Name: الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 45 s
Description: تعلم تقنية الغربية التنشيف باستخدام نظام NuPAGE لتحليل التعبير البروتيني في الخلايا المُحوّلة. يوضح هذا البروتوكول خطوات التحميل والنقل والكشف المناعي للحصول على نتائج قابلة للتكرار.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة هيويت E. جورج الزمالة (CNN).

هلام الكهربائي الملاحظة الفنية : قبل بدء هذا الإجراء ، وعينات من البروتين الخاص بك جاهزة. خلال هذه الخطوة الأولى ، يتم فصل البروتينات في العينة وفقا لوزنها الجزيئي باستخدام تغيير طبيعة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE). نموذج NuPAGE LDS ® الاحتياطي محملة دوديسيل سلفات ليثيوم (LDS) يحتفظ البروتينية في حالة التشويه والتحريف بمجرد تسخين عينة البروتين على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يستخدم عامل قوي في تخفيف بالتزامن لإزالة هيكل الثانوي والجامعي (DTT ، لكسر السندات ثاني كبريتيد). بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت مغطاة البروتينات في عينة LDS سالبة الشحنة وبالتالي التحرك من خلال شبكة من هلام الأكريلاميد نحو القطب موجبة الشحنة. يسمح هذا الفصل وفقا للوزن الجزيئي (كيلو دالتون تقاس ، كيلو دالتون). ويمكن العثور مفصلة خطوة بخطوة لإعداد البروتوكولات العينة وإجراء PAGE على موقع Invitrogen 2 ، أو في دليل تقني NuPAGE 3 نصائح تقنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في NuPAGE Invitrogen مكرر تريس نظام discontinous العازلة ، والتنقل الكهربي للبروتينات ونطاق الفصل اللاحق للجيل يعتمد على عاملين اثنين : أ) تركيز acrylamid من هلام (مع تركيز أكبر الأكريلاميد يؤدي إلى تحسين دقة أقل الوزن الجزيئي البروتينات) والثاني) وايون زائدة من المنطقة العازلة على التوالي ، أو اجتماعات الأطراف زارة التربية والعلم. لاختيار التشكيلة المناسبة لنطاق الفصل الذي ترغب في تحقيقه ، تشير إلى التخطيط للهجرة جل 1. فإن سمك هلام وعدد الآبار تعتمد على حجم وكمية من العينات التي كنت تخطط لتحميل ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تحميل العينات في آبار الخاص للهلام ، ويتم حجز ما لا يقل عن مسار واحد للعلامة الوزن الجزيئي (أو سلم). هذه المعايير بروتين متاحة تجاريا من عدة شركات وعادة ما تتألف من مزيج من البروتينات ذات الأوزان الجزيئية ملطخة محددة ، وذلك لتشكيل فرق مرئية تسمح لك لمتابعة تقدم عملية الترحيل. اختيار مجموعة من الأوزان الجزيئية والتي تتوافق مع قرار الجل الخاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق نمط الهجرة لطيفة وحتى ونحن نوصي جميع الآبار التحميل من الجل الخاص مع حجم مماثل من عينة أو نموذج LDS 1X العازلة. </li></ol> نقل ملاحظة فنية : قبل الشروع في خطوة نقل ، نقل اعداد العازلة (1X مع الميثانول 10 ٪) وقبل بارد إلى 4 درجات مئوية في غرفة باردة. من أجل جعل الوصول إلى الكشف عن البروتينات الأجسام المضادة ، يتم نقلهم بواسطة electroblotting من الجل على غشاء النيتروسليلوز. ويستند ملزمة البروتين على التفاعلات مسعور ، فضلا عن التفاعلات بين تهمة الغشاء والبروتين. (ويمكن أيضا البولي فينيل فلوريد (PVDF) غشاء تستعمل كبديل. وفي هذه الحالة ، غشاء PVDF يجب أن يكون قبل الرطب في الميثانول 30 ثانية على الأقل قبل الاستخدام.) ويمكن الاطلاع على مفصلة خطوة بخطوة الإجراء بروتوكول نقل في اشارة 4 إذا كنت تستخدم بيو راد البسيطة العابرة لطخة خلية نقل الكهربي ، أو في الإشارات 2-3 إذا تم تجهيز المختبر الخاص مع XCell الثاني في Invitrogen ل™ لطخة وحدة نمطية. نتيجة لهذه العملية ، ويتعرض البروتينات على سطح طبقة رقيقة وعلى استعداد للكشف. يمكن التحقق من فعالية والتوحيد الشامل للنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء بواسطة لتلطيخ الشقائقية عكسها غشاء صباغة. الشقائقية S تلطيخ الداخلي (اختياري) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل البروتينات ، مكان الغشاء في علبة الحضانة (البروتينات التي تواجه متابعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يكفي من تلطيخ الشقائقية S لتغطية الغشاء واحتضان ما لا يقل عن 30 ثانية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الغشاء بالماء المقطر حتى خلفية واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يزيل اللون الغشاء مع تشغيل الماء المقطر لمدة 2-3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الغشاء في محلول الحجب (أنظر أدناه). </li></ol> التقنية النصائح : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوصي العلامات الغشاء الخاص مع قلم رصاص قبل نقل البروتين في النظام للدلالة على الجانب التي تعرض لها كل من البروتينات والتوجه من العينات الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام كلا الشقائقية S تلطيخ وعلامات لخفض الوزن الجزيئي الغشاء بعد لبحث نقل أجزاء مختلفة مع الأجسام المضادة الناتجة </li></ol> مناعي : ملاحظة فنية : يتم توفير هذا الإجراء مناعي كدليل فقط. قد تكون مطلوبة لتحسين كل نملةويمكن الاطلاع على معلومات محددة في معظم اوراق البيانات من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا (مثل العمل التخفيف ، وفترة حضانة ، الخ) ؛ ibody. خلال هذه العملية الأخيرة ، وسوف يتم الكشف عن بروتين هدف معين باستخدام الأجسام المضادة ، وسوف تبدو وكأنها شريط على الفيلم. موقف الفرقة تعتمد على الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف ، في حين أن كثافة الموجات يعتمد على مقدار من البروتين الحاضر الهدف. عادة ، يتم تحقيق ذلك بعد ثلاثة substeps : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حظر : لتجنب التفاعلات غير محددة من الجسم المضاد مع غشاء (وغطت مساحة تزيد على الغشاء بمحلول مخفف من بروتين عامة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقيق : تم الكشف عن بروتين معين الفائدة <a title="الابتدائية الأضداد" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">الأساسي الأضداد</a> . بعد غسل جسم غير منضم الأولية بعيدا ، يتعرض الغشاء إلى الضد مختلفة مرتبطة مراسل <a title="انزيم" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">الانزيم</a> ، <a title="الفجل البيروكسيداز" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">البيروكسيداز الفجل</a> (HRP). ويوجه هذا الجسم المضاد الثانوي ضد جزء أنواع معينة من الأجسام المضادة الأولية (مثل جسم مضاد المضادة للأرنب الثانوية وربط أي جسم الأرانب مصدرها الأساسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف : يتم استخدام عامل chemiluminescent باعتبارها الركيزة التي من شأنها أن luminesce عندما تتعرض للHRP على الضد الثانوية. هذا التفاعل ينتج التلألؤ في مكان وبما يتناسب مع كمية البروتين المصرية. ثم يتم الكشف على ضوء بواسطة الأفلام الفوتوغرافية. </li></ol> ويرد عامة خطوة بخطوة الإجراء أدناه. ويمكن الاطلاع على الإجراءات التفصيلية الأخرى في ECL بلس الغربية دليل الكشف عن التنشيف تعليمات الكواشف 5 أو أكثر في ورقة البيانات المصاحبة للأضداد متاحة تجاريا. فترة حضانة ، التخفيف الأضداد ، ومنع والحلول يغسل يجب أن تكون تجريبيا الأمثل لكل الأجسام المضادة. مناعي الداخلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الربط غير محددة من قبل تفرخ مع حجم ما يكفي من حل PBS الكازين 1 ٪ حجب لتغطية كامل الغشاء. مكان على الكرسي الهزاز على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأساسي الخاص بك (المحددة لهذا البروتين من الفائدة). وينبغي أن تضعف الجسم المضاد الرئيسي في عرقلة الحل. بالنسبة لمعظم الأجسام المضادة ، ويتحقق الربط الكامل الحضانة بعد 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. بدلا من ذلك ، يمكن تنفيذ الخطوة الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لزيادة اشارة الى نسبة الضوضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل (تجاهل أو الاحتفاظ في 4 درجات مئوية إلى -20 درجة مئوية للاستخدام المتكرر) وتغسل بسرعة الغشاء مرة واحدة. ثم 3X10 دقائق مع برنامج تلفزيوني ، 0.05 ٪ توين 20 (PBST) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الضد HRP - يقترن الثانوية المخفف في عرقلة الحل. اختيار الأضداد التي تعترف مفتش جزء من الأنواع حيث تم رفع الأجسام المضادة الأولية. يتم تنفيذ الحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل حل بسرعة ، ويغسل الغشاء مرة واحدة. ثم 3X10 دقيقة مع PBST في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شروع في الكشف عن chemiluminescent وفقا لتعليمات الصانع. نستخدم ECL بلس الغربية الكواشف التنشيف من الرعاية الصحية GE (أنظر المرجع 5 لتعليمات محددة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الغشاء الخاص في التفاف ساران أو الحقيبة ومكان تصوير الإشعاع الذاتي داخل الكاسيت. تأكد من استنزاف أي السائل الزائد وإزالة جميع فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض الفيلم الفوتوغرافي لغشاء في غرفة مظلمة. تبدأ الساعة 1 دقيقة ، والتعرض للضبط وفقا لشدة الإشارة المطلوبة. </li></ol> التقنية النصائح : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتحقق حجب غير محددة وملزمة بوضع الغشاء في محلول مخفف من البروتين. نستخدم عادة الكازين 1 ٪ ، ولكن <a title="ألبومين المصل البقري" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">الأبقار مصل الزلال</a> (BSA ~ 2 ٪) أو منزوع الدسم الحليب الجاف (~ 5 ٪) يمكن استخدامها كبديل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام تريس مخزنة المالحة (TBS) في جميع أنحاء الداخلي بدلا من برنامج تلفزيوني. ونحن نوصي باستخدام TBS إذا كنت تخطط لتحقيق الغشاء الخاص مع الضد phosphospecific. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعمال يتوهج في الظلام ملصق (على سبيل المثال ، في Stratagene Glogos ® II علامات Autorad) استغلالها في الجزء السفلي من شريط تصوير الإشعاع الذاتي سوف تساعدك على محاذاة فيلمك الخاص والأغشية خلال الخطوة التحليل. </li></ol> تحليل الآن بعد أن كنت قد عرضت الفيلم الخاص بك ، فسوف ندرك أنه من الناحية العملية ، وليس كل الغرب تكشف عن البروتين والفرقة واحد لطيفة. Additionaقد تظهر أيضا ل العصابات بسبب الربط غير محدد من الأجسام المضادة في المرحلتين الابتدائية والثانوية. ويمكن تخفيض هذه إشارة الخلفية عن طريق تحسين إجراءات مناعي. بالإضافة إلى ذلك ، سوف عنصر التحكم المناسب (على سبيل المثال ، خلايا untransfected ، سيرنا الخلايا المعالجة ، الخ) تكون مفيدة لتحديد خصوصية الضد الخاص والموقع الدقيق للبروتين الهدف على الغشاء. بعد وضع العلامات على الفيلم موقف العصابات الملطخة البروتين القياسية من الغشاء ، مؤامرة سجل كل من الوزن الجزيئي معايير البروتين (المحور الصادي) ضد الحركة النسبية المقابلة (محور س). الحركة النسبية (RF) هو مصطلح يستخدم لنسبة البروتين المسافة انتقلت من نقطة المنشأ (أعلى من هلام) نسبة إلى المسافة التي تتبع صبغ أو علامة منخفضة الوزن الجزيئي انتقلت (الجبهة هلام) . تحديد خط انحدار المنحنى القياسي في الحصول على قيم الميل والتقاطع ذ. ويقدر وزن جزيئي معروف (حجم) من البروتين تستهدفها وذلك باستخدام الترددات اللاسلكية وتعديل المعادلة التالية : سجل الوزن الجزيئي = (المنحدر) (التنقل أو بعلي من البروتين المستهدفة) + التقاطع y (أنظر المرجع 6 للحصول على تعليمات مفصلة). تؤخذ تقريبية مستوى التعبير عن طريق مقارنة شدة الموجات من البروتين لهذا الهدف من البروتين الهيكلي (على سبيل المثال ، أو تويولين أكتين) أو الجين المنتج التدبير المنزلي مثل GAPDH. هذا يجب أن يسمى &quot;السيطرة تحميل&quot; لن تتغير بين العينات وكشف باستخدام الأجسام المضادة المحددة الأولية. قد تكون صورة لمزيد من التحليل من قبل لتقييم كثافة النسبية لكمية البروتين وتلطيخ قياس النتائج من حيث الكثافة البصرية.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Migration+chart%3A+%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gel Migration chart: .</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf">http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , 
		
 <a target="_blank" href="https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E">https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NuPAGE+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">NuPAGE technical guide.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+Manual%2C+Mini+Trans-Blot+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf">http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf">http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis%2C+GE+Healthcare+Website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure">http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure</a> Forthcoming.</li>
<li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li>
<li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li>
<li>Penna,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , Forthcoming.</li>
</ol>

الإجراء المعروض هنا يستخدم الجل مكرر تريس مع MES تشغيل العازلة كمثال على تغيير طبيعة الصفحة باستخدام الكهربائي Invitrogen Novex NuPAGE النظام. بالإضافة إلى ذلك ، هذا النظام هلام مسبقة الصنع يسمح فصل البروتين تحت تغيير طبيعة أو عدم تغيير طبيعة الظروف ، وكذلك يستوعب مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية (1-200 كيلو دالتون عن المواد الهلامية مكرر تريس إلى 36-400 كيلو دالتون للتريس - خلات المواد الهلامية). اعتمادا على التجربة الخاصة بك ، يمكنك اختيار لمتابعة جزء فقط من هذا الاسلوب الغربي النشاف وصفها هنا واستخ...

الغربية التنشيف باستخدام nupage invitrogen novex مكرر تريس minigels

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

التنشيف الغربي (أو immunoblotting) هو إجراء المختبر القياسية السماح للمحققين للتحقق من التعبير عن بروتين ، وتحديد القيمة النسبية للحاضر البروتين في عينات مختلفة ، وتحليل نتائج التجارب المشتركة مناعي. في هذا الأسلوب ، يتم الكشف عن بروتين الهدف مع الأضداد ابتدائية معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج. ويتحقق وفقا لفصل البروتين الوزن الجزيئي باستخدام تغيير طبيعة SDS - PAGE. بعد نقلها إلى غشاء ، هو بحث البروتين الهدف مع الأضداد ابتدائية معينة والكشف عنها بواسطة لمعان كيميائي. منذ الوصف الأول ، وقد مرت هذه التقنية الغربي النشاف العديد من التحسينات ، بما في ذلك المواد الهلامية مسبقة الصنع ومعدات صديقة للمستخدم. في مختبرنا ، اخترنا لاستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا من نظام Invitrogen. وهو الرقم الهيدروجيني المبتكرة محايدة ، متقطع SDS - PAGE ، مسبقة الصنع مصغرة هلام النظام. هذا النظام يقدم العديد من المزايا التقنية Laemmli التقليدية بما في ذلك : أ) حياة أطول الجرف من المواد الهلامية مسبقة الصنع تتراوح بين 8 أشهر إلى سنة 1 ؛ الثاني) فصل مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية 1-400 كيلو دالتون تبعا لنوع من الجل المستخدمة ؛ والثالث) وزيادة التنوع (مجموعة من نسبة مادة الأكريلاميد ، ونوع من الهلام ، وتركيبة الأيونية للالعازلة على التوالي). الإجراء الموضح في هذه المقالة الفيديو يستخدم نظام مكرر تريس العازلة المتقطعة مع 4-12 ٪ مكرر تريس التدرج المواد الهلامية وزارة التربية والعلم تشغيل العازلة ، وكمثال على كيفية تنفيذ وصمة عار للغرب باستخدام الكهربائي NuPAGE Invitrogen النظام. في المختبر لدينا ، لقد حصلنا على نتائج جيدة وقابلة للتكرار للتطبيقات الحيوية المختلفة باستخدام هذا الأسلوب الغربي النشاف.

هذا المقال يصف التقنية القياسية الغربي النشاف الإجراء باستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا مصغرة جل النظام من Invitrogen.

الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels

تعد تقنية لطخة ويسترن (أو المناعية) إجراءً مخبرياً قياسياً يتيح للباحثين التحقق من تعبير بروتين معين، وتحديد...

مرحباً، اسمي OB Pena. أعمل في مختبر Michael Car في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا. واليوم سأوضح لكم كيفية إجراء تحليل western blot باستخدام نظام new page من شركة individual gene.تعد هذه تقنية أساسية لتحليل تعبير البروتين للتحقق من نتائج تجارب الترسيب. تتضمن تقنيات لطخة ويسترن ثلاث خطوات أساسية، وهي تحميل وتشغيل الهلام، ونقل البروتين من الهلام إلى غشاء نيتروسليلوز، والتحصين المناعي للغشاء. سأستخدم هذه التقنية اليوم لتحليل تعبير بروتين في خلايا مترجمة.لذلك أقوم بتجهيز العينة بحيث تكون عينات البروتين دائماً مذابة في منظم عينات لـ X. يحتوي منظم العينات هذا على صبغة لمساعدتك في تحميل عينتك، وجليسيرول للمساعدة في ترسيب العينة في قاع البئر. كما يحتوي أيضاً على منظم و LDS، وهو منظف سالب الشحنة يكسو البروتين، مما يسمح للبروتينات بالهجرة في المجالات الكهربائية وفقاً للوزن الجزيئي وبغض النظر عن الشحنة.يجب عليك أيضاً إضافة بعض العوامل المختزلة مثل DTT لكسر الروابط ثنائية الكبريتيد. لذا، يتم تسخين العينات لمدة 10 دقائق عند 70 °C لمسخ البروتين تماماً، ثم يتم إجراء عملية طرد مركزي سريعة. والآن سأقوم بتحضير الهلام.لذا نستخدم هلاماً مسبق الصب، لذا نحتاج إلى قطع التغليف، وإخراج الهلام، وإزالة الغشاء الواقي. والآن أنا جاهزة لوضع الهلام في الجهاز. وعندما يكون الهلام في الوضعية الص

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، وصفنا توصيف المجمعات multiprotein (البلدان المتوسطية الشريكة) من الأزرق الأصلي بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (BN - PAGE). في البعد الأول ، يتم فصل lysates الخلوية مدال بواسطة PAGE - BN لتحديد البلدان المتوسطية الشريكة الفردية. في البعد الثاني SDS - PAGE ، وتنقسم البلدان المتوسطية الشريكة من الاهتمام لتحليل من قبل ناخبيهم immunoblotting.

زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي

النشاف الغربي هو أسلوب التحليل المستخدمة للكشف عن بروتينات معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج.

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

بروتوكول لدينا يوضح كيفية صب المواد الهلامية بروتين متعددة في وقت واحد بواسطة Nupage إعادة تدوير أشرطة إينفيتروجن minigel Novex، ومواد غير مكلفة شراؤها في منزل تحسين تخزين. هذه الطريقة اقتصادية ويشمل تبسيط وسيلة لتخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. ويمكن من خلال إعادة استخدام الأشرطة هلام البلاستيك من المواد الهلامية المتاحة تجاريا، ومختبرات المواد الهلامية التي تعمل بروتين متكرر توفير تكاليف كبيرة ويساعد في تحسين البيئة.

صب وتشغيل جل البروتين عن طريق إعادة استخدام شرائط التجاري

يصف هذا الفيديو صفحة متعددة الطبقات لفصل مجمعات البروتين الأصلية عن متجانسات الأنسجة. هذه التقنية عبارة عن مزيج من تقنيات PAGE الأصلية الزرقاء و SDS-PAGE. يمكن وصف المجمعات المنفصلة ودراستها لدورها في عمل الخلية.

Multimer-PAGE لفصل مجمعات البروتين الأصلية: تقنية فصل هجينة تتكون من Blue Native-PAGE و SDS-PAGE لفصل البروتينات متعددة المستويات السليمة عن محللة الأنسجة

سير العمل V3 هو إجراء لطخة الغربية باستخدام المواد الهلامية خالية من وصمة عار. تسمح التكنولوجيا الخالية من البقع للباحثين بتصور جودة فصل البروتين ، والتحقق من كفاءة النقل ، والأهم من ذلك ، التحقق من صحة التغيير في البروتين المثير للاهتمام باستخدام التحديد الكمي الكلي للبروتين كتحكم موثوق به في التحميل.

V3 سير العمل خالية من وصمة عار لمراقبة عملية ومريحة وموثوق بها مجموع البروتين تحميل في النشاف الغربية

هذا البروتوكول يستكشف أحدث التطورات في أداء تحليلات لطخة غربية. هذه التعديلات رواية توظف نظام هلام مكرر تريس مع 35 دقيقة الكهربائي تشغيل الوقت، جافة نظام نقل النشاف 7 دقائق، والأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري والتصوير الذي يولد دقة أعلى، والجودة، والحساسية، وتحسين دقة البيانات الغربية.

أسرع الغربية في المدينة: لمسة عصرية على تحليل كلاسيكي غربي وصمة عار

بروتوكول استخراج البروتين الشائعة باستخدام العازلة اليوريا / ثيوريا / SDS لأنسجة المخ الفئران والإنسان يسمح يفهم المرء من البروتينات عن طريق 2D-DIGE وتوصيف لاحقا من قبل 2DE صغيرة immunoblotting. هذه الطريقة تمكن واحد للحصول على نتائج أكثر استنساخه وموثوق بها من الخزعات الإنسان ونماذج تجريبية.

بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting

سمح تقدم النشاف الغربي باستخدام التألق بالكشف عن التغييرات الطفيفة في تعبير البروتين مما يتيح إجراء تحليلات كمية. نصف هنا منهجية قوية للكشف عن مجموعة من البروتينات عبر مجموعة متنوعة من الأنواع وأنواع الأنسجة. كما يتم توفير استراتيجية للتغلب على المشاكل التقنية الشائعة.

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

هنا نقدم بروتوكولات لتنقية تقارب من المجمعات البروتين وفصلهم من قبل PAGE الأم الزرقاء، تليها البروتين ارتباط التنميط باستخدام التسمية مجانا الكمي مطياف الكتلة. هذه الطريقة مفيدة لحل interactomes إلى مجمعات البروتين متميزة.

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

نقدم هنا بروتوكولا لتحليل تكوين البروتين البروتين الأصلي كبير: البروتين والبروتين: مجمعات الحمض النووي من الاغتصاب البذور الزيتية (نابوس باء) لحاء نضحة باستخدام نهج 3D polyacrylamide هلام التفريد (صفحة) يجمع بين الأزرق أصلي (BN) مع صفحتين يشوه متبوعاً بالهوية الجماعية والمطيافيه.

لحاء Sap أخذ العينات من كرنب نابوس 3D-صفحة من البروتين ومجمعات ريبونوكليوبروتين

بروتوكول لاستجلاء هذه النباتات ثايلاكويد البروتين منظمة معقدة وتكوينها مع الأزرق polyacrylamide الأصلي هلام التفريد (BN-صفحة) وهو وصف 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البروتوكول هو الأمثل التمويل نبات، ولكن يمكن استخدامها للأنواع النباتية الأخرى مع تعديلات طفيفة.

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

تعلم تقنية الغربية التنشيف باستخدام نظام NuPAGE لتحليل التعبير البروتيني في الخلايا المُحوّلة. يوضح هذا البروتوكول خطوات التحميل والنقل والكشف المناعي للحصول على نتائج قابلة للتكرار.

الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels

استكشف المزيد من الفيديوهات