تلفيق Micropatterned الهلاميات المائية لأنظمة الثقافة العصبية الديناميكية باستخدام الطباعة التصويرية إسقاط القناع

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام لزراعة خلايا هيدروجيل مزدوجة منقوشة دقيقة للدراسات العصبية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع أنسجة الطلاء الأولى مثل العقد الجذرية الظهرية الجنينية على إدخالات زراعة الخلايا القابلة للنفاذ. بعد ذلك ، يتم إنشاء نمط دقيق في هيدروجيل قابل للربط عبر الصور باستخدام جهاز مرآة رقمي صغير أو DMD كقناع صور ديناميكي.

يتبع ذلك إضافة هيدروجيل ذاتي التجميع مثل النقي ، والذي قد يحتوي على تعليق من الخلايا المنفصلة. وقت الحضانة المناسب ضروري قبل التحليل الخلوي. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر صلاحية الخلايا العصبية ونمو الخلايا العصبية من خلال تكوينات هندسية محددة تحددها DMD.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه يمكن إنشاء كتلة صورة ديناميكية وتعديلها وإسقاطها بسرعة من مسافة بعيدة لاستيعاب أي ركيزة تقريبا مثل إدخالات زراعة الخلايا القابلة للنفاذ. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للأنظمة العصبية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأنظمة الأخرى التي يمكن أن تستفيد من القيود الهندسية المحددة مثل إشارات الخلية ، أو هجرة الخلايا ، أو الاتصال بخلية إلى خلية ، أو التشكل على سبيل المثال لا الحصر. يتم تثبيت دليل مصابيح الأشعة فوق البنفسجية للوحة DMD والعدسة الموضوعية أربع مرات عموديا على طاولة عزل الاهتزاز.

يتم وضع مجهر مقلوب أسفل العدسة الموضوعية بحيث يمكن تصور ضوء التركيز المنعكس من DMD من خلال المجهر. للحصول على تفاصيل إضافية حول إعداد DMD ، يرجى الاطلاع على البروتوكول المكتوب المصاحب. أولا ، قم بإعداد إدخالات ثقافة الخلايا الستة المطلية بالكولاجين جيدا لتلقي X explan الثقافات التي تغطي جدران إدخالات زراعة الخلايا بالمطر x ، مع الحرص على عدم تطبيق المطر X على الغشاء نفسه.

ثم أضف 1.5 مل من وسائط aian إلى الإدخالات واحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي بعد حصاد العقد الجذرية الظهرية الجنينية من E 15 جرئة ، قم بلوحة ما يصل إلى أربعة DRGs على كل كولاجين مغلف. ستة. أدخل جيدا واحتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح ل DRG بالالتصاق بالغشاء.

بعد فترة الحضانة ، ستكون DRGs جاهزة لبلمرة الصور. جهاز المرآة الصغيرة الرقمي عبارة عن مجموعة 1024 × 768 من المرايا الفردية ، والتي تعكس الضوء بشكل انتقائي بناء على موضع المرآة. في هذا الإجراء ، يتم استخدام DMD لنمط الأشعة فوق البنفسجية على CROs للصور ، والمواد الهلامية المائية القابلة للربط ، وإنشاء أشكال هندسية هيدروجيل قابلة للتحديد بطريقة بسيطة وسريعة.

على الرغم من أن DMD الخاص بنا عبارة عن وحدة قائمة بذاتها ، إلا أنه يمكن أيضا دمج الجهاز للاستخدام مع العديد من المجاهر الموجودة. أولا ، استرجع نباتات DRGX من الحاضنة ، واستنشق كل السائل الزائد من الإدراج. ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط البلمرة إلى داخل الإدراج.

انقل الإدخالات باستخدام نباتات DRGX إلى شريحة زجاجية من المطر وضع الشريحة أسفل DMD. استخدم برنامج واجهة المستخدم الرسومية الأساسية ALP لتحميل الصورة بالأبيض والأسود التي سيتم استخدامها كقناع للصور على DMD. في هذه الحالة ، تم اختيار شكل متشعب للسماح بتنفيذ أنظمة توجيه العصبية باستخدام مجهر مقلوب ومصدر ضوء مرئي DI.

قم بمحاذاة مخطط الأنسجة مع الموقع المناسب على قناع الصورة باستخدام الضوء المنعكس عن DMD كدليل. بعد ذلك ، قم بتبديل مصدر الضوء المرئي لمصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تضيء وسط البلمرة داخل مزرعة الخلية.

أدخل حتى يكتمل الربط المتبادل ل PEG. كرر لكل DRG على الإدراج. ثم اغسل كل حشوة ثلاث مرات بمحلول ملحي معقم يحتوي على 1٪ بنسلين ستربتومايسين.

أخيرا ، أضف 1.5 مل من وسائط النمو أسفل إدخالات زراعة الخلايا واتركها تتوازن في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة ، صوتنة مصفوفة نقية لمدة 30 دقيقة. لإذابة الببتيدات ، قم بتخفيف محلول 1٪ المزود إلى 0.15٪ في الماء المعقم واستكماله بميكروغرام واحد لكل مليلتر من اللامينين القابل للذوبان.

بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الثقافات من الحاضنة واستنشق جميع الوسائط الزائدة من الملحق. ثم أثناء تصور الفراغ تحت المجهر ، قم بشفط الوسائط من داخل المنطقة المفرغة في بناء PEG الذي يحتوي على ماصة DRGX explan حول ميكرولتر واحد من محلول المصفوفة النقي في الفراغ حول X explan. تأكد من أن المصفوفة النقية لا تفيض بفراغ الوتد.

ثم قم بوضع 1.5 مل من وسائط النمو أسفل الملحق وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. لضمان الاكتمال بعد هذا الوقت ، استبدل وسائط النمو ثم أعد المزارع إلى الحاضنة. يتم استبدال وسائط النمو بعد كل 48 ساعة من الثقافة.

يتم عرض أمثلة على تركيبات الهيدروجيل المزدوجة التي تحتوي على نباتات DRGX هنا. تم تصنيف مصانع DRGX لعلامات النمو والانتشار. يظهر بناء PEG المبلمر باللون الرمادي ، وتظهر DRG NEURITES المسماة ببيتا ثلاثة توبولين باللون الأخضر ونواة خلايا صبغة DPI كما هو موضح باللون الأزرق.

لاحظ أن الهجرة الخلوية والامتداد الشبكي يقتصر على المنطقة المسموح بها للخلية لبناء الهيدروجيل المزدوج. يعد تغليف الهيدروجيل المزدوج مناسبا عند استخدام أي هلام ذاتي التجميع ، وهو جل قابل للربط عبر الصورة. في هذه الحالة ، يعمل PEG كدعم هيكلي للعرض الهندسي للهلام ذاتي التجميع.

على سبيل المثال ، مصفوفة نقية أو أريس. يعتمد نوع الجل واختيار قناع الصورة على التطبيق المطلوب معين. عالج جدران إدراج ثقافة خلايا البوليستر بالمطر X كما هو موضح سابقا.

انقل الملحق إلى شريحة مطلية بالمطر X وضعها أسفل DMD. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من وسائط البلمرة إلى الإدراج. قم بتحميل القناع المناسب على DMD لتجربة البقاء على قيد الحياة هذه.

يتم استخدام عرض أسطواني للمصفوفة النقية للمساعدة في تصوير الخلايا. قم بتعريض الملحق لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 55 ثانية للحث على ربط الربط المتقاطع بعد الربط المتقاطع. اغسل الفراغ المشكل حديثا باستخدام DPBS معقم و 1٪ بكتيريا القلم.

استخدم ماصة دقيقة أو قضيب رأس قطني معقم لإزالة كل السوائل الزائدة من الفراغ. تحضير ماتريكس نقي من سونيكات لمدة 30 دقيقة ، مخفف إلى 0.15٪ في ماء معقم ، مع استكمال ميكروغرام واحد لكل مليلتر من اللامينين القابل للذوبان و 10٪ السكروز. بعد ذلك ، قم بتكسير الخلايا المراد زراعتها بالطرد المركزي.

استنشق الوسائط جيدا من حبيبات الخلية وأعد تعليق الحبيبات بتركيز حوالي خمسة في 10 إلى الخلايا الثلاث لكل مليلتر في محلول المصفوفة النقي 0.15٪. من الأهمية بمكان أن يتم استنشاق جميع الوسائط من حبيبات الخلية حيث تبدأ المصفوفة النقية في التجميع الذاتي عند ملامستها لمحلول الملح. بعد ذلك ، ضع الماصة حول ميكرولتر واحد من خليط خلية المصفوفة النقية المكمل في فراغ الوتد.

ما يكون هذا الحجم كافيا لملء المساحة الفارغة دون فيضان الماصة 1.5 مل من وسائط النمو أسفل الملحق. ثم ضع الهيدروجيل الثانوي المصفوفة النقية في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة لضمان الترشيح الكلي للهلام بعد هذا الوقت ، واستنشاق الوسائط وإضافة وسائط جديدة أسفل الإدخال. الحرص على عدم إتلاف المصفوفة النقية الضعيفة ميكانيكيا.

إعادة المزارع إلى حاضنة زراعة الأنسجة وتغيير الوسائط بعد كل 48 ساعة من الاستزراع. فيما يلي أمثلة على الخلايا العصبية DRG الحية المغلفة داخل مجموعة متنوعة من تركيبات الهيدروجيل المزدوجة. بعد 48 ساعة في وسط النمو ، تم تصنيف الخلايا بالكالسيوم ، وهي علامة خلية حية تظهر باللون الأخضر.

هنا نظرا للطبيعة الديناميكية لقناع الصورة DMD ، فإن الهندسة المتاحة للتغليف محدودة فقط بأبعاد ودقة البصريات. يعد تغليف الهيدروجيل الفردي مناسبا حيث يمكن فحص الخلايا داخل هيدروجيل قابل للربط المتقاطع للصور صحيح لثقافة خلايا البوليستر. أدخلها مع المطر X وضعها تحت DMD على شريحة مطلية بالمطر X.

كما كان من قبل، قم بزراعة الخلايا المراد زراعتها مباشرة في وسط البلمرة بالتركيز المطلوب وتخلط جيدا لضمان التوزيع المتجانس. ثم ماصة 500 ميكرولتر من خلية وسط البلمرة تمزج في الإدراج. اختر القناع المناسب وقم بتحميله على DMD يحفز الربط المتقاطع PEG عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 55 ثانية.

لدراسات بقاء الخلية ، يتم استخدام قناع دائري أساسي لتمثيل أسطوانة اغسل الملحق ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم و 1٪ بكتيريا القلم ، ثم ماصة 1.5 مل من وسائط النمو أسفل الملحق ووسائط نمو كافية في الأعلى لغمر الملحق بالكامل احتضان 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع تغييرات الوسائط كل 48 ساعة. فيما يلي مثال على الخلايا العصبية القشرية الحية المنفصلة المغلفة داخل الوتد. يتم تصنيف الخلايا الحية بالكالسيوم صباحا وتظهر باللون الأخضر بينما يتم تصنيف الخلايا الميتة ب ahy homodimer one وتظهر باللون الأحمر.

المقصود من التغليف في PEG فقط كمثال ، حيث لا يمثل PEG بيئة مثالية للخلايا العصبية. تمثل الهندسة المختارة وسيلة بسيطة لدراسة صلاحية الخلية ، ولكن يمكن تكييفها مع مجموعة واسعة من الهياكل. يمكن استخدام الهلاميات المائية ذات الأغشية الرقيقة لتوليد أنماط محددة من الخلايا المقيدة.

مرة أخرى ، عالج إدراج ثقافة خلايا البوليستر مع المطر X كما كان من قبل وضعها على شريحة معالجة بالمطر X. ثم قم بوضع الماصة من 250 إلى 300 ميكرولتر من وسط البلمرة في الجزء السفلي من إدراج ثقافة الخلية المعالجة. هذا الحجم كاف لتغطية الجزء السفلي من الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 45 دقيقة للسماح للوسيط بالتغلغل في غشاء الإدخال ، وشفط الوسط الزائد من الملحق باستخدام ماصة دقيقة.

ثم قم بوضع كمية كافية من الزيت الشفاف للأشعة فوق البنفسجية في قاع الملحق لتغطية المنطقة بالكامل. احتضان الملحق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة ، وهو طويل بما يكفي لتشكيل الزيت طبقة مميزة فوق وسط البلمرة. قم بتشبع غشاء الإدخال بتحميل قناع مناسب على DMD.

بعد وضع الإدخال والانزلاق تحت DMD ، قم بتحفيز ربط الربط المتقاطع عن طريق التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية. اغسل الملحق ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم وحزام قلم 1٪ بعد الغسيل ، وانقل الملحق إلى حصاد لوحة زراعة الأنسجة الستة بئر وحبيبات الخلايا المراد زراعتها. استنشق الوسائط وأعد تعليق الحبيبات الخلية في وسط النمو بالتركيز المطلوب بين 10 إلى أربعة و 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.

ثم قم بتعبئة حجم كاف من تعليق الخلية داخل إدراج مزرعة الخلية للحصول على كثافة الخلية المطلوبة. أضف وسيطا كافيا للنمو أسفل الملحق للحفاظ على صلاحية الخلية تماما. احتضان 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد 48 ساعة من الحضانة.

اغسل الملحق ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم و 1٪ بكتيريا قلم لإخراج أي خلايا غير متهوية. ثم أضف وسائط نمو جديدة إلى الآبار. أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الأنسجة وقم بإجراء تغييرات في الوسائط كل 48 ساعة.

هنا تم بلمرة PEG المقيد للخلية كغشاء رقيق باستخدام نمط اختبار للالتصاق بشكل انتقائي بالخلايا المنفصلة بالغشاء المطلي بالكولاجين من الدعامات القابلة للنفاذ. تم تصنيف الخلايا بعد 48 ساعة من الحضانة. تظهر الخلايا الحية المسماة بعلامة calc am باللون الأخضر بينما يتم تصنيف الخلايا الميتة ب atherium homodimer one وتظهر باللون الأحمر.

يمكن ملاحظة أن الحد الأدنى من الخلية يحدث في المنطقة التي تحتوي على غشاء PEG الرقيق. هذا مثال على نتيجة غير مرغوب فيها. أدت البلمرة الجزئية ل PEG إلى جعل بناء الوتد غير القابل للاستخدام.

يمكن أن تحدث البلمرة غير السليمة بسبب وجود الغضروف المفصلي في وسط ما قبل البوليمر ، أو كميات غير كافية من البلمرة ، أو التعرض للأشعة فوق البنفسجية المتوسطة أو غير الكافية أو التركيز غير السليم للبصريات. هذا مثال على تغليف الهيدروجيل المزدوج ثلاثي الأبعاد الضعيف لثقافة نبات A-D-R-G-X. في هذه الصورة ، يمكن ملاحظة أن الخلايا العصبية المرئية باللون الأخضر كانت قادرة على النمو خارج قنوات الوتد المزخرفة.

يحدث هذا غالبا إذا فاضت المصفوفة النقية فوق جزء PEG أثناء الحقن. باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق قياسية أخرى مثل لقط الرقعة أو الكيمياء المناعية للإجابة على أسئلة إضافية مثل الفيزيولوجيا الكهربية أو التعبير الظاهري.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الطباعة الحجرية الضوئية لإسقاط القناع الديناميكي لتحديد العرض الهندسي لأنظمة الهيدروجيل المفردة أو المزدوجة لدراسة مزارع الخلايا العصبية.