.

يجب إجراء قياسات تثبيت الجهد بقطبين متساويين في آن واحد للتأكد من أن البروتين فعال. وباستخدام ميزة clamp X في برنامج P clamp 10، قم بحساب متوسط نتائج التدمير الضوئي للفلوروفور المانح لأربعة تسجيلات على الأقل من المواقع المقابلة. ولقياس الحركة النسبية للوحدات الفرعية للبروتين، استخدم تركيبات السيستين المزدوج التي تحتوي على فلوروفورات مستقبلة ومانحة.

تكون شدة الفلورة عند هذه البقايا غير حساسة للحالة التشكلية للبروتين وستعتمد على المسافة بين المجموعتين. بعد ذلك، قم بتغيير مجموعة المرشحات في المجهر إلى مرشح إثارة 4 75 a F 40، ومرشح انبعاث 5 95 a F 60، ومرآة ثنائية اللون 5 0 5 DRLP. ثم ضع الـ OI في الحجرة الموجودة على منصة مجهر الفلورة.

بعد ذلك، يتم تحفيز المانح باستخدام مصدر ضوء تنگستن بقدرة 100 وات، وتُقاس شدة الفلورة للمستقبل Fluoro four باستخدام طريقة مناسبة مثل الرابط الجهدِي أو تبادل المحاليل، مع تنشيط بروتين الغشاء وقياس التغير في شدة الفلورة في آن واحد. يوضح هذا الشكل الارتباط بين نقل الأيونات عبر غشاء الخلية والتغيرات في شدة الفلورة.

يُظهر التتبع العلوي قياسات تثبيت التيار (current clamp) في وجود محلول اختبار الصوديوم ومحلول اختبار البوتاسيوم بوجود 10 micromolar و 10 millimolar ing. ويُظهر التتبع السفلي التغيرات في شدة الفلورة المقاسة بالتزامن مع قياسات تثبيت التيار. يوضح هذا الشكل بويضتين ملوَّنتين بـ TMRM، وهو الفلور المستقبل الرابع.

تعبر البويضة الموجودة على اليسار عن إنزيم sodium potassium atpa من النوع البري، بينما تعبر البويضة الموجودة على اليمين عن sodium potassium APAs مع وجود بقايا سيستين واحدة يمكن الوصول إليها. وتوضح الخطوط العلوية في هذا الشكل بيانات التيار العابر عند نبضة الجهد. أما الخطوط السفلية فتظهر تسجيلات في الوقت الفعلي لتغيرات شدة الفلورسنت عند نبضة الجهد.

يوضح هذا الشكل الاعتماد الزمني للتبييض الضوئي، حيث يتم قياس التدمير الضوئي للمانح في حالة غياب وحضور الفلور المستقبل 4. يحدث التبييض الضوئي بشكل أسرع في غياب الفلور المستقبل 4. يمثل كل تتبع متوسط أربعة تسجيلات لمواقع oh. يوضح هذا الشكل الحركة النسبية للوحدات الفرعية عند حدوث تغيرات تشكيلية.

تظهر تغيرات الفلورة في المسارات الحمراء، بينما يظهر تدفق التيار في المسارات السوداء. وتشير الزيادة في شدة الفلورة الموضحة على اليسار إلى تقارب المسافة بين Fluor four. بينما يشير عدم تغير شدة الفلورة الموضحة في المنتصف إلى بقاء المسافة بين Fluor four ثابتة.

يشير الانخفاض في شدة الفلورة الموضح على اليمين إلى ابتعاد الفلوروفورات عن بعضها البعض. ومن المهم عند تنفيذ هذا الإجراء تذكر ربط التغيرات في شدة الفلورة الحركية وفي الحالة المستقرة بالتغيرات التشكيلية في البروتين.