تلفيق Micropatterned الهلاميات المائية لأنظمة الثقافة العصبية الديناميكية باستخدام الطباعة التصويرية إسقاط القناع

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام زراعة خلايا بنمط دقيق وهيدروجيل مزدوج للدراسات العصبية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة غرسات نسيجية، مثل العقد الجذرية الظهرية الجنينية، على أدراج زراعة خلايا نفاذة. بعد ذلك، يتم إنشاء نمط دقيق في هيدروجيل قابل للربط التشابكي الضوئي باستخدام جهاز مرآة دقيق رقمي أو DMD كقناع ضوئي ديناميكي.

يتبع ذلك إضافة الهيدروجيل ذاتي التجميع النقي، والذي قد يحتوي على معلق من الخلايا المفككة. ومن الضروري توفير وقت تحضين مناسب قبل إجراء التحليل الخلوي. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح حيوية الخلايا العصبية ونمو الاستطالات العصبية من خلال تكوينات هندسية محددة يحددها جهاز DMD.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية إنشاء كتلة ضوئية ديناميكية وتعديلها وعرضها بسرعة من مسافة بعيدة لتلائم أي ركيزة تقريبًا، مثل أدوات إدخال زراعة الخلايا النفاذة. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الأنظمة العصبية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على أنظمة أخرى قد تستفيد من قيود هندسية محددة، مثل إشارات الخلايا، أو هجرة الخلايا، أو الاتصال بين الخلايا، أو التخلق الشكلي، على سبيل المثال لا الحصر. يتم تركيب مصابيح الأشعة فوق البنفسجية للوحة DMD، وموجه الضوء، والعدسة الشيئية ذات التكبير 4x جميعًا بشكل رأسي على طاولة عزل الاهتزازات.

يتم وضع مجهر مقلوب أسفل العدسة الشيئية بحيث يمكن تصور ضوء التركيز المنعكس من جهاز DMD من خلال المجهر. لمزيد من التفاصيل حول إعداد جهاز DMD، يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق. أولاً، قم بتجهيز ستة inserts لزراعة الخلايا مطلية بالكولاجين لاستقبال مزارع X explan؛ قم بطلاء جدران inserts زراعة الخلايا بـ rain x، مع الحرص على عدم وضع rain X على الغشاء نفسه.

ثم أضف 1.5 milliliters من وسط aian إلى الحواشات وحضنها طوال الليل عند 37 °C و 5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، وبعد حصاد العقد الجذرية الظهرية الجنينية من جراب الفئران في اليوم الجنيني E 15، يتم زرع ما يصل إلى أربعة DRGs في كل حاشة من الحواشات ذات الستة آبار والمطلية بالكولاجين، ثم تُحضن لمدة ساعتين عند 37 °C و 5% carbon dioxide للسماح لـ DRG بالالتصاق بالغشاء.

بعد فترة الحضن، ستكون العقد الجذرية الظهرية (DRGs) جاهزة للبلمرة الضوئية. يتكون جهاز العاكس الدقيق الرقمي (DMD) من مصفوفة تبلغ 1024 في 768 من المرايا الفردية، والتي تعكس الضوء بشكل انتقائي بناءً على موضع المرآة. في هذا الإجراء، يُستخدم جهاز DMD لتشكيل الضوء فوق البنفسجي على الهيدروجيلات القابلة للربط (photo CROs)، مما يؤدي إلى إنشاء أشكال هندسية محددة من الهيدروجيل بطريقة بسيطة وسريعة.

على الرغم من أن جهاز DMD لدينا هو وحدة قائمة بذاتها، إلا أنه يمكن أيضًا دمجه للاستخدام مع العديد من المجاهر الموجودة. أولاً، استخرج نباتات DRGX من الحاضنة، وقم بشفط جميع السوائل الزائدة من القطعة الملحقة. ثم أضف 500 µL من وسط البلمرة إلى داخل القطعة الملحقة.

انقل الحشوات التي تحتوي على نباتات DRGX إلى شريحة زجاجية ذات خلفية مطفأة وضع الشريحة أسفل جهاز DMD. استخدم برنامج واجهة المستخدم الرسومية الأساسية ALP three لتحميل الصورة باللونين الأبيض والأسود التي ستُستخدم كقناع ضوئي على جهاز DMD. في هذه الحالة، تم اختيار شكل متشعب للسماح بتنفيذ أنظمة توجيه المحاور العصبية باستخدام مجهر مقلوب ومصدر ضوء مرئي DI.

قم بمحاذاة شريحة النسيج مع الموقع المناسب على قناع الصورة باستخدام الضوء المنعكس عن جهاز الـ DMD كدليل. بعد ذلك، استبدل مصدر الضوء المرئي بمصدر ضوء UV. قم بإضاءة وسط البلمرة داخل المزرعة الخلوية.

أدخل العينة حتى يكتمل التشبيك المتقاطع لـ PEG. كرر العملية لكل DRG موجود على الإدراج. بعد ذلك، اغسل كل إدراج ثلاث مرات بمحلول phosphate buffered saline معقم يحتوي على 1% penicillin streptomycin.

أخيراً، أضف 1.5 milliliters من وسط النمو تحت أدوات إدخال المزارع الخلوية واتركها لتتوازن في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 degrees Celsius و5% carbon dioxide لمدة 30 minutes. وخلال فترة الحضانة، قم بمعالجة المصفوفة النقية بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 minutes. ولإذابة الببتيدات، خفف المحلول المورد بتركيز 1% إلى 0.15% في ماء معقم وأضف إليه one microgram per milliliter من اللامينين القابل للذوبان.

بعد مرور 30 دقيقة، أخرج المزارع من الحاضنة وقم بشفط جميع الأوساط الزائدة من الغرسة. بعد ذلك، وأثناء معاينة الفراغ تحت المجهر، قم بشفط الوسط من داخل المنطقة الفارغة في بنية PEG التي تحتوي على DRGX explan، ثم اسحب حوالي 1 µL من محلول المصفوفة النقي داخل الفراغ حول X explan. تأكد من أن المصفوفة النقية لا تفيض خارج فراغ peg.

بعد ذلك، يتم سحب 1.5 milliliters من وسط النمو ونقله أسفل الغرسة (insert)، ثم توضع في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 degrees Celsius و5% carbon dioxide لمدة ساعة واحدة. ولضمان التروية الكاملة بعد هذه المدة، يُستبدل وسط النمو ثم تُعاد المزارع إلى الحاضنة. يتم استبدال وسط النمو كل 48 hours من الزراعة.

تظهر هنا أمثلة لبنى الهيدروجيل المزدوجة التي تحتوي على نباتات DRGX. لقد تم وسم نباتات DRGX بمؤشرات النمو والتكاثر. تظهر بنية PEG المبلمرة باللون الرمادي، بينما تظهر DRG NEURITES الموصومة بـ beta three tubulin باللون الأخضر، وتصبغ صبغة DPI أنوية الخلايا كما يظهر باللون الأزرق.

يلاحظ أن الهجرة الخلوية وامتداد الشبكة يقتصران على المنطقة المسموحة للخلايا في بنية الهيدروجيل المزدوج. يعد التغليف بالهيدروجيل المزدوج مناسباً عند استخدام أي جل ذاتي التجميع مع جل قابل للربط التشابكي ضوئياً. وفي هذه الحالة، يعمل PEG كدعامة هيكلية للعرض الهندسي للجل ذاتي التجميع.

على سبيل المثال، المصفوفة النقية (pure matrix) أو aris. سيعتمد نوع الهلام (gel) واختيار قناع التصوير الضوئي (photo mask) على التطبيق المحدد المطلوب. قم بمعالجة جدران غرسة زراعة الخلايا المصنوعة من البوليستر باستخدام rain X كما تم توضيحه سابقاً.

انقل قطعة الإدراج إلى شريحة مطلية بـ Rain X وضعها تحت جهاز DMD. بعد ذلك، أضف 500 µL من وسط البلمرة إلى قطعة الإدراج. ثم حمّل القناع المناسب على جهاز DMD الخاص بتجربة البقاء هذه.

يُستخدم عرض أسطواني من المصفوفة النقية للمساعدة في تصوير الخلايا. عرّض الجزء الداخلي للأشعة فوق البنفسجية لمدة 55 ثانية لتحفيز ربط الـ peg المتشابك بعد عملية الربط التشابكي. اغسل الفراغ المتكون حديثاً باستخدام DPBS معقم و 1% pen strep.

استخدم ماصة دقيقة أو مسحة قطنية معقمة لإزالة كل السوائل الزائدة من التجويف. يتم تحضير Matrixx النقي عن طريق المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة، ثم التخفيف إلى 0.15% في ماء معقم، مع إضافة 1 µg/mL من اللامينين القابل للذوبان و 10% سكروز. بعد ذلك، يتم تجميع الخلايا المراد استزراعها في صورة كرة عن طريق الطرد المركزي.

قم بسحب الوسط الزرعي من كتلة الخلايا المترسبة تماماً، ثم أعد تعليق الكتلة المترسبة بتركيز يبلغ حوالي 5 × 10³ خلية/مل في محلول pure matrix بتركيز 0.15%. من الضروري سحب جميع أجزاء الوسط الزرعي من كتلة الخلايا المترسبة لأن pure matrix يبدأ في التجميع الذاتي بمجرد ملامسته لمحلول ملحي. بعد ذلك، قم بنقل حوالي 1 µL من خليط خلايا pure matrix المكمل إلى فجوة الوتد باستخدام الماصة.

عادة ما تكون هذه الكمية كافية لملء الفراغ دون فيض؛ استخدم الماصة لإضافة 1.5 milliliters من وسط النمو أسفل الغرسة. بعد ذلك، ضع الهيدروجيل الثانوي للمصفوفة النقية في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 degrees Celsius و5% carbon dioxide لمدة ساعة واحدة لضمان التجلط التام. بعد انقضاء هذا الوقت، اسحب الوسط وأضف وسطاً جديداً أسفل الغرسة، مع الحرص على عدم إتلاف المصفوفة النقية الضعيفة ميكانيكياً.

أعد المزارع إلى حاضنة زراعة الأنسجة وقم بتغيير الوسط الغذائي كل 48 ساعة من الزراعة. فيما يلي أمثلة على عصبونات DRG حية مغلفة داخل مجموعة متنوعة من بنيات الهيدروجيل المزدوجة. بعد 48 ساعة في وسط النمو، تم وسم الخلايا باستخدام calcium am، وهو واسم للخلايا الحية يظهر باللون الأخضر.

هنا، وبسبب الطبيعة الديناميكية لقناع DMD الضوئي، فإن الهندسة المتاحة للتغليف محدودة فقط بأبعاد ودقة البصريات. يعد التغليف بهيدروجيل واحد مناسباً في الحالات التي يمكن فيها فحص الخلايا داخل هيدروجيل قابل للربط التشابكي ضوئياً بشكل مشابه لزراعة الخلايا في البوليستر. يتم الإدخال باستخدام rain X والوضع تحت جهاز DMD على شريحة مطلية بـ rain X.

كما في السابق، قم بنقل الخلايا المراد استزراعها باستخدام الماصة مباشرة إلى وسط البلمرة بالتركيز المطلوب واخلطها جيداً لضمان التوزيع المتجانس. بعد ذلك، انقل 500 µL من خليط خلايا وسط البلمرة إلى القطعة المضافة (insert). اختر القناع المناسب وقم بتحميله على جهاز DMD، ثم حفز تشابك PEG عن طريق التعريض للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 55 ثانية.

لإجراء دراسات بقاء الخلايا، يُستخدم قناع دائري أساسي لتمثيل أسطوانة؛ اغسل قطعة الإدراج (insert) ثلاث مرات باستخدام DPBS المعقم و 1%pen strep، ثم انقل بواسطة الماصة 1.5 milliliters من وسط النمو أسفل قطعة الإدراج وكمية كافية من وسط النمو فوقها لغمرها بالكامل، ثم تُحضن عند 37 degrees Celsius و 5%carbon dioxide مع تغيير الوسط كل 48 hours. يظهر هنا مثال لخلايا عصبية قشرية مفككة حية مغلفة داخل peg. يتم وسم الخلايا الحية بـ calcium am وتظهر باللون الأخضر، بينما يتم وسم الخلايا الميتة بـ ahy homodimer one وتظهر باللون الأحمر.

يُقصد بالتغليف في PEG أن يكون مجرد مثال، حيث إن PEG لا يمثل بيئة مثالية للخلايا العصبية. ويمثل الشكل الهندسي المختار وسيلة بسيطة لدراسة حيوية الخلايا، ولكن يمكن تكييفه مع مجموعة واسعة من البنى. كما يمكن استخدام الهيدروجيلات ذات الغشاء الرقيق لإنشاء أنماط محددة من الخلايا المقيدة.

مرة أخرى، قم بمعالجة غرسة زراعة الخلايا المصنوعة من البوليستر باستخدام Rain X كما سبق، ثم ضعها على شريحة معالجة بـ Rain X. بعد ذلك، قم بنقل 250 إلى 300 µL من وسط البلمرة بواسطة الماصة إلى قاع غرسة زراعة الخلايا المعالجة. هذا الحجم كافٍ لتغطية قاع الغرسة فقط؛ قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة للسماح للوسط بنفاذ عبر غشاء الغرسة، ثم اسحب الوسط الزائد من الغرسة باستخدام ماصة دقيقة.

بعد ذلك، قم بنقل كمية كافية من الزيت الشفاف للأشعة فوق البنفسجية (UV transparent oil) إلى قاع قطعة الإدراج لتغطية المنطقة بالكامل. قم بحضن قطعة الإدراج في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة، وهي فترة كافية لتشكل الزيت طبقة متميزة فوق وسط البلمرة. أثناء تشبع غشاء قطعة الإدراج، قم بتحميل القناع المناسب على جهاز DMD.

بعد وضع القطعة المدرجة والشريحة أسفل جهاز DMD، يتم تحفيز الربط التشابكي لـ peg عن طريق التعريض للأشعة فوق البنفسجية UV. يتم غسل القطعة المدرجة ثلاث مرات باستخدام DPBS المعقم و1% pen strap، وبعد الغسل، تُنقل القطعة المدرجة إلى طبق زراعة أنسجة مكون من ستة آبار لحصاد وترسيب الخلايا المراد زراعتها. يتم سحب الوسط الغذائي وإعادة تعليق كتلة الخلايا المترسبة في وسط نمو بالتركيز المطلوب ما بين 10⁴ و10⁶ خلية لكل milliliter.

بعد ذلك، استخدم الماصة لنقل حجم كافٍ من معلق الخلايا إلى داخل قطعة إدراج زراعة الخلايا للحصول على كثافة الخلايا المطلوبة. أضف كمية كافية من وسط النمو أسفل قطعة الإدراج للحفاظ على حيوية الخلايا بشكل كامل. يتم التحضين عند 37 درجة Celsius و 5% carbon dioxide لمدة 48 ساعة من التحضين.

اغسل insert ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم و1% pen strep للتخلص من أي خلايا غير ملتصقة. ثم أضف وسط نمو جديداً إلى الآبار. أعد الطبق إلى حاضنة زراعة الأنسجة وقم بتغيير الوسط كل 48 ساعة.

هنا، تمت بلمرة PEG المقيد للخلايا كغشاء رقيق باستخدام نمط اختبار لإلصاق الخلايا المفككة بشكل انتقائي بغشاء مطلي بالكولاجين في دعامات نفاذة. تم وسم الخلايا بعد 48 ساعة من الحضن. تظهر الخلايا الحية الموسومة بـ calc am باللون الأخضر، بينما تظهر الخلايا الميتة الموسومة بـ atherium homodimer one باللون الأحمر.

يمكن ملاحظة حدوث حد أدنى من التصاق الخلايا في المنطقة التي تحتوي على غشاء PEG الرقيق. يُعد هذا مثالاً على نتيجة غير مرغوب فيها؛ حيث أدى البلمرة الجزئية لـ PEG إلى تكوين بنية PEG غير قابلة للاستخدام.

قد يحدث بلمرة غير صحيحة نتيجة وجود سطح مقعر في وسط ما قبل البلمرة، أو استخدام كميات غير كافية من وسط البلمرة، أو التعرض غير الكافي للأشعة فوق البنفسجية UV، أو عدم ضبط تركيز البصريات بشكل صحيح. هذا مثال على تغليف ثلاثي الأبعاد رديء باستخدام هيدروجيل مزدوج لمزرعة نباتية من A-D-R-G-X. يظهر في هذه الصورة أن الزوائد العصبية المرئية باللون الأخضر تمكنت من النمو خارج قنوات الأوتاد المنقوشة.

يحدث هذا غالباً إذا فاضت المصفوفة النقية فوق جزء PEG أثناء الحقن. باتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق قياسية أخرى مثل تثبيت الرقعة (patch clamping) أو الكيمياء النسيجية المناعية للإجابة على أسئلة إضافية مثل الفيزيولوجيا الكهربائية أو التعبير المظهري.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التصوير الضوئي بإسقاط القناع الديناميكي لتحديد التشكيل الهندسي لأنظمة الهيدروجيل الأحادية أو المزدوجة لدراسة مستنبتات الخلايا العصبية.