دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

سنقوم بشرح طريقة الذي يقيس حركية النقل ايون للبروتينات غشاء جنبا إلى جنب مع مواقع محددة تحليل التغيرات متعلق بتكوين باستخدام مضان على الخلايا واحد. هذه التقنية هي قابلة للتكيف مع القنوات الأيونية ، ومضخات نقل أيون ويمكن استخدامها لتحديد المسافة بين القيود مفارز البروتين.

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص الديناميكيات التأكيدية لبروتينات الغشاء باستخدام وضع العلامات المضان الموجه للموقع على سطح الخلايا المفردة. يتم تحقيق ذلك عن طريق المخلفات الطورية الفردية أولا في واجهة المجالات خارج الخلية والغشاء إلى السيستين كما هو موضح في C.It الأحمر ضروري بعد ذلك لتحديد ما إذا كان يمكن تسمية هذه البقايا بالفلورو المتفاعل مع السيستين أربعة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في فحص ما إذا كان وضع العلامات على السيستين أو الطفرات أو الفلورو أربعة يؤثر على الحركية و / أو الحالة التأكيدية للبروتين.

يتم تنفيذ ذلك باستخدام الإعداد المعروض. تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في مقارنة ومقارنة التغيرات في شدة التألق مع المعلمات الحركية للبروتين المستهدف. يظهر هنا أثر مضان نموذجي.

تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تسمية أزواج السيستين المتحولة إما بأربعة الفلور أو المتقبل المتبرع Fluor fours لقياس معدلات تدمير الصور جنبا إلى جنب مع قياسات مشبك الجهد لتحديد قيود المسافة. يوضح هذا الشكل معدلات تدمير صور المتبرع في حالة عدم وجود متقبل في صورة المتبرع باللون الأسود في وجود المتقبل باللون الأحمر. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن التغيرات في شدة التألق ، والتي تنتج عن التغيرات التأكيدية للبروتين ، يمكن أن ترتبط بوظيفة البروتين الغشائي من خلال القياس الفلوري لمشبك الجهد.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نقل أيونات الغشاء ، مثل كيف تسهل التغييرات في الحالة التأكيدية للبروتين نقل الجزيئات الصغيرة والأيونات عبر غشاء البلازما. ابدأ الإجراء عن طريق استنساخ مضخة بوتاسيوم الصوديوم في ناقل مناسب لأعمدة xop ، تعبير بويضات لافيس. الخطوة التالية هي إجراء طفرات السيستين في المخلفات الموجودة في الواجهة بين المجالات الغشائية وخارج الخلية كما هو موضح في المقالة المصاحبة.

عند الانتهاء ، تحقق من إدخال الطفرة عن طريق تسلسل الحمض النووي بعد نسخ الحمض النووي للبلازما إلى mRNA كما هو موضح في المقالة المصاحبة ، وحدد كمية إنتاجية mRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي قبل الجراحة. يجب صيام الضفدع لمدة 12 ساعة لمنع القيء أثناء العملية. لبدء الجراحة في اليوم التالي ، اغمر الضفدع في محلول التخدير حتى يصبح الضفدع غير مستجيب لقرص إصبع القدم.

قم بإزالة الضفدع من محلول التخدير وضعه على الجانب الظهري لأسفل على الجانب الماص من وسادة الحفاضات. ضع منشفة ورقية مبللة على الضفدع للحفاظ على رطوبة الضفدع. أيضا ، إذا كانت عيون الضفدع مفتوحة ، حافظ على رطوبتها بمحلول ملحي.

قم بعمل شق صغير على جانب واحد من خط الوسط للضفدع. حدد موقع المبيض وأحضره إلى السطح الخارجي للضفدع. تجنب لمس المبيض بالجلد.

قم بإزالة المبيض وضعه في طبق بتري يحتوي على محلول جرس. افحص الأنسجة المتبقية بحثا عن النزيف قبل وضعها مرة أخرى داخل التجويف الدقيقي. في حالة حدوث نزيف ، اضغط باستخدام طرف Q معقم حتى يتوقف.

قم بإنهاء الجراحة عن طريق خياطة الشق باستخدام نمط خياطة متقطع. أعد الضفدع إلى مسكنه للتعافي من التخدير باستخدام المقص. قسم فص المبيض المعزول إلى أجزاء أصغر.

انقل الكتل إلى محلول رنين بالإضافة إلى الكالسيوم مع الكولاجيناز. بعد ذلك ، رج محلول الهضم برفق لمدة ساعتين عند 18 درجة مئوية. عندما يتم فصل معظم الخلايا ، اغسل البويضات بمحلول رنين ناقص الكالسيوم.

ثم احتضان البويضات لمدة 10 دقائق في محلول رنين ناقص الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة. في هذه المرحلة ، اغسل السيات بشكل شامل في الرنين بالإضافة إلى محلول الكالسيوم. ثم انقل البويضات إلى محلول رنجر بالإضافة إلى الكالسيوم للتخزين قبل الحقن.

للخطوة التالية ، استرجع mRNA المركب من الفريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر. أضف 25 نانوغراما من الرنا المرسال إلى الحجم النهائي البالغ 50 نانولترا. ثم حقن mRNA في الخلايا بعد الحقن.

ضع البويضات في محلول رنين ومليغرام واحد لكل مليلتر جنتاميسين واحتضانها عند 18 درجة مئوية في الظلام لمدة ثلاثة إلى سبعة أيام. هذا يسمح بالتعبير عن مضخة بوتاسيوم الصوديوم داخل غشاء بلازما البويضة. في يوم التجربة ، قم بإزالة البويضات من الحاضنة وضعها في مخزن التحميل لمدة 45 دقيقة ثم في مخزن مؤقت بعد التحميل لمدة 45 دقيقة.

هذا يزيد من تركيز الصوديوم داخل الخلايا لتسهيل قياس مضخة بوتاسيوم الصوديوم. لقياسات التألق ، احتضان الخلايا في مخزن مؤقت بعد التحميل يحتوي على خمسة ميكرومولار من الفلوروفور المطلوب ، مثل TMRM أو FM لمدة خمس إلى 10 دقائق في الظلام. بعد وضع العلامات على النباتات الرابعة ، اغسل البويضات بشكل شامل باستخدام مخزن مؤقت خال من الصبغة.

احتفظ بالبويضات في الظلام لمنع تبييض الصورة. للتحضير لقياسات مشبك جهد القطب الكهربائي ، ابدأ بملء الأقطاب الكهربائية الدقيقة بثلاثة كلوريد بوتاسيوم مولار واختبار المقاومة. يجب أن تكون المقاومة بين 0.5 و 1.5 ميجا أوم.

بالنسبة لتجارب مسح السيستين ، قم بتجهيز المجهر الفلوري بمرشح إثارة 5 35 DF 50 ، ومرشح انبعاث 5 65 EFLP ، ومرآة ثنائية بخمسة 70 DRLP. بعد ذلك ، ضع الثماني في غرفة RC 10 على مرحلة المجهر الفلوري. ثم أدخل كلا القطبين الصغيرين برفق في الثماني باستخدام مكبر الصوت للاحتفاظ بجهد الغشاء عند قيمة ثابتة.

قم بقياس تدفق الأيونات عبر الغشاء عن طريق تنشيط البروتين باستخدام تقنية مناسبة مثل تبادل المحلول أو تغيير إمكانات الغشاء. لقياسات التألق المتزامنة ، استخدم مصدر ضوء التنغستن بقدرة 100 واط لإثارة الفلوروفور المانح وتثبيت 0 2 2 ، صورة DDE للكشف عن التغيرات في شدة التألق لوضع العلامات الفلورية. بعد فحص السيستين.

قم بقياس التغير في شدة الفلورسنت عند التيار الثابت باستخدام خطوات الجهد التي يتم التحكم فيها بواسطة برنامج P clamp 10. يتضمن الجزء الثاني من البروتوكول أخذ قياسات أذب العانس جنبا إلى جنب مع قياسات المسافة. لحساب نطاق قيم تربيع كابا ، يقيس الرباط الحركة النسبية للفلورو أربعة بسبب الدوران.

انظر المقالة المصاحبة للحصول على تفاصيل الحسابات. لقياس قيود المسافة ، استخدم إنزيم هولو ، الذي يحتوي على بقايا سيستين خارج الخلية يمكن الوصول إليها ويمكن تصنيفها باستخدام أربعة الفلور. أضف المخزن المؤقت بعد التحميل الذي يحتوي على ميكرومولار FM وأربعة ميكرومولار TMRM.

هذا هو المتبرع والمقبول. تضيف أربعة الفلورو إلى دفعة واحدة من البويضات ميكرومولار FM واحد فقط. هذا هو مجرد فلورو المانح.

تحتضن أربع دفعات أخرى من البويضات كلتا الدفعتين من البويضات على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام. يسمح ذلك بإجراء قياسات لإنزيمات هولو المسمى بفلورو أربعة متقبل وبدونه. بعد ذلك ، قم بتجهيز المجهر بمرشح إثارة 4 75 DF 40 ، ومرشح انبعاث بخمسة 30 DF 30 ، ومرآة ثنائية اللون 5 0 5 DRLP.

ثم ضع البويضة في الغرفة على مرحلة المجهر الفلوري. يقيس الحفاظ على تدفق المحلول المستمر الاعتماد الزمني لتبييض المتبرع في وجود وغياب النباتات المتقبلة. أربعة. يمكن استخدام هذه النتائج لحساب المسافة بين البقايا على مضخة بوتاسيوم الصوديوم باستخدام الحراجة.

مشبك جهد القطب الكهربائي في المعادلة الثانية بشكل متزامن لضمان أن البروتين يعمل. باستخدام ميزة المشبك X في المشبك P 10 ، قم بمتوسط نتائج تدمير الصور للمتبرع الفلورو أربعة لما لا يقل عن أربعة تسجيلات لموقع oh. لقياس الحركة النسبية للوحدات الفرعية للبروتين ، استخدم تركيبات السيستين المزدوجة التي تحتوي على أربعة فلورو متقبل ومتبرع.

شدة التألق في هذه المخلفات غير حساسة للحالة التأكيدية للبروتين وستكون دالة للمسافة بين الأربعة. بعد ذلك ، قم بتغيير مجموعة المرشح في المجهر إلى مرشح إثارة 4 75 A F 40 ، ومرشح انبعاث 5 95 A F 60 ، ومرآة ثنائية اللون 5 0 5 DRLP. ثم ضع OI في الغرفة على مرحلة المجهر الفلوري.

بعد ذلك ، يكون المتبرع متحمسا لمصدر ضوء التنغستن بقوة 100 واط وشدة التألق للمتقبل. يتم قياس الفلورو أربعة باستخدام طريقة مناسبة مثل ترابط الجهد أو تبادل المحلول ، وتنشيط بروتين الغشاء وقياس التغيير في شدة التألق في نفس الوقت. يوضح هذا الشكل ارتباط نقل الأيونات عبر غشاء الخلية والتغيرات في شدة التألق.

يظهر التتبع العلوي قياسات المشبك الحالية في وجود محلول اختبار الصوديوم ومحلول اختبار البوتاسيوم في وجود 10 ميكرومولار و 10 مللي مولار. يظهر التتبع السفلي التغيرات في شدة التألق المقاسة جنبا إلى جنب مع قياسات المشبك الحالية. يوضح هذا الشكل بويضتين مسماتين ب TMRM ، الفلورو المتلقي أربعة.

تعبر البويضة الموجودة على اليسار عن النوع البري من بوتاسيوم الصوديوم atpa ، بينما تعبر البويضة الموجودة على اليمين عن APAs بوتاسيوم الصوديوم مع بقايا سيستين واحدة يمكن الوصول إليها. تظهر الآثار العلوية لهذا الشكل بيانات التيار العابر عند نبضة الجهد. تظهر الآثار السفلية تسجيلات في الوقت الفعلي لتغيرات شدة التألق عند نبضة الجهد.

يوضح هذا الشكل أن الاعتماد الزمني للتبييض الضوئي يتم قياس تدمير صور المتبرع في غياب ووجود فلورو أربعة يحدث تبييض الصور بسرعة أكبر بدون فلورو أربعة متقبل. كل أثر هو متوسط أربعة تسجيلات لموقع أوه. يوضح هذا الشكل حركة الوحدة الفرعية النسبية عند التغييرات التأكيدية.

تظهر تغيرات التألق في الآثار الحمراء ويظهر تدفق التيار في الآثار السوداء. تشير الزيادة في شدة التألق الموضحة على اليسار إلى أن أرضيات النباتات تقترب من بعضها البعض. لا يوجد تغيير في شدة التألق الموضح في المنتصف يشير إلى أن مسافة الفلور الأربعة لا تزال ثابتة.

يشير الانخفاض في شدة التألق الموضح على اليمين إلى أن الفلور أربعة يتحركون بعيدا عن بعضهم البعض أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم أن تتذكر ربط التغيرات في شدة التألق الحركية والحالة المستقرة بالتغيرات التأكيدية في البروتين.